TGF-β介质到中微过渡（末端MT）和使用CRISPR/Cas9基因编辑对末端效应器的功能评估

摘要

我们通过观察细胞形态变化和使用免疫荧光染色检查表达 EndMT 相关标记变化来描述在内皮细胞中研究 TGF-β2 诱导 EndMT 的方法。CRISPR/Cas9基因编辑被描述并用于耗尽编码蜗牛的基因，以调查其在TGF-+2诱发的EndMT中的作用。

摘要

为了响应特定的外部线索和某些转录因子的激活，内皮细胞可以分化成类似发音的表型，这个过程被称为内皮的中微子过渡（EndMT）。最新结果表明，EndMT与多种人类疾病（如纤维化和癌症）有因果关系。此外，内皮衍生的间质细胞可应用于组织再生过程，因为它们可以进一步分化为各种细胞类型（如骨细胞和软骨细胞）。因此，选择性地操纵 EndMT 可能具有临床潜力。与上皮-感性过渡（EMT）一样，EndMT 可以强烈地由分泌的细胞因子转换生长因子-β （TGF-β） 引起，后者刺激所谓的 EndMT 转录因子 （EndMT-TFs） 的表达，包括蜗牛和 Slug。然后，这些 EndMT-TF 分别调节间质蛋白和内皮蛋白的水平。在这里，我们描述了在体外研究TGF-β诱发的EndMT的方法，包括研究特定TF在TGF-β诱导的EndMT中的作用的协议。利用这些技术，我们提供了证据，证明TGF-β2刺激了Murine胰腺微血管内皮细胞（MS-1细胞）中的EndMT，并且蜗 牛 利用聚集的定期间歇短乳液重复（CRISPR）/CRISPR相关蛋白9（Cas9）介质基因编辑，消除了这种现象。这种方法可以作为一个模型来询问内皮生物学的潜在调节器，并可用于执行遗传或药理学筛查，以确定 EndMT 的新调节器，在人类疾病中具有潜在的应用。

引言

内皮到间质过渡（EndMT）是一种多步骤和动态的生物现象，已经与不同的生理和病理过程^1，2。在 EndMT 内皮细胞逐渐失去内皮特征时，同时获得中性属性^3:因此，紧密压缩和组织良好的内皮细胞分化成拉长的中微细胞状细胞。EndMT 中的形态变化与某些基因和蛋白质表达的改变相吻合。一般来说，维持内皮特性的蛋白质的表达，包括血管内皮（VE）-卡德林、血小板/EC粘附分子-1（CD31/佩卡姆-1）下降。同时，与间质功能相关的蛋白质，如α光滑的肌肉作用素（α-Sma）和平滑肌肉蛋白22+（Sm22+）积累。最新结果表明，产后末期MT有助于人类疾病的发展，如癌症、心肌纤维化、肺动脉高血压（PAH）、动脉粥样硬化（AS）、器官纤维化等2、4、5、6、7。更深入地了解 EndMT 的基本机制以及如何指导 EndMT 过程将为 EndMT 相关疾病和再生医学提供新的治疗方法。

TGF-β是EndMT诱导剂之一，其他已知的相关因素包括Wnt/β-卡泰宁、诺奇和一些炎症细胞因子^1。由于蜂窝上下文是 TGF-β触发响应的关键，因此 TGF-β与其他 EndMT 促进信号的相互作用与 TGF-β引起 EndMT 响应相关。在激活TGF-β细胞表面I型和II型血清/三氨酸激酶受体后，细胞内规范的Smad通路被激活。TGF-β受体介导的磷酸Smad2/3与Smad4形成异质复合物，迁移到细胞核中，在那里它们调节了EndMT相关转录因子的表达。类似于上皮-发炎性过渡（EMT），转录因子，如蜗牛，斯拉格，扭曲，Zeb1和Zeb2是由TGF-β信号诱导的，并有助于EndMT⁸的基因重新编程。

蜗牛经常被确定为 EndMT 中的一个关键因素。蜗牛与编码细胞粘附蛋白的基因的促进者结合，并抑制其转录，通过增强中性蛋白⁹的表达来抵消转录。内皮细胞由非常异质的种群组成，不同细胞外刺激对EndMT的相对影响可能因内皮细胞背景或^{细胞类型10}而异。由于它与EMT的相似性，一些方法对调查EMT和EndMT⁸的机制都很有用。在这方面，EMT国际协会（TEMTIA）强调需要互补技术，以最终证明EMT/EndMT¹¹的发生。

