In This Article

Summary

To badanie ma na celu opracowanie nowego modelu ludzkiej organotypowej hodowli siatkówki (HORC), który zapobiega naruszeniu integralności siatkówki podczas obchodzenia się z eksplantatem. Osiąga się to poprzez hodowlę siatkówki z leżącym nad nią ciałem szklistym i leżącym pod nim barwnikiem siatkówki: nabłonkiem-naczyniówką (RPE-naczyniówką) i twardówką.

Abstract

Poprzednie modele ludzkiej organotypowej hodowli siatkówki (HORC) wykorzystywały odłączone siatkówki; jednakże, bez wsparcia strukturalnego zapewnianego przez nabłonek nabłonkowy-naczyniówkę (RPE-naczyniówkę) i twardówkę, integralność delikatnej siatkówki może być łatwo naruszona. Celem tego badania było opracowanie nowatorskiego modelu HORC, który zawiera siatkówkę, naczyniówkę RPE i twardówkę w celu utrzymania integralności siatkówki podczas hodowli eksplantatów siatkówki.

Po przecięciu obwodu wzdłuż rąbka w celu usunięcia tęczówki i soczewki, wykonano cztery głębokie nacięcia, aby spłaszczyć muszlę oczną. W przeciwieństwie do poprzednich protokołów HORC, trepanacja została użyta do przecięcia nie tylko siatkówki, ale także naczyniówki i twardówki. Powstałe w ten sposób trójwarstwowe eksplantaty hodowano przez 72 godziny. Barwienie hematoksyliną i eozyną (H&E) zastosowano do oceny struktur anatomicznych, a eksplantaty siatkówki zostały dodatkowo scharakteryzowane za pomocą immunohistochemii (IHC) pod kątem apoptozy, integralności komórek Müllera i zapalenia siatkówki. Aby potwierdzić możliwość indukcji choroby, eksplantaty wystawiono na działanie wysokiego stężenia glukozy (HG) i cytokin prozapalnych (Cyt), naśladujących retinopatię cukrzycową (DR). Test kulek magnetycznych Luminex wykorzystano do pomiaru cytokin związanych z DR uwalnianych do pożywki hodowlanej.

Barwienie H&E ujawniło wyraźne blaszki siatkówki i zwarte jądra w eksplantatach siatkówki z leżącym poniżej RPE-naczyniówką i twardówką, podczas gdy siatkówki bez podstawowych struktur wykazywały zmniejszoną grubość i poważną utratę jąder. Wyniki IHC wykazały brak apoptozy i zapalenia siatkówki, a także zachowaną integralność komórek Müllera. Testy Luminex wykazały znacznie zwiększone wydzielanie cytokin prozapalnych związanych z DR w eksplantatach siatkówki narażonych na HG + Cyt w stosunku do poziomów wyjściowych po 24 godzinach.

Udało nam się opracować i scharakteryzować nowy protokół HORC, w którym integralność siatkówki została zachowana bez apoptozy czy zapalenia siatkówki. Co więcej, indukowane wydzielanie biomarkerów prozapalnych związanych z DR podczas wystawiania eksplantatów siatkówki na HG + Cyt sugeruje, że model ten można wykorzystać do klinicznie przekładalnych badań nad chorobami siatkówki.

Introduction

Siatkówka to wysoce wyspecjalizowana struktura oka odpowiedzialna za przekształcanie przychodzącej energii świetlnej na sygnały elektryczne, które są następnie przetwarzane przez mózg do percepcji wzrokowej. Ludzka siatkówka zawiera dynamiczny zakres typów komórek, wysoce zorganizowanych w unikalną strukturę blaszkową składającą się z dwóch warstw synaptycznych i trzech jąder 1 (Rysunek 1). Homeostaza siatkówki jest podtrzymywana przez skomplikowane połączenia między komórkami neurosiatkówkowymi, naczyniami krwionośnymi, nerwami, tkankami łącznymi i RPE1. Ze względu na wyrafinowaną anatomię i fizjologię siatkówki, mechanizmy wielu chorób siatkówki nadal pozostają słabo poznane2,3,4,5. Aby lepiej badać choroby siatkówki, opracowano modele HORC6,7,8,9. W porównaniu z badaniami na zwierzętach i hodowlami in vitro, modele HORC są korzystne, ponieważ zachowują dynamiczne środowisko komórkowe i złożone interakcje nerwowo-naczyniowe in situ, zapewniając dobry model do translacji klinicznej.

