Caracterização de uma nova técnica de cultura de retina organotipípica humana

Resumo

Este estudo tem como objetivo desenvolver um novo modelo de cultura de retina organotípica humana (HORC) que previne comprometer a integridade da retina durante o manuseio da explant. Isso é conseguido através da cultura da retina com o vítreo sobrelada e o pigmento de retina subjacente epitélio-coroide (RPE-choroid) e esclera.

Resumo

Modelos anteriores de cultura de retina organotípica humana (HORC) utilizaram retinas descoladas; no entanto, sem o suporte estrutural conferido pelo pigmento da retina epitélio-coroide (RPE-choroid) e esclera, a integridade da frágil retina pode ser facilmente comprometida. O objetivo deste estudo foi desenvolver um novo modelo HORC que contenha a retina, RPE-choroid e esclera para manter a integridade da retina ao esculpir explants da retina.

Depois de cortar circunferencialmente ao longo do limbus para remover íris e lente, quatro incisões profundas foram feitas para achatar a xícara ocular. Em contraste com os protocolos HORC anteriores, uma trefina foi usada para cortar não apenas a retina, mas também o RPE-coroid e esclera. As explantas de três camadas resultantes foram cultivadas por 72 h. A coloração de hematoxilina e eosina (H&E) foi utilizada para avaliar estruturas anatômicas e as explanações da retina foram ainda caracterizadas pela imunohistoquímica (IHC) para apoptose, integridade celular de Müller e inflamação da retina. Para confirmar a possibilidade de indução da doença, explantas foram expostas a citocinas pró-inflamatórias (Cyt), para imitar a retinopatia diabética (DR). O ensaio de contas magnéticas Luminex foi usado para medir citocinas relacionadas à DR liberadas no meio da cultura.

A coloração de H&E revelou lamellae de retina distinta e núcleos compactos em explantas de retina com o RPE-coroide e esclera subjacentes, enquanto as retinas sem as estruturas subjacentes apresentaram espessura reduzida e perda severa de núcleos. Os resultados do IHC indicaram ausência de apoptose e inflamação da retina, bem como a integridade celular de Müller preservada. Os ensaios luminex mostraram significativamente aumentado a secreção de citocinas pró-inflamatórias associadas à DR em explantas de retina expostas a HG + Cyt em relação aos níveis de linha de base a 24 h.

Desenvolvemos e caracterizamos com sucesso um novo protocolo HORC no qual a integridade da retina foi preservada sem apoptose ou inflamação da retina. Além disso, a secreção induzida de biomarcadores pró-inflamatórios associados à DR ao expor explantas de retina ao HG + Cyt sugere que este modelo poderia ser usado para estudos clinicamente traduzíveis da doença da retina.

Introdução

A retina é uma estrutura ocular altamente especializada responsável por transformar energia leve de entrada em sinais elétricos, que são então processados pelo cérebro para percepção visual. A retina humana contém uma gama dinâmica de tipos celulares, altamente organizada em uma estrutura lamelar única composta por duas camadas sinápticas e três núcleos¹ (Figura 1). A homeostase da retina é sustentada pelas intrincadas conexões entre células neuroretinais, vasos sanguíneos, nervos, tecidos conjuntivos e o RPE¹. Devido à sofisticada anatomia e fisiologia da retina, os mecanismos de muitas doenças da retina ainda permanecem mal compreendidos^2,3,4,5. Para melhor estudar as doenças da retina, foram desenvolvidos modelos HORC^6,7,8,9. Em comparação com estudos em animais e culturas in vitro, os modelos HORC são vantajosos porque mantêm o ambiente celular dinâmico e interações neurovasculares complexas in situ, proporcionando um bom modelo para tradução clínica.