在这里，我们描述了一种监控和可视化 TGF-β 诱导的 EndMT 过程的方法。免疫荧光染色提供了靶向蛋白质/标记物表达变化的基本信息，这些信息用于指示 EndMT 过程是否发生。此外，免疫荧光染色可以可视化蛋白质/标记物和细胞形态的本地化。为了研究特定 TF（或其他上游或下游调节器）参与 TGF-β调解 EndMT 的潜在活动，我们使用 TGF-Snail 作为示例，使用分组定期间歇短柱重复 （CRISPR） / CRISPR 相关蛋白质 9 （Cas9） 基因编辑来耗尽细胞中的特定基因的协议。Cas9是一种双RNA制导的DNA内核酶，它识别和切割与细菌¹²中的CRISPR序列相辅相成的序列。CRISPR/Cas9系统目前被广泛使用，因为它促进体外遗传工程和体内^13。由单个指南RNA（sgRNA）指导，异位表达的Cas9在特定基因位点的预选靶向序列中产生双链断裂。非同源端连接 （NHEJ） 通过随机核苷酸插入或删除来修复 Cas9 诱发的链断裂，从而导致目标基因的中断和失活。我们详细描述了设计选择性 sgRNA 和生成包含设计 sgRNA 的扁豆兼容载体的方法。因此，稳定的基因耗尽内皮细胞可以以高效和可靠的方式产生。

在这项研究中，我们使用穆林胰腺微血管内皮细胞（MS-1）14作为模型系统来检查TGF-+2诱导的EndMT过程。我们先前的研究表明，蜗牛是TGF-+2增加的主要转录因子，通过TGF-+2，EndMT在MS-1细胞¹⁵中诱导。在CRISPR/Cas9基因编辑以消除MS-1细胞中的蜗牛表达后，TGF-β2未能调解EndMT。此工作流可用于研究其他（疑似）EndMT 相关基因。

研究方案

1. TGF-+2 引入末端MT

1. Dulbecco 改良鹰介质 （DMEM） 中的 MS-1 细胞在孵化器中含有 10% 胎儿牛血清 （FBS） 和 100 U/mL 青霉素/链霉素 （5% CO₂， 37 °C）。使用前10分钟用0.1%的明胶涂抹所有文化菜肴/盘子。
2. 用1倍磷酸盐缓冲盐水（PBS）轻轻清洗MS-1细胞，在37°C处加入2毫克的三氯辛-EDTA溶液（0.25%的三氯苯酚素和0.02%的EDTA）到10厘米的盘子中，并在37°C处孵育2分钟以分离它们。随后，添加5mL的完整文化介质来淬灭反应。
3. 在室温下将细胞悬架转移到 15 mL 管和离心机，在 200 x g 下 3 分钟。
4. 丢弃超自然物质，在含有 FBS 和青霉素/链霉素的新鲜介质的 4 mL 中重新注入细胞。使用自动细胞计数器数数细胞。
5. 种子 1 x 10³ 细胞每厘米² 为进一步培养.例如，6 井板的种子 9.5 x^{10 3} 细胞/井，或 24 井板的 1.9 x^{10 3} 细胞/井。
6. 在一夜之间孵化细胞，使其粘附和恢复，然后用 TGF-β 刺激 MS-1 细胞 3 天。在TGF-β2刺激前30分钟加入TGF-β受体激酶抑制剂SB431542（5μM）。使用车辆 （DMSO） 处理其他细胞。
   注:在含有0.1%人牛血清白蛋白（BSA）的4mM HCl中溶解TGF-β2。在控制组中添加相同数量的无 TGF-β2 的配体缓冲区。TGF-β2浓度可调整为0.1-1 ng/mL，以进行特定检测。请参阅相应数字中的指示。
7. 3天后，用明亮的场成像（用倒置显微镜）检查细胞形态，并进行免疫荧光染色（见第2步），以评估 EndMT 相关标记的变化。至少进行三次独立的实验以获得生物三脚架。