figure-introduction-1
Rysunek 1: Tylne struktury oka ludzkiego. Od przodu do tyłu, warstwy siatkówki to: warstwa włókien nerwowych (NFL), warstwa komórek zwojowych (GCL), wewnętrzna warstwa splotowata (IPL), wewnętrzna warstwa jądrowa (INL), zewnętrzna warstwa splotowata (OPL), zewnętrzna warstwa jądrowa (ONL), wewnętrzny segment fotoreceptora (IS) i zewnętrzna warstwa fotoreceptora (OS). Komórki w siatkówce obejmują komórki zwojowe (niebieskie), komórki amakrynowe (żółte), komórki dwubiegunowe (czerwone), komórki poziome (fioletowe), fotoreceptory pręcikowe (różowe) i fotoreceptory czopków (zielone). Ciało szkliste znajduje się przed siatkówką. RPE, błona Brucha, naczyniówka i twardówka znajdują się za siatkówką. Należy pamiętać, że pokazany obraz jest tylko schematyczną reprezentacją siatkówki, a stosunek komórek/połączeń siatkówki w każdej warstwie może nie wskazywać na ustawienie in vivo. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Wcześniej scharakteryzowane protokoły HORC6,7,8,9 obejmowały oddzielenie siatkówki od leżącego poniżej naczyniówki i twardówki za pomocą chirurgicznej trefiny. Jednak bez wsparcia zapewnianego przez te podstawowe struktury, półprzezroczysta siatkówka staje się cienka, trudna w obsłudze, a narzędzia takie jak kleszcze mogą łatwo zakłócić jej integralność. Ponadto wykazano, że izolowanie siatkówki w hodowli bez RPE powoduje apoptozę komórek zwojowych i degenerację fotoreceptorów10,11,12. W związku z tym przydatny byłby alternatywny protokół HORC, który minimalizuje utratę integralności siatkówki i lepiej naśladuje środowisko in vivo. Jest to szczególnie ważne podczas badania mechanizmów chorób siatkówki, ponieważ obrażenia fizyczne podczas obchodzenia się z eksplantatami mogą wprowadzać artefakty. Dlatego celem tego badania było opracowanie nowego modelu HORC, który obejmuje naczyniówkę RPE i twardówkę w celu ochrony integralności siatkówki podczas obchodzenia się z eksplantatem i hodowli.

Aby osiągnąć ten cel, wyekstrainowane zostały eksplantaty siatkówki "wciśnięte" pomiędzy resztki ciała szklistego a leżący pod nim RPE-naczyniówkę i twardówkę. W eksplantatach kanapkowych ciało szkliste obciąża siatkówkę, aby zapobiec odwarstwieniu i fałdowaniu siatkówki, podczas gdy twarda, włóknista twardówka działa zarówno jako rusztowanie dla wsparcia strukturalnego, jak i punkt kontaktowy dla kleszczy. Co więcej, modele zwierzęce wykazały, że utrzymanie RPE w hodowli może zapobiegać zwyrodnieniu siatkówki i proliferacji glejowej, czyli reakcji komórek Müllera na sygnały zagrożenia, takie jak niedotlenienie i stan zapalny10,11,12.