Figura 1: Estruturas oculares posteriores do olho humano. Anterior a posterior, as camadas de retina são: camada de fibra nervosa (NFL), camada de célula de glion (GCL), camada plexiforme interna (IPL), camada nuclear interna (INL), camada plexiforme externa (OPL), camada nuclear externa (ONL), segmento interno do fotoreceptor (IS) e camada externa fotorreceptora (OS). As células dentro da retina incluem células de gânglio (azul), células amacrinas (amarelas), células bipolares (vermelhas), células horizontais (roxas), fotorreceptores de vara (rosa) e fotorreceptores de cone (verde). O vítreo está localizado anterior à retina. O RPE, a membrana de Bruch, coroide e esclera estão localizados posteriormente à retina. Observe que a imagem mostrada é apenas uma representação esquemática da retina e a razão de conectividade celular/retina dentro de cada camada pode não ser indicativa do cenário in vivo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Os protocolos HORC anteriormente caracterizados^6,7,8,9 envolveram a separação da retina do RPE-coroide e esclera subjacentes utilizando uma trefina cirúrgica. No entanto, sem o suporte fornecido por essas estruturas subjacentes, a retina translúcida torna-se frágil, difícil de manusear e ferramentas como fórceps podem facilmente interromper sua integridade. Além disso, isolar a retina na cultura sem o RPE tem sido demonstrada como causa de apoptose de células gânglios e degeneração fotorreceptora^10,11,12. Assim, um protocolo HORC alternativo que minimize a perda da integridade da retina e imite melhor o ambiente in vivo seria útil. Isso é particularmente importante ao estudar mecanismos de doenças da retina, pois lesões físicas durante o manuseio de explant podem introduzir artefatos. Por isso, o objetivo deste estudo foi desenvolver um novo modelo HORC que inclua o RPE-choroid e a esclera, a fim de proteger a integridade da retina durante o manuseio e cultura da explant.

Para atingir esse objetivo, foram extraídas explanações de retina "sanduíche" entre o vítreo residual e o RPE-coroide e esclera subjacentes. Nas explantas do sanduíche, o vítreo pesa para baixo da retina para evitar o descolamento e a dobra da retina, enquanto a esclera resistente e fibrosa atua tanto como um andaime para suporte estrutural quanto um ponto de contato para fórceps. Além disso, modelos animais têm demonstrado que a retenção do RPE na cultura pode prevenir a degeneração da retina e a proliferação gliana, uma resposta das células de Müller a sinais de perigo como hipóxia e inflamação^10,11,12.

Para caracterizar o modelo, foram realizadas explanações de retina sanduíche com Hemaoxilalina e Eosina (H&E) para avaliar estruturas anatômicas e imunohistoquímica (IHC), rotulagem explants com terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labeling (TUNEL, um marcador de célula apoptótica), proteína ácida fibrilar gliana (GFAP, uma inflamação da retina e marcador de ativação celular Müller), e vimentina, um marcador de integridade celular Müller. Para determinar se esse modelo pode ser induzido a desenvolver sinais de doença molecular, as explantas foram expostas à alta glicose (HG) com citocinas pró-inflamatórias (Cyt), interleucina-1β (IL-1β) e fator-α tumoral (TNF-α), ambiente de cultivo que tem sido mostrado para imitar a retinopatia diabética (DR) nos modelos de doenças celulares e animais^13,14,15. Os ensaios luminex foram utilizados no modelo DR para medir citocinas liberadas no meio da cultura.

Protocolo

Os copos oculares de doadores humanos foram obtidos do Banco Nacional de Olhos da Nova Zelândia após a excisão da córnea para transplante e aprovados pelo Comitê de Ética em Saúde e Deficiência do Norte B (NTX/06/19/CPD/AM07).

NOTA: A cultura deve ser feita em um armário de biossegurança classe II para garantir condições de cultura de tecido estéril. Os tecidos devem ser cultivados dentro de 24 horas após a morte para evitar perda significativa de integridade da retina.