2. 免疫荧光染色

1. 尝试培养MS-1细胞（步骤1.2），然后在放置在24井板底部的12毫米圆形盖玻璃上重新种子1.9 x 10³ 细胞。
2. 在一夜之间培养细胞后，将TGF-β2（最终浓度为1 ng/mL）添加到细胞中3天。使用含有配体缓冲器的介质作为负控件。
3. 执行佩卡姆-1和Sm22®染色。
   1. 在用TGF-β（或控制）刺激细胞3天后，取出介质，用1倍PBS清洗细胞。
   2. 在每个井中加入300微升4%甲醛，在室温下孵育10分钟以修复细胞。孵化后用1倍PBS清洗3倍。
   3. 在 1x PBS 中加入 300 μL 的 0.1% Triton X-100 到每个井中，并在室温下孵育 10 分钟，以渗透细胞。孵化后，取出 Triton X-100 溶液，用 1 倍 PBS 清洗细胞 3 倍。
   4. 在室温下用 3% 牛血清白蛋白 （BSA） 在 1x PBS 中阻断细胞 45 分钟。
   5. 用 1 倍 PBS 稀释识别穆林蛋白的主要 Pecam-1 和 Sm22® 抗体 1:500。然后在室温下用原抗体孵育固定细胞45分钟。
   6. 用1倍PBS清洗3次后，用1000倍稀释的二次抗体孵育细胞，包括驴抗鼠亚历克萨488和山羊抗兔亚历克萨594，在室温下45分钟。
      注意:在染色过程中保护样品免受光线的伤害。
   7. 用 1 倍 PBS 冲洗 3 倍后，将带有细胞的盖玻璃朝下放在含有 4'，6-2-苯林多 （DAPI） 的安装介质上，以弄脏核。
   8. 用透明指甲油修复盖玻璃的外围，并将其存放在 4 °C。
   9. 用对焦显微镜获取代表性图像。将激光波长设置为 405 nm、488 nm 和 552 nm，分别检测 DAPI、佩卡姆-1 和 Sm22®。对于每个频道，所有图片都是以相同的设置和曝光时间拍摄的。至少进行三次独立的实验以获得生物三脚架。