Aby scharakteryzować model, eksplantaty siatkówki warstwowej zostały wybarwione Hematoksyliną i Eozyną (H&E) w celu oceny struktur anatomicznych i przeprowadzono immunohistochemię (IHC), znakując eksplantaty końcowym znacznikiem deoksynukleotydylotransferazy dUTP (TUNEL, marker komórek apoptotycznych), kwaśnym białkiem fibrylarnym gleju (GFAP, zapalenie siatkówki i marker aktywacji komórek Müllera) oraz wimentyną, marker integralności komórek Müllera. Aby ustalić, czy model ten można skłonić do rozwoju molekularnych objawów choroby, eksplantaty wystawiono na działanie wysokiego poziomu glukozy (HG) z cytokinami prozapalnymi (Cyt), interleukiną-1β (IL-1β) i czynnikiem martwicy nowotworu-α (TNF-α), środowiskiem hodowlanym, które, jak wykazano, naśladuje retinopatię cukrzycową (DR) zarówno w modelach chorób komórkowych, jak i zwierzęcych13, 14,15. Testy Luminex zastosowano w modelu DR do pomiaru cytokin uwalnianych do pożywki hodowlanej.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

Ludzkie miseczki oczne dawcy zostały uzyskane z Narodowego Banku Oczu Nowej Zelandii po wycięciu rogówki do przeszczepu i zatwierdzone przez Komisję Etyki Zdrowia i Niepełnosprawności Northern B (NTX/06/19/CPD/AM07).

UWAGA: Hodowla powinna być wykonana w komorze bezpieczeństwa biologicznego klasy II, aby zapewnić sterylne warunki hodowli tkankowej. Tkanki muszą być hodowane w ciągu 24 godzin po uboju, aby uniknąć znacznej utraty integralności siatkówki.

figure-protocol-1
Rysunek 2: Obrazy przedstawiające procedurę zbierania eksplantatów siatkówki kanapkowej.Do przygotowania eksplantatu użyj nożyczek preparacyjnych z jedną ostrą końcówką i jednym końcem, tak aby koniec był skierowany do wnętrza kuli ziemskiej, aby zmniejszyć uszkodzenie tkanki podczas nacięcia. Używaj również kleszczy z końcami, aby uniknąć drapania tkanek wewnątrzgałkowych podczas przenoszenia. Za pomocą nożyczek chirurgicznych, końcem skierowanym do wewnątrz, przetnij wzdłuż rąbka, aby usunąć tęczówkę i soczewkę (AC). ONH można zlokalizować, patrząc prosto w otwartą muszlę oczną (D). Używając kleszczy z końcówkami, przytrzymaj twardówkę, aby ustabilizować kulę ziemską (E). Podziel kulę ziemską pionowo na dwie połowy, wykonując dwa głębokie nacięcia w kierunku ONH, ale nie przecinaj ONH. Powtórz to wzdłuż południka poziomego (G). Przyłóż kleszcze do twardówki i delikatnie otwórz kulę do kształtu koniczyny (HK). Użyj kleszczy, aby ostrożnie manipulować ciałem szklistym, aby wygładzić złożoną siatkówkę, ponieważ ciało szkliste ciągnie siatkówkę, ale nie dotykaj siatkówki bezpośrednio (I). Usuń ciało szkliste, jeśli powoduje to odwarstwienie lub fałdowanie siatkówki (nie pokazane na Rysunek 2, ponieważ przezroczyste ciało szkliste nie jest dobrze uchwycone na zdjęciach). Zlokalizuj obszary, w których siatkówka jest płaska i wyekstrahuj eksplantaty siatkówki za pomocą chirurgicznej trepanacji (L). Przykładając kleszcze do twardówki, ostrożnie przenieś eksplantaty siatkówki do wcześniej przygotowanej pożywki hodowlanej (M,N). Cały eksplant kanapkowy powinien opadać na dno studzienki ze względu na swój ciężar, dlatego każdy eksplant jest zanurzany w pożywce (O). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