Figura 2: Imagens que mostram o procedimento para coleta das explantas de retina do sanduíche. Para a preparação da explantização, use uma tesoura dissecando com uma ponta afiada e uma extremidade contundente, com a extremidade cega voltada para o interior do globo para reduzir os danos teciduais durante a incisão. Use também fórceps com pontas cegas para evitar arranhar os tecidos intraoculares durante o manuseio. Utilizando tesoura cirúrgica, com a extremidade cega voltada para o interior, corte ao longo do limbus para remover a íris e a lente(A-C). O ONH pode ser localizado se olhar diretamente para a obmuto aberta(D). Usando fórceps com pontas cegas, segure a esclera para estabilizar o globo(E). Divida o globo verticalmente em duas metades, fazendo duas incisões profundas em direção ao ONH, mas não corte através do ONH. Repita isso ao longo do meridiano horizontal(G). Aplique asseps contundentes na esclera e abra suavemente o globo em uma forma de trevo(H-K). Use fórceps para manipular cuidadosamente o vítreo para suavizar a retina dobrada, pois o puxão vítreo sobre a retina, mas não toque diretamente na retina(I). Remova o vítreo se estiver causando descolamento ou dobramento da retina (não mostrado na Figura 2, pois o vítreo transparente não é bem capturado nas fotos). Localizar áreas onde a retina é plana e extrair explanações de retina utilizando uma trefina cirúrgica(L). Aplicando fórceps na esclera, transfira cuidadosamente as explantas de retina para o meio de cultura pré-preparada(M,N). Toda a explanta do sanduíche deve afundar até o fundo do poço devido ao seu peso, portanto, cada explanta é submersa no meio(O). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

1. Extração das explantas de retina sanduíche da xícara ocular

1. Remova a íris e a lente.
   1. Coloque a xícara de olho dentro de uma placa de Petri, com a íris e a lente voltadas para cima e a cabeça do nervo óptico (ONH) entrando em contato com a placa de Petri(Figura 2A).
   2. Segure o copo ocular firme no limbus usando fórceps(Figura 2B).
   3. Retire a íris e a lente fazendo pequenos cortes circunferencialmente ao longo da borda externa do limbus(Figura 2A).
   4. Remova a íris e a lente cuidadosamente. Evite perturbar a retina durante a manipulação(Figura 2C).
      NOTA: A lente não cairá no copo ocular, pois está presa, através de fibras de zonule, ao corpo ciliar.
2. Achate o copo dos olhos.
   1. Com o copo ocular ainda sentado ereto, identifique o ONH. Isso é mais fácil com uma fonte de luz branca brilhante(Figura 2D).
   2. Inciso nos quatro quadrantes em direção à ONH (Figura 2E). A placa de Petri pode ser girada para facilitar o manuseio. NÃO corte o ONH.
   3. Espalhe e achate cuidadosamente o copo ocular(Figura 2E).
   4. Aplique os fórceps na esclera em vez da retina para evitar interromper a integridade da retina.
      NOTA: O descolamento e dobramento da retina periférica é inevitável, pois o peso do vítreo transbordante puxará a retina. Nestas áreas, remova o vítreo para evitar maior dobras de retina. Lembre-se de deixar vitreous residuais para estabilizar a retina em cima do RPE-choroid e esclera.
3. Colete explants de retina de sanduíche.
   1. Coloque uma trefina cirúrgica na retina em uma região sem dobras de retina(Figura 2F).
   2. Pressione forte para penetrar na esclera, o que deve gerar um som de rachaduras.
   3. Torça a trefina por 180° para garantir que a esclera tenha sido penetrada totalmente de tal forma que a explanta da retina esteja agora separada do tecido restante.
   4. Aplique as fórceps na esclera e transfira a explanta de retina sanduíche para o meio de cultura(Figura 2G-I).
   5. Obtenha 2-3 explants de retina sanduíche da retina periférica de cada quadrante.
      NOTA: A explanta de retina sanduíche às vezes pode ficar presa na abertura da trefina. Usando fórceps, provoque suavemente uma pequena seção da base da esclera. Isso ocorre mais frequentemente quando a lâmina é cega e pode causar perda da retina (Figura 3A-C).
   6. Use uma nova trefina depois de cortar explantas de retina 1-2 à medida que a lâmina se torna cega facilmente(Figura 3C
      Figura 3:Solução de problemas. Durante o processo de extração, a explanta da retina pode ficar presa na abertura da trefina cirúrgica (A). Provoque suavemente o tecido da base da esclera sem tocar na retina(B). Isso pode acontecer com mais frequência se a trefina cirúrgica for usada para extrair mais de duas explantas de retina, já que a lâmina pode facilmente ficar cega(C). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
4. Cultura as explantas da retina.
   1. Prepare o meio de cultura contendo a mistura de nutrientes Modificou Eagle Medium F-12 (DMEM-F12) e uma mistura de antibióticos e antimícticos de 1x (AA, 100x de estoque).
   2. Antes da extração da explantação, coloque 500 μL de meio nos poços de uma placa de 24 poços e equilibre na incubadora. Isso é importante, pois adicionar o meio depois pode desalojar a retina.
   3. Cultura o sanduíche de retina explanta a 37 °C por até 72 h em uma incubadora umidificada de 5% de CO₂ em médio preparado na etapa 1.4.2.
   4. Para induzir alterações semelhantes a DR, a cultura de explantas de retina em médio contendo DMEM-F12 com uma combinação de 32,5 mM HG com Cyt, TNF-α (10 ng/mL) e IL-1β (10 ng/mL).