3. 使用 CRISPR/Cas9 编辑从 蜗牛 中敲出

1. 设计两个独立的sgRNA针对穆林 蜗牛。
   1. 使用在线工具CHOCHOP（https://chopchop.cbu.uib.no/）和Cas-OFFinder（http://www.rgenome.net/cas-offinder/）根据目标基因名称和物种设计sgRNA。
   2. 通过两个独立的算法（包括 Cas-OFFinder （http://www.rgenome.net/cas-offinder/） 和 CHOPCHOP （http://chopchop.cbu.uib.no/）预测针对蜗牛设计的 sgRNA 的非目标活动。
   3. 选择两个活动最少的 sgRNA。设计两个互补的sgRNA寡头与 BveI切割网站。感寡头从 5 '- accg - 3' 开始， 反感寡头从 5 '- Aac - 3' 开始。
   4. 订购用于进一步使用的商业合成寡头。
2. 将互补指南RNA寡头克隆到BveI消化AA19 pLKO.1-纯净.U6.sgRNA中。大道I-馅料伦蒂维拉尔矢量质粒生成AA19 pLKO.1-蜗牛-斯格纳^16。
   1. 切断 AA19 pLKO.1- 纯净. u6.sgRNA。大道我馅质粒与 BveI 酶¹⁶。混合 2μg 的 AA19 pLKO.1-纯净. u6.sgRNA。大道I-馅料质粒，5μL的10倍缓冲O，和5μL的 BveI酶，并添加无菌水，达到总体积50μL。
   2. 漩涡和短暂地旋转反应组合。在37°C下孵化反应1小时。
   3. 将反应混合物加载到1%的蔗糖凝胶上，并在1x三叶草乙酸酯-EDTA（TAE， 50x TAE 库存:242 克 Tris 碱溶解在水中，57.1 mL 的冰川醋酸、100 毫升的 500 mM EDTA （pH 8.0） 溶液，并将水添加到总共 1 升）缓冲中，直到实现良好的分离。
   4. 从凝胶中切下骨干片段，根据制造商的协议（参见 材料表）用凝胶提取套件将其隔离，并在 40μL elution 缓冲器 （EB） 中提取骨干。
   5. 将 5 μL 的 100 pmol/μL 感奥利戈和 5 μL 的 100 pmol/μL 抗感寡头与 1 μL 的 1 M 特里斯-HCl （pH 8.0） 混合，并加入无菌水，使 gRNA 寡头的退化达到 100 μL。在 100 °C 下将混合物孵化 5 分钟，然后用铝箔覆盖管子。之后，慢慢冷却室温溶液，以进一步用作插入物。
   6. 为了利化互补的 gRNA 寡头和 Bve我消化的骨干， 混合1μL的孤立 BveI削减AA19 pLKO.1-puro.U6.sgRNA.BveI-填充骨干和2μL的插入（稀释1:300）与2μL的10x T4DNA韧带缓冲器和1μL的T4DNA韧带， 并添加无菌水，以达到20μL。 短暂旋转管子，并在室温下孵育4小时，以供进一步使用。
      注意:执行结定时，确保包括两个控制组。对于一个对照组，混合1μL的分离骨干，2μL的10x T4DNA韧带缓冲器，和1μL的T4DNA韧带，并添加无菌水达到总共20μL，但没有寡头DNA。对于另一个对照组，混合1μL的分离骨干和2μL的10x T4DNA韧带缓冲器，并添加无菌水达到共20微l，但没有退化寡头和T4韧气。这两种控制性配对用于确定下一个转换步骤中的反应背景，并指示套着的效率。
3. 将反应混合物转化为称职的TOP10大肠杆菌。
   1. 收集称职的TOP10 大肠杆菌。细胞从-80°C冰柜，并在冰上解冻。
   2. 将 2μL 的结定混合物添加到 50 μL 的称职细胞中，并将管子保持在冰上 30 分钟。
   3. 在 42 °C 的 30 年代将管子加热到 42 °C。把管子放在冰上2分钟。
   4. 在混合物中加入 950 μL 的新鲜溶酶肉汤 （LB） 介质，在 37 °C 下剧烈摇晃 60 分钟。
   5. 向下旋转，将细胞放在温暖的安培林（100微克/毫升）耐药性LB板上。在 37 °C 的夜间孵化板。
4. 验证 gRNA 寡头在质粒中的成功插入。
   1. 在含有LB介质的1毫升安皮西林（100μg/mL）中挑选3-5个菌落，在30°C下摇动一夜。
   2. 根据制造商的协议（材料表）将质粒DNA与质粒套件分离，并与 U6 促进器引物 5'- GAGGCTCTCTCTCATCATGATT -3' 进行测序，以验证 gRNA 寡头的成功插入。