1. Ekstrakcja eksplantatów siatkówki kanapkowej z muszli ocznej

  1. Usuń tęczówkę i obiektyw.
    1. Umieść muszlę oczną wewnątrz szalki Petriego, tak aby tęczówka i soczewka były skierowane do góry, a głowa nerwu wzrokowego (ONH) stykała się z szalką Petriego (Rysunek 2A).
    2. Przytrzymaj muszlę oczną stabilnie na rąbku za pomocą kleszczy (Rysunek 2B).
    3. Odłącz tęczówkę i soczewkę, wykonując małe nacięcia wzdłuż zewnętrznej krawędzi rąbka (Rysunek 2A).
    4. Ostrożnie usuń przysłonę i obiektyw. Unikaj naruszania siatkówki podczas manipulacji (Rysunek 2C).
      UWAGA: Soczewka nie wpadnie do muszli ocznej, ponieważ jest przymocowana za pomocą włókien zonulowych do ciała rzęskowego.
  2. Spłaszcz muszlę oczną.
    1. Gdy muszla oczna nadal znajduje się w pozycji pionowej, zidentyfikuj ONH. Jest to łatwiejsze dzięki jasnemu, białemu źródłu światła (Rysunek 2D).
    2. Naciąć w czterech kwadrantach w kierunku ONH (Rysunek 2E). Szalkę Petriego można obracać w celu łatwiejszej obsługi. NIE przecinaj ONH.
    3. Ostrożnie rozłóż i spłaszcz muszlę oczną (Rysunek 2E).
    4. Przyłóż kleszcze do twardówki zamiast do siatkówki, aby uniknąć naruszenia integralności siatkówki.
      UWAGA: Obwodowe odwarstwienie i fałdowanie siatkówki jest nieuniknione, ponieważ ciężar przepełnionego ciała szklistego będzie ciągnął siatkówkę. W tych obszarach usuń ciało szkliste, aby zapobiec dalszemu fałdowi siatkówki. Pamiętaj, aby pozostawić resztki ciała szklistego, aby ustabilizować siatkówkę na wierzchu naczyniówki i twardówki.
  3. Zbierz eksplantaty siatkówki kanapkowej.
    1. Umieść chirurgiczną trepanację na siatkówce w obszarze bez fałdów siatkówki (Ryc. 2F).
    2. Naciśnij mocno, aby przebić twardówkę, która powinna generować dźwięk trzaskania.
    3. Przekręć trepanację o 180°, aby upewnić się, że twardówka została całkowicie przeniknięta, tak że eksplant siatkówki jest teraz oddzielony od pozostałej tkanki.
    4. Przyłóż kleszcze do twardówki i przenieś eksplant siatkówki kanapkowej do pożywki hodowlanej (Rysunek 2G-I).
    5. Uzyskaj 2-3 eksplantaty siatkówki kanapkowej z siatkówki obwodowej każdego kwadrantu.
      UWAGA: Eksplant siatkówki kanapkowej może czasami zostać uwięziony w otworze trefiny. Za pomocą kleszczy delikatnie wyłuskaj niewielką część podstawy twardówki. Zdarza się to częściej, gdy ostrze jest i może powodować utratę siatkówki (Rysunek 3A-C).
    6. Użyj nowej trepanacji po wycięciu 1-2 eksplantatów siatkówki, ponieważ ostrze łatwo się (Rysunek 3Cfigure-protocol-2
      Rysunek 3: Rozwiązywanie problemów.Podczas procesu ekstrakcji eksplant siatkówki może zostać uwięziony przy otworze chirurgicznej trepanacji (A). Delikatnie wyłuskaj tkankę od podstawy twardówki, nie dotykając siatkówki (B). Może się to zdarzyć częściej, jeśli chirurgiczna trepanacja jest używana do ekstrakcji więcej niż dwóch eksplantatów siatkówki, ponieważ ostrze może łatwo stać się (C). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.
  4. Hodowla eksplantatów siatkówki.
    1. Przygotuj pożywkę zawierającą zmodyfikowaną mieszankę składników odżywczych Eagle Medium F-12 firmy Dulbecco (DMEM-F12) oraz 1x mieszaninę antybiotyków i środków przeciwgrzybiczych (AA, 100x zapas).
    2. Przed ekstrakcją eksplantatem umieścić 500 μl pożywki w dołkach na 24-dołkowej płytce i zrównoważyć w inkubatorze. Jest to ważne, ponieważ późniejsze dodanie pożywki może spowodować przemieszczenie siatkówki.
    3. Hodować eksplantaty siatkówki kanapkowej w temperaturze 37 °C przez okres do 72 godzin w nawilżonym inkubatorze z 5%CO2 w pożywce przygotowanej w kroku 1.4.2.
    4. Aby wywołać zmiany podobne do DR, hoduj eksplantaty siatkówki w pożywce zawierającej DMEM-F12 w połączeniu 32,5 mM HG z Cyt, TNF-α (10 ng / ml) i IL-1β (10 ng / ml).