2. Incorporação de parafina das explantas de retina sanduíche

1. Conserte as explantas de retina do sanduíche.
   1. Mergulhe as explantas de retina do sanduíche em 10% de formalina por pelo menos 24 h.
   2. Remova a solução de formalina e transfira as explanações de retina do sanduíche suavemente em almofadas de tecido e.
   3. Mergulhe as explantas de retina do sanduíche em 70% de etanol por pelo menos 24 h.
   4. Parafina-embedeça explantes de retina em blocos.
   5. Corte os tecidos de retina embutidos em parafina em seções de 5 μm de espessura usando um microtome e monte em lâminas de vidro. Armazene à temperatura ambiente até a imagem.
2. Desparafinar seções.
   1. Mergulhe as seções em 70% de xileno por 5 minutos.
   2. Mergulhe as seções em 100% xileno por 5 minutos.
   3. Reidratar as seções em 70% de etanol por 5 min.
   4. Reidratar as seções em 100% etanol por 5 minutos.
   5. Lave as seções em água da torneira por 10 minutos.

3. Caracterização usando H&E, IHC e um ensaio Magnético Luminex

1. Protocolo de coloração da H&E
   1. Desparafinar as seções usando a etapa 2.2.
   2. Hidrate as seções na água da torneira por 5 minutos.
   3. Manche as seções na solução de hematoxilina de Gill por 5 minutos.
   4. Lave as seções bem em água da torneira para remover o excesso de manchas.
   5. Diferencie mergulhando as seções duas vezes em 1% de álcool ácido.
   6. Lave as seções rapidamente sob água da torneira.
   7. Manche as seções de azul mergulhando seis vezes em 1% de carbonato de lítio (10 mg/mL).
   8. Lave as seções completamente sob água da torneira por 5 minutos para remover o excesso de mancha azul.
   9. Mergulhe as seções em 1% eosin 10 vezes.
   10. Lave as seções rapidamente sob água da torneira para remover o excesso de manchas.
   11. Desidratar as seções mergulhando-as 10 vezes em 100% de etanol. Faça isso duas vezes.
   12. Mergulhe as seções em 70% de xileno 10 vezes.
   13. Mergulhe as seções em 100% xileno 10 vezes.
   14. Monte com um deslizamento de tampa usando meio de montagem de xileno de poliestireno de poliestireno dibutilalato (DPX).
   15. Tire imagens usando um microscópio leve.
2. Protocolo de rotulagem IHC'
   1. Desparafinar as seções usando a etapa 2.2.
   2. Coloque os slides em uma solução contendo tampão citrato de sódio de 10 mM com 0,05% Tween 20 no pH 6.0 e execute uma recuperação de antígeno em uma panela de pressão automatizada a 121 °C por 2 min.
   3. Lave seções em salina tamponada de fosfato (PBS) por 5 min. Faça isso três vezes.
   4. Bloqueie as seções com PBS contendo 0,1% Triton X-100 e 10% soro de cabra normal por 1 h em temperatura ambiente.
   5. Incubar seções durante a noite a 4 °C com anticorpos primários conjugados a anticorpos secundários (Tabela de Materiais).
   6. Lave seções em PBS por 5 minutos. Faça isso três vezes.
   7. Núcleos de manchas utilizando 4′,6-diamidino-2-fenilôndole (DAPI) por 2 min.
   8. Lave e monte seções usando um reagente anti-desbotado.
   9. Tampas de foca com esmalte.
   10. Tire imagens usando um microscópio de varredura a laser confocal.
3. Ensaio magnético Luminex
   1. Transfira 75 μL de mídia de cada poço para uma placa de fundo de 96-bem-u a 24 e 72 h.
   2. Analise o supernante celular para IL-18, IL-6, IL-8 e fator de crescimento endotelial vascular (VEGF) após 24 e 72 h usando o ensaio de citocina Luminex. Siga as instruções do fabricante para conduzir o ensaio¹⁶.