4. 生成蜗牛淘汰 MS-1 细胞

1. 产生携带 Cas9 或蜗牛靶向 gRNA 的扁桃体颗粒。
   1. 培养 HEK 293T 细胞在 DMEM 中含有 10% 胎儿牛血清和 100 U/mL 青霉素/链霉素在 14.5 厘米菜肴 （或 T75 烧瓶） 在孵化器 （5% CO_2，37 °C）.
   2. 将 9.9 μg 的靶向基因质粒、AA19 pLKO.1-蜗牛-sgRNA 或 pLV-Cas9¹⁷ 质粒混合，以及帮助质粒 3.5 μg 的 pCMV-VSVG（编码血管口腔炎病毒的 G 蛋白， VSV-G），6.6微克转速响应元素质粒pMDLg-RRE（编码加格和波尔），和5.0微克的pRSV-REV（编码修订版）在500微L的血清自由介质。在 500 μL 的无血清介质中补充 50 μL 聚乙酰氨基宁 （PEI） （2.5 毫克/mL）。通过上下管道轻轻混合质粒和 PEI 制剂。在室温下将混合物孵育20分钟。
   3. 通过在 14.5 厘米的菜肴（或 T75 烧瓶）中加入从步骤 4.1.2 到 80% 的汇合细胞的混合物介质来传输 HEK 293T 细胞，其中含有 DMEM 介质，其中含有 10% FBS 和 100 U/mL 青霉素/链霉素。HEK293T细胞之所以被使用，是因为它们很容易被传播，并产生高水平的病毒^18。
   4. 将受感染的 HEK 293T 细胞转移到微生物和生物医学实验室 （BMBL） 的生物安全中，以培养它们 24 小时。
   5. 在 BMBL 实验室中，用含有 FBS 和青霉素/链霉素的 12 毫升新鲜完整 DMEM 替换 HEK 293T 细胞的转染介质。孵化细胞24小时。
   6. 使用 20 mL 注射器和 0.45 μm 过滤器收集和过滤介质。将条件介质转移到 15 mL 聚丙烯管中。
   7. 在 HEK 293T 培养皿和文化中加入 12 毫升含有 FBS 和青霉素/链霉素的新鲜完整 DMEM，再加 24 小时。
   8. 使用 20 mL 注射器和 0.45 μm 过滤器收集和过滤介质。将条件介质转移到 15 mL 聚丙烯管中。将含有扁桃体颗粒的介质存储为 -80 °C 的 1 mL 等离子报价，以供进一步使用。
2. 感染MS-1细胞与pLV-Cas9病毒。
   1. 种子 1 x 10⁵ MS-1 细胞每井在 6 井板 24 小时之前扁豆病毒感染.
   2. 在 37 °C 的水浴中解冻 pLV-Cas9 病毒的冷冻单列。
   3. 将 1 毫升病毒介质与含有 FBS 和青霉素/链霉素的新鲜 DMEM 介质混合 1 mL。将聚苯加入介质（最终浓度为10微克/mL），以提高感染效率。
   4. 从 6 井板中取出介质，代之以病毒/聚苯混合介质，并在感染后在孵化器中培养细胞 24 h. 24 h，用新鲜介质替换介质，将细胞培养 24 h。
      注意:始终保持未受感染的组和对照组。
   5. 吸气介质从感染组和对照组，并替换它与DMEM介质4μg/mL爆破素。
   6. 将盘子返回到 37 °C 的孵化器，培养细胞 1 周。未受感染的细胞将因爆炸性杀伤素的作用而死亡。当存活细胞达到80%的细胞结合时，分离它们，并继续选择爆炸性丁。
   7. 使用抗体对 Cas9 进行西印确认 MS-1 细胞中的 Cas9 表达（Cas9 的分子重量约为 160 kDa）。
3. 单独感染pLV-Cas9 MS-1细胞与两个独立的gRNA扁豆病毒。
   1. 种子 1 x 10⁵ pLV-Cas9 MS-1 细胞每井在 6 井板 24 小时感染前。
   2. 按照 4.2 中描述的相同协议，分别感染两种 gRNA 扁豆病毒的细胞。
   3. 在24小时感染gRNA病毒后，刷新介质并培养细胞24小时。
   4. 用 1μg/mL 普洛霉素替换介质。将盘子返回到 37 °C 的孵化器，培养细胞 1 周。确保未受感染的细胞完全死亡。当细胞达到80%的汇流时，分裂细胞，并继续选择普洛霉素。
   5. 使用抗蜗牛的抗体（蜗牛的分子重量约为35 kDa），通过西式印迹确认MS-1细胞中蜗牛的淘汰。

结果

TGF-β2 诱导 EndMT 并刺激 MS-1 内皮细胞中的蜗牛表达
TGF-β是诱导末端MT的最大潜力的细胞因子之一。在用TGF-β2（1 ng/mL）治疗MS-1细胞3天后，内皮MS-1细胞失去鹅卵石状结构，分化成主轴状的间质状细胞（图1A）15。为了进一步验证TGF-β2在诱导细胞表型变化方面的作用，我们在TGF-+2刺激¹⁹之前用小分子活体受体样激酶（ALK）4/ALK5/ALK7抑制剂SB431542对细胞进行了预处理。SB431542 完全废除了 TGF-β2 诱导的细胞形态变化 （图 1A）。通过研究末端MT相关标记的表达变化，进一步调查了TGF-β2诱导的EndMT过程。如图1B所示，在TGF-β2刺激后，内皮蛋白Pecam-1被有效降低，而间质因子Sm22®则被TGF-β2¹⁵严重地加高了调节。这些数据与 TGF-β2 在 MS-1 单元中触发 EndMT 的概念一致。接下来，我们调查了TGF-β2对蜗牛和蜗牛表达的影响。如图1C所示，蜗牛明显受到TGF-β的调节，而Slug表达不受MS-1细胞¹⁵中的TGF-β的影响。从三个独立的实验中对蜗牛表达的定量显示在图1D中。