2. Osadzanie parafiny w eksplantatach siatkówki kanapkowej

  1. Napraw eksplantaty siatkówki kanapkowej.
    1. Zanurz eksplantaty siatkówki kanapkowej w 10% formalinie na co najmniej 24 godziny.
    2. Usuń roztwór formaliny i delikatnie przenieś eksplantaty siatkówki kanapkowej do wkładek higienicznych i kaset.
    3. Namocz eksplantaty siatkówki kanapkowej w 70% etanolu przez co najmniej 24 godziny.
    4. Eksplantaty siatkówki zatopione w parafinie w blokach.
    5. Pociąć tkanki siatkówki zatopione w parafinie na odcinki o grubości 5 μm za pomocą mikrotomu i zamontować na szkiełkach podstawowych. Przechowywać w temperaturze pokojowej do czasu wykonania obrazowania.
  2. Sekcje odparafinowane.
    1. Zanurz sekcje w 70% ksylenie na 5 minut.
    2. Zanurz sekcje w 100% ksylenie na 5 minut.
    3. Uwodnić sekcje w 70% etanolu przez 5 minut.
    4. Uwodnij sekcje w 100% etanolu przez 5 minut.
    5. Umyj sekcje pod bieżącą wodą z kranu przez 10 minut.

3. Charakterystyka za pomocą H&E, IHC i testu Magnetic Luminex

  1. Protokół barwienia H&E
    1. Odparafinować sekcje za pomocą kroku 2.2.
    2. Nawilżaj sekcje w wodzie z kranu przez 5 minut.
    3. Barwić skrawki w roztworze 2 hematoksyliny Gilla przez 5 minut.
    4. Dokładnie umyj sekcje pod bieżącą bieżącą wodą z kranu, aby usunąć nadmiar plam.
    5. Rozróżnić, zanurzając sekcje dwukrotnie w 1% kwaśnym alkoholu.
    6. Szybko umyj sekcje pod bieżącą wodą z kranu.
    7. Zabarwić skrawki na niebiesko, zanurzając sześciokrotnie w 1% węglanu litu (10 mg/ml).
    8. Dokładnie umyj sekcje pod bieżącą wodą z kranu przez 5 minut, aby usunąć nadmiar niebieskiej plamy.
    9. Zanurz sekcje w 1% eozynie 10 razy.
    10. Szybko umyj sekcje pod bieżącą wodą, aby usunąć nadmiar plam.
    11. Odwodnić sekcje, zanurzając je 10 razy w 100% etanolu. Zrób to dwa razy.
    12. Zanurz sekcje w 70% ksylenie 10 razy.
    13. Zanurz sekcje w 100% ksylenie 10 razy.
    14. Mocować za pomocą szkiełka nakrywkowego za pomocą materiału montażowego z polistyrenu polistyrenowego dibutylu (DPX).
    15. Rób zdjęcia za pomocą mikroskopu świetlnego.
  2. Protokół etykietowania IHC"
    1. Odparafinować sekcje za pomocą kroku 2.2.
    2. Umieścić szkiełka w roztworze zawierającym 10 mM buforu cytrynianu sodu z 0,05% Tween 20 o pH 6,0 i uruchomić pobieranie antygenu w szybkowarze automatycznym w temperaturze 121 °C przez 2 minuty.
    3. Przemyć skrawki soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) przez 5 min. Zrób to 3 razy.
    4. Zablokuj skrawki PBS zawierającym 0,1% Triton X-100 i 10% normalnej surowicy koziej przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
    5. Inkubować skrawki przez noc w temperaturze 4 °C z przeciwciałami pierwszorzędowymi sprzężonymi z przeciwciałami drugorzędowymi (tabela materiałów).
    6. Myć sekcje w PBS przez 5 min. Zrób to 3 razy.
    7. Wybarwić jądra za pomocą 4′,6-diamidino-2-fenyloindolu (DAPI) przez 2 min.
    8. Umyj i zamontuj sekcje za pomocą odczynnika zapobiegającego blaknięciu.
    9. Uszczelnij szkiełka nakrywkowe lakierem do paznokci.
    10. Rób zdjęcia za pomocą konfokalnego laserowego mikroskopu skaningowego.
  3. Test magnetyczny Luminex
    1. Przenieść 75 μl pożywki z każdej studzienki na 96-dołkową płytkę dolną w kształcie litery U po 24 i 72 godzinach.
    2. Przeanalizować supernatant komórek pod kątem IL-18, IL-6, IL-8 i czynnika wzrostu śródbłonka naczyniowego (VEGF) po 24 i 72 godzinach za pomocą testu cytokin Luminex. Postępuj zgodnie z instrukcjami producenta, aby przeprowadzić test16.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