Resultados

A integridade da retina foi preservada neste modelo HORC. A integridade da retina foi preservada nas explantas de retina de sanduíches cultivados, mas foi perdida na retina cultivada sem estruturas adjacentes. A H&E foi conduzida para examinar a integridade estrutural das explantas de retina de sanduíche seccionada após 72 h na cultura. As explantas de retina do sanduíche mostraram integridade preservada e uma estrutura lamellae distinta de GCL a ONL com núcleos com...

Discussão

HORC é atualmente o modelo mais clinicamente traduzível em pesquisas pré-clínicas de retina. Em comparação com modelos de cultura celular in vitro, o HORC pode representar melhor a anatomia da retina humana in situ, através da retenção dos tipos dinâmicos de células da retina e suas conexões com neurônios, vasculaturas e o ambiente extracelular¹⁹. Em comparação com os modelos animais, o HORC é mais vantajoso no estudo da fisiopatologia e na concepção de tratamentos farmacêuticos...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Disposable Biopsy Punches (5 mm)	Integra York PA Inc., USA	21909-142	Referred as surgical trephines in this article
Human Recombinant IL-1β	Peprotech, USA	200-01B	Working concentration: 10 ng/mL
Human Recombinant  TNF-a	Peprotech, USA	300-01A	Working concentration: 10 ng/mL
DAPI (1 µg/mL)	Sigma Aldrich, Germany	#D9542	Nuclear stain. Working dilution 1:1000
DMEM/F-12, GlutaMAX supplement	Gibco, Thermofisher, Scientific Inc., USA	10565018	Dulbecco’s Modified Eagle Medium nutrient mixture F-12 containing a 1× antibiotics and antimycotics mixture (AA, 100× stock)
Fine Scissors - Sharp-Blunt	Fine Science Tools (F.S.T)	14028-10	Tips: Sharp-Blunt, Cutting Edge: 27mm, Length: 10cm, Alloy/Material: Stainless Steel, Serrated: No, Tip Shape: Straight
Graefe Forceps	Fine Science Tools (F.S.T)	11050-10	Length:10cm, Tip shape: Straight, Tips: Serrated, Tip Width: 0.8mm, Tip Dimensions:0.8 x 0.7mm, Alloy/Materials: Stainless Steel
Mouse monoclonal GFAP-Cy3	Sigma Aldrich, Germany	#C9205	Primary antibody conjugated to Cy3. Working dilution 1:1000.
Mouse monoclonal Vimentin-Cy3	Sigma Aldrich, Germany	#C9080	Primary antibody conjugated to Cy3. Working dilution 1:50.
Rabbit polyclonal TUNEL (In Situ Cell Death Detection Kit, Fluorescein)	Sigma Aldrich, Germany	#11684795910	Primary antibody conjugated to Fluorescein-dUTP. Working dilution 1:10 with enzyme-buffer solution.