在MS-1内皮细胞中，由CRISPR/Cas9消耗蜗牛
由于蜗牛是由TGF-β2诱导的，并且可能参与TGF-+2介导的EndMT，我们进行了CRISPR/Cas9基因编辑，以基因耗尽MS-1细胞中的蜗牛表达。我们假设蜗牛的耗竭足以抑制TGF-+2诱发的末端MT。如图2A所示，我们分两步生成蜗牛淘汰细胞。首先，Cas9通过用Cas9表达扁豆病毒感染MS-1细胞来表达异位。由于pLV-Cas9结构中有一个防爆素电传，我们通过西方对抗爆丁的细胞（图2D）的污点分析检查了Cas9的表达。随后，我们推出了专门针对蜗牛的sgRNA，以破坏其蛋白质表达。这个过程也是通过感染携带AA19 pLKO.1-蜗牛-sgRNA构造的扁桃体颗粒进行的，其中包括一个普洛霉素表达盒。Cas9表达细胞再次感染了含有扁豆病毒的gRNA，并进一步选择了普洛霉素。两个针对穆林蜗牛的互补性 sgRNA 寡头设计具有预测的低目标活动 （图 2B，C）。在Cas9中引入两个独立的蜗牛sgRNA表达MS-1细胞后，蜗牛蛋白表达被废除（图2D）15。

蜗牛缺乏抑制MS-1细胞中的TGF-+2诱发的末端MT
为了在TGF-+2介质的EndMT中证明蜗牛的功能，我们在蜗牛耗尽的细胞中进行了EndMT检测，并将其与父母MS-1细胞进行比较。如图3A所示，蜗牛的淘汰足以抑制MS-1^细胞15中TGF-β驱动的类似成纤维细胞的细胞形态。此外，在蜗牛耗尽的MS-1细胞中，由TGF-β2介质的Pecam-1下降和Sm22®的增强被完全阻断。总之，我们证明蜗牛对MS-1细胞（图3B）15中的TGF-+2介质末端MT至关重要。

图1。TGF-β2在MS-1细胞中诱导末端MT和蜗牛表达。A.TGF-β2和/或TGF-β I型受体激酶抑制剂SB-431542对细胞形态的影响。使用 TGF-β2 （1 ng/mL） 和/或 SB-431542（SB， 5 μM，在 TGF-β 之前 30 分钟施用）治疗时，MS-1 细胞的明亮场图像，为期 2 天。比例栏表示 200μm. B。在含有TGF-β2（1 ng/mL）的中等培养的MS-1细胞中，对佩卡姆-1（绿色）和Sm22®（红色）进行免疫荧光染色3天。核以蓝色 （DAPI） 可视化。比例杆:50μm.C.西斑，整个细胞的TGF-β2刺激MS-1细胞。 蜗牛的表达，但不是斯拉格，通过TGF-+2刺激，如先前在马等人¹⁵报道。D.通过整合三个独立的西方污点实验的结果来量化蜗牛的表达。请单击此处查看此图的较大版本。

图2。通过CRISPR-Cas9基因编辑耗尽 蜗牛 。A. 描述如何生成 蜗牛 淘汰细胞的方案。Bsd: 爆破剂。普洛:普洛霉素。 B. 使用乔乔普 （http://chopchop.cbu.uib.no/） 和卡斯 - 奥芬德 （http://www.rgenome.net/cas-offinder/） 瞄准 蜗牛 的两个独立 sgrna 的寡头核苷酸。C. 使用 Cas-OFFinder（http://www.rgenome.net/cas-offinder/）预测的蜗 牛 两个 gRNA 的非目标活动。D. 由西方污点分析测量的野生类型 （WT） 和 Cas9 过度表达的 MS-1 中的 Cas9 和蜗牛表达。 E. 根据西方污点分析，在MS-1细胞中用两个独立的gRNA敲掉 蜗牛 。我们在马等人¹⁵日报告了类似的结果。 请单击此处查看此图的较大版本。