Integralność siatkówki została zachowana w tym modelu HORC. Integralność siatkówki została zachowana w hodowanych eksplantatach siatkówki kanapkowej, ale została utracona w siatkówce hodowanej bez sąsiednich struktur. Badanie H&E przeprowadzono w celu zbadania integralności strukturalnej podzielonych eksplantatów siatkówki kanapkowej po 72 godzinach w hodowli. Eksplantaty siatkówki kanapkowej wykazały zachowaną integralność i wyraźną strukturę blasz...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

HORC jest obecnie najbardziej przekładalnym klinicznie modelem w badaniach przedklinicznych siatkówki. W porównaniu z modelami hodowli komórkowych in vitro, HORC może lepiej reprezentować anatomię ludzkiej siatkówki in situ, poprzez zachowanie dynamicznych typów komórek siatkówki i ich połączeń z neuronami, naczyniami krwionośnymi i środowiskiem zewnątrzkomórkowym19. W porównaniu z modelami zwierzęcymi, HORC są bardziej korzystne w badaniu patofizjologii i projektowaniu leczen...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Acknowledgements

Autorzy chcieliby podziękować hojnym darczyńcom tkanek oka oraz zespołowi z Narodowego Banku Oczu Nowej Zelandii za ich wsparcie. Prace te zostały wsparte finansowo przez granty projektowe z Maurice and Phyllis Paykel Trust oraz Auckland Medical Research Foundation (1117015). Kierownictwo IDR jest wspierane przez Fundację Charytatywną Buchanan. Stypendium CK jest zapewniane przez Nowozelandzkie Stowarzyszenie Optometrystów Fundusz Edukacyjny i Badawczy (CC36812), a stypendium HHL jest zapewniane przez Fundację Charytatywną Buchanan.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Jednorazowe stemple do biopsji (5 mm)Integra York PA Inc., USA21909-142Określane jako trefiny chirurgiczne
w tym artykule
Ludzka rekombinowana IL-1 i beta;Peprotech, USA200-01BStężenie robocze: 10 ng/ml
rekombinowany ludzki  TNF-aPeprotech, USA300-01AStężenie robocze: 10 ng/ml
DAPI (1 &mikro; g/mL)Sigma Aldrich, Niemcy#D9542Plama jądrowa. Rozcieńczenie robocze 1:1000
DMEM/F-12, suplement GlutaMAXGibco, Thermofisher, Scientific Inc., USA10565018Dulbecco" s Zmodyfikowana mieszanka składników odżywczych Eagle Medium F-12 zawierająca 1&razy; mieszanina antybiotyków i leków przeciwgrzybiczych (AA, 100 i razy; zapas)
Drobne nożyczki - ostre-narzędzia do nauki (FST)14028-10Końcówki: ostre-, krawędź tnąca: 27mm, długość: 10cm, stop / materiał: stal nierdzewna, ząbkowana: nie, kształt końcówki: prosta
Kleszcze GraefeNarzędzia do nauki precyzyjnej (FST)11050-10Długość: 10 cm, Kształt końcówki: Prosty, Końcówki: Ząbkowane, Szerokość końcówki: 0,8 mm, Wymiary końcówki: 0,8 x 0,7 mm, Stop / Materiały:
Monoklonalny mysz ze stali nierdzewnej GFAP-Cy3Sigma Aldrich, Niemcy#C9205Przeciwciało pierwszorzędowe sprzężone z Cy3. Rozcieńczenie robocze 1:1000.
Mysi monoklonalny Vimentin-Cy3Sigma Aldrich, Niemcy#C9080Pierwszorzędowe przeciwciało sprzężone z Cy3. Rozcieńczenie robocze 1:50.
Królicze poliklonalne TUNEL (zestaw do wykrywania śmierci komórki in situ, fluoresceina)Sigma Aldrich, Niemcy#11684795910Przeciwciało pierwszorzędowe sprzężone z fluoresceiną-dUTP. Rozcieńczenie robocze 1:10 roztworem buforu enzymatycznego.