图3。蜗牛的遗传耗竭抑制MS-1细胞中的TGF-+2诱发的末端MT。A. 与TGF-β2（0.1 ng/mL）治疗后，MS-1细胞在野生型（WT、上面板）和 蜗牛 中敲出（下面板）细胞3天的光明场图像。比例杆表示 200μm. B. 佩卡姆-1 （绿色）、Sm22® （红色） 和核 （蓝色） 的免疫荧光染色，在含有 TGF-α（1 ng/mL） 的介质中培养 3 天。 蜗牛 的耗竭废除了 TGF-β2 诱发的佩卡姆 - 1 的减少和 Sm22® 表达的增加。比例杆表示 50μm. C. Schematic 表示 蜗牛 淘汰对 MS-1 细胞中 TGF-β诱导的 EndMT 的影响。TGF-β通过磷酸化 Smad2/3 和进一步驱动 EndMT 来刺激 蜗牛 通过 Smad 通路的表达。使用 CRISPR/Cas9 基于基因编辑的已废除的 TGF-β介质 EndMT 敲出 蜗牛 。 请单击此处查看此图的较大版本。

讨论

了解 EndMT 的机制对于调节此过程和针对末端MT 相关疾病至关重要。在这里，我们描述了执行TGF-β诱导的EndMT检测的方法，并通过执行CRISPR/Cas9介导的蜗牛从细胞中分离出稳定基因来询问EndMT-TF蜗牛在TGF-β触发的EndMT中的作用。使用CRISPR/Cas9方法的蜗牛耗尽成功地在MS-1细胞（图3C）中废除了TGF-β2驱动的末端MT。为了研究任何细胞因子（如TGF-β）对EndMT的影响，ECs暴露在细胞因子中，然后根据形态变化和细胞内皮和发痒标记表达变化来评估EndMT的发生。TGF-β2 在 MS-1 细胞中强烈诱导 EndMT，同时转录因子蜗牛的表达量也随之强劲增加。TGF-β诱导的末端MT-TFs可能因物种或组织特异性内皮细胞类型而异。例如，我们观察到蜗牛（但不是蜗牛）在MS-1细胞中被TGF-β显著提升，而在人类脐带内皮细胞（HUVECs）中，蜗牛和蜗牛在接触TGF-β 20后均增加。

我们通过检查细胞形态变化，然后通过调查 EndMT 相关标记表达的变化，以两种方式评估 EndMT 过程的程度。TGF-β暴露3天后，细胞接受EndMT，其形态变化和EndMT相关标记的表达变化一致。除了我们在这里进行的免疫荧光染色，标记变化也可以通过西方在蛋白质表达水平或qRT-PCR（实时定量反转录PCR）在基因水平²¹监测。除了我们在本协议中展示的这两种节省时间和成本的方法外，还有其他方法可以检查 EndMT。例如，执行转录体分析（通过RNA测序或qPCR）来比较治疗和控制细胞之间内皮和间皮相关基因的表达水平，可以精确评估EndMT 22，23。此外，EndMT 通常涉及障碍功能的稳定损失，可以通过阻抗光谱²⁴来评估。此外，还可检查 EndMT 衍生细胞获得干细胞样特性的额外证据。例如，在特定的培养条件下，EndMT类似发痒的细胞可以进一步分化成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞或（肌）成纤维细胞。因此，确认不同细胞类型的分化属于中皮谱系（即基因表达和基质染色）的附加分析有助于证明 EndMT 衍生细胞的多能性质。最后，EndMT 评估方法不限于体外研究，但可以推断出 EndMT 与体内或前体内器官中某些疾病之间的关系。从这个意义上说，内皮特定血统追踪策略的使用被广泛扩展到 EndMT 相关研究²⁵。

为了研究蜗牛在EndMT中的作用，在这项研究中，CRISPR/Cas9基因编辑被用来敲除这个基因。数据显示，TGF-β2未能在蜗牛缺乏的MS-1细胞中调解末端MT。这一观察表明，蜗牛对MS-1细胞中的TGF-β2诱导末端MT至关重要。我们使用独立的 U6 驱动 sgRNA 表达式磁带为 Cas9 引入特定的 sgRNA 来瞄准 蜗牛。 除了这种方法，Ran等人²⁶ 描述了将sgRNA寡头序列克隆到Cas9脚手架中以生成包含Cas9和gRNA的构造的另一种策略。新兴的新方法允许 CRISPR/Cas 合并其他功能。例如，通过向表达 Cas9²⁷的细胞中提供更多的 sgRNA，可以实现双或三次淘汰。工程的Cas13蛋白质靶向和消化RNA分子，而不会破坏内源性^DNA28。除了用CRISPR/Cas敲除基因外，短发夹RNA（shRNA）可以用作稳定地击倒目标基因表达²⁹的替代品。对于所有 CRISPR / Cas 基因编辑方法，应始终考虑脱靶。此外，小干扰RNA（siRNA）暂时沉默基因表达和siRNA浓度被稀释与细胞分裂^30。这两种方法都部分抑制了靶向基因表达。相比之下，异位基因表达也用于验证EndMT/EMT³¹期间的基因功能。这种方法可以确定基因的上调节是否足以引起 EndMT 响应。因此，目前有多种技术战略可用于识别和验证 EndMT 的潜在监管机构。此外，转录分析是EndMT相关监管机构识别和综合分析的一个良好选择。我们建议使用不同的补充方法来调查 EndMT 的调制。

总之，我们引入了一个工作流程，以识别在 TGF-β 诱导的 EndMT 期间可能起作用的因素。这种方法还可用于研究其他刺激（即细胞因子、生长因子、机械刺激、细胞-细胞相互作用）是否可以调节 EndMT，以及 TGF-β与其他刺激的相互作用。此外，我们强调了使用CRIPSR/Cas基因编辑的方法，以阐明TGF-β诱导的EndMT是否需要某种基因。为了说明这种方法，我们在MS-1细胞中使用了强的EndMT诱导剂TGF-β2，但协议可以适应其他细胞因子和其他细胞类型。我们预计，上述详细的协议将成为未来 EndMT 相关研究的垫脚石。

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.45 μm filter	Pall Corporation, USA	4614
10× T4 DNA ligase buffer	Thermofisher Scientific, USA	B69
12 mm round glass slice	Knittel Glass,Germany	VD10012Y1A.01
20 mL syringe	BD Eclipse, USA	300629
4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)	Vector Laboratories, USA	H-1200	VECTASHIELD Antifade Mounting Media
AA19_PLKO vector	Dr. M Gonçalves, Leiden University Medical Center, Netherlands		Gift
Ampicillin	Serva Electrophoresis, USA	1339903
Anti-Mouse IgG	GE Healthcare, USA	NA931
Anti-Rabbit IgG	Cell signaling, USA	7074
Agarose	Roche, Switzerland	11388991001
Blasticidin	Invitrogen, USA	R21001
Buffer O (10X)	Thermofisher Scientific, USA	BO5
BveI (Bspm1)	Thermofisher Scientific, USA	ER 1741
Confocal microscope	Leica Microsystems, Germany	SP8
DMEM	Thermo Fisher Scientific, USA	11965092
Donkey anti-rat Alexa 488	Invitrogen, USA	A21208
FBS	Thermo Fisher Scientific, USA	16000044
Formaldehyde	Thermo Fisher Scientific, USA	28908
Inverted microscope	Leica Microsystems, Germany	DMi8
Goat anti-rabbit Alexa 594	Invitrogen,USA	A11012
LabNed Plasmid kit	LabNed, USA	LN2400004
MS-1 cell line	American Type Culture Collection (ATCC)
Nail polish	HEMA, Netherlands		Transparent
Pecam-1 antibody	Becton Dickinson,USA	553370
PEI	Polysciences, USA	23966-1
PLV-Cas9 plasmid	Sigma-Aldrich, USA	Cas9BST-1EA
Puromycin	Sigma-Aldrich, USA	P9620
QIAquick gel extraction kit	Qiagen, Germany	28706
Sm22a antibody	Abcam, UK	ab14106
Snail	Cell signaling, USA	3879
T4 DNA ligase	Thermofisher Scientific, USA	EL 0014
TC20 automated Cell Counter	Bio-Rad, USA	1450102
Human TGF-β2	Joachim Nickel, University of Wurzburg	Gift	Other commercial recommendation: 302-B2, R&D systems
Triton X-100	Merck, USA	1086031000
SB431542	Tocris Bioscience, UK	1614
Tris	Roche, Switzerland	11814273001