References

  1. Kolb, H., Fernandez, E., Nelson, R. Facts and Figures Concerning the Human Retina. Webvision-The Organization of the Retina and Visual System. , Internet (2005).
  2. Gemenetzi, M., De Salvo, G., Lotery, A. Central serous chorioretinopathy: an update on pathogenesis and treatment. Eye. 24 (12), 1743-1756 (2010).
  3. Buschini, E., Piras, A., Nuzzi, R., Vercelli, A. Age related macular degeneration and drusen: neuroinflammation in the retina. Progress in Neurobiology. 95 (1), 14-25 (2011).
  4. Chen, S. -Y., et al. Current concepts regarding developmental mechanisms in diabetic retinopathy in Taiwan. Biomedicine. 6 (2), (2016).
  5. Kaaja, R., Loukovaara, S. Progression of retinopathy in type 1 diabetic women during pregnancy. Current Diabetes Reviews. 3 (2), 85-93 (2007).
  6. Azizzadeh Pormehr, L., et al. Human organotypic retinal flat-mount culture (HORFC) as a model for retinitis pigmentosa11. Journal of Cellular Biochemistry. 119 (8), 6775-6783 (2018).
  7. Fernandez-Bueno, I., et al. Time course modifications in organotypic culture of human neuroretina. Experimental Eye Research. 104, 26-38 (2012).
  8. Niyadurupola, N., Sidaway, P., Osborne, A., Broadway, D. C., Sanderson, J. The development of human organotypic retinal cultures (HORCs) to study retinal neurodegeneration. British Journal of Ophthalmology. 95 (5), 720-726 (2011).
  9. Osborne, A., Hopes, M., Wright, P., Broadway, D. C., Sanderson, J. Human organotypic retinal cultures (HORCs) as a chronic experimental model for investigation of retinal ganglion cell degeneration. Experimental Eye Research. 143, 28-38 (2016).
  10. Caffe, A., Visser, H., Jansen, H., Sanyal, S. Histotypic differentiation of neonatal mouse retina in organ culture. Current Eye Research. 8 (10), 1083-1092 (1989).
  11. Kaempf, S., Walter, P., Salz, A. K., Thumann, G. Novel organotypic culture model of adult mammalian neurosensory retina in co-culture with retinal pigment epithelium. Journal of Neuroscience Methods. 173 (1), 47-58 (2008).
  12. Liu, L., Cheng, S. -H., Jiang, L. -Z., Hansmann, G., Layer, P. G. The pigmented epithelium sustains cell growth and tissue differentiation of chicken retinal explants in vitro. Experimental Eye Research. 46 (5), 801-812 (1988).
  13. Kuo, C., Green, C. R., Rupenthal, I. D., Mugisho, O. O. Connexin43 hemichannel block protects against retinal pigment epithelial cell barrier breakdown. Acta Diabetologica. 57 (1), 13-22 (2020).
  14. Mugisho, O. O., et al. The inflammasome pathway is amplified and perpetuated in an autocrine manner through connexin43 hemichannel mediated ATP release. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-General Subjects. 1862 (3), 385-393 (2018).
  15. Mugisho, O. O., et al. Intravitreal pro-inflammatory cytokines in non-obese diabetic mice: Modelling signs of diabetic retinopathy. PLoS ONE. 13 (8), 0202156(2018).
  16. R&D Systems, I. , Available from: https://www.rndsystems.com/protocol-types/luminex (2020).
  17. Nakazawa, T., et al. Attenuated glial reactions and photoreceptor degeneration after retinal detachment in mice deficient in glial fibrillary acidic protein and vimentin. Investigative Ophthalmology, Visual Science. 48 (6), 2760-2768 (2007).
  18. Okada, M., Matsumura, M., Ogino, N., Honda, Y. Müller cells in detached human retina express glial fibrillary acidic protein and vimentin. Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 228 (5), 467-474 (1990).
  19. Murali, A., Ramlogan-Steel, C. A., Andrzejewski, S., Steel, J. C., Layton, C. J. Retinal explant culture: A platform to investigate human neuro-retina. Clinical & Experimental Ophthalmology. 47 (2), 274-285 (2019).
  20. Koleva-Georgieva, D. N., Sivkova, N. P., Terzieva, D. Serum inflammatory cytokines IL-1beta, IL-6, TNF-alpha and VEGF have influence on the development of diabetic retinopathy. Folia Medica (Plovdiv). 53 (2), 44-50 (2011).
  21. Lee, J. -H., et al. Cytokine profile of peripheral blood in type 2 diabetes mellitus patients with diabetic retinopathy. Annals of Clinical & Laboratory Science. 38 (4), 361-367 (2008).
  22. Chorostowska-Wynimko, J., et al. In vitro angiomodulatory activity of sera from type 2 diabetic patients with background retinopathy. Journal of Physiology and Pharmacology: An Official Journal of the Polish Physiological Society. 56, 65-70 (2005).
  23. Khalifa, R. A., Khalef, N., Moemen, L. A., Labib, H. M. The role interleukin 12 (IL-12), interferon-inducible protein 10 (IP-10) and Interleukin 18 (IL-18) in the angiogenic activity of diabetic retinopathy. Research Journal of Medicine and Medical Sciences. 4, 510-514 (2009).
  24. Zhou, J., Wang, S., Xia, X. Role of intravitreal inflammatory cytokines and angiogenic factors in proliferative diabetic retinopathy. Current Eye Research. 37 (5), 416-420 (2012).
  25. Song, Z., et al. Increased intravitreous interleukin-18 correlated to vascular endothelial growth factor in patients with active proliferative diabetic retinopathy. Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 252 (8), 1229-1234 (2014).
  26. Louie, H. H., Shome, A., Kuo, C. Y. J., Rupenthal, I. D., Green, C. R., Mugisho, O. O. Connexin43 hemichannel block inhibits NLRP3 inflammasome activation in a human retinal explant model of diabetic retinopathy. Experimental Eye Research. , (2020).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

Ludzka organotypowa hodowla siatk wkiwarstwy siatk wkitypy kom rekintegralno siatk wkipost powanie z tkankamiterapie lekoweekstrakcja eksplantat wpo ywka hodowlanazmodyfikowane pod o e Dulbeccoantybiotyki i leki przeciwgrzybiczeTrepanina chirurgicznaeksplantaty siatk wkipenetracja tward wkitechniki hodowli tkankowej