体外实验性硬化模型:脂质超载介质中的肝细胞培养

摘要

该协议旨在成为研究硬化症和分子，生化，细胞变化产生的肝细胞过度暴露 在体外脂质的工具。

摘要

代谢功能障碍相关的脂肪肝疾病（MAFLD），以前被称为非酒精性脂肪肝疾病（NAFLD），是全世界最普遍的肝脏疾病，因为它与肥胖症、糖尿病2型和脂质血症有关。肝硬化是肝炎、纤维化和末期肝病中观察到的炎症之前疾病的一个关键特征，它积累在肝炎中。肝细胞中的脂质积累可能会干扰异生物和内源分子的正常代谢，并诱导导致疾病进展的细胞过程。虽然在 体内可以进行硬化实验研究，但 体外 研究硬化的方法是具有不同优势的互补工具。脂质超载介质中的肝细胞培养是研究肝硬化的极好可重复选择，它能够识别与脂质积累相关的细胞过程，如氧化和网状压力、自噬、增殖、细胞死亡等，以及包括药物有效性、毒理学测试等许多其他可能应用的其他测试。在这里，它的目的是描述肝细胞培养在脂质超载调节介质的方法。HepG2细胞在RMPI 1640中型中培养，以棕榈酸钠和油酸钠为条件。重要的是，这两种脂质的比例对于有利于脂质液滴积累至关重要，同时保持细胞增殖和中等死亡率，就像疾病期间肝脏中发生的情况一样。该方法，从脂溶液库存的制备，混合物，除了介质，肝细胞培养表现出来。通过这种方法，可以识别肝细胞中易于观察到的油红色 O 染色剂中的脂质液滴，以及增殖/死亡率曲线。

引言

脂肪肝与代谢功能障碍有关，在世界范围内非常普遍^1，2:据估计，多达25%的人口受到影响^3。这种疾病以前被称为非酒精性脂肪肝病（NAFLD），它更新了代谢功能障碍相关的脂肪肝疾病（MAFLD）的命名，以准确反映与肥胖，胰岛素抵抗，糖尿病2型和血脂异常有关的发病机制，以及疾病的可能管理^3，4。

无论名称如何，该病包括广泛的组织病理学变化，其特征是肝脏中脂质的异常高积累（肝细胞⁵中脂肪的>5%），并可能通过通常存在于简单硬化中的脂质积累进展到硬膜炎，这反过来又可能导致纤维化、肝硬化的发展， 肝细胞癌和肝衰竭^{5，6，7，8}。由于其日益流行，MAFLD有望成为肝移植的第一个迹象和肝细胞癌⁹的主要原因。

虽然它被认为是脂肪肝疾病的良性或温和形式，肝硬化实际上是MAFLD¹⁰中的代谢键。不同的代谢途径受肝脏脂质积累的影响，包括但不限于脂质合成、出口和代谢^10。胰岛素抵抗、氧化应激、网状应激和细胞功能障碍与肝脂质^11、12密切相关。另一方面，脂肪肝细胞是活性氧物种的目标，使代谢物成为过氧化脂、蛋白质碳基和核酸的附庸^。在细胞水平上，脂肪肝细胞可能经历线粒体损伤^14，细胞衰老^15，凋亡^16，热细胞增多^12，自噬^17，以及其他事件。

肝细胞对新陈代谢、排毒和广泛分子的合成负有高度责任。许多这些功能可能因在硬化中观察到的脂质积累而受损。因此，拥有可重复的工具，以便准确评估硬化，是非常重要的。从这个意义上说，体外模型是易于适用和高度可重复的。体外史的斯蒂特病已经用不同的目标16，18，19。HepG2细胞被广泛用作肝细胞系。它具有易于培养和特征良好的优点。也许，HepG2细胞的唯一缺点是它是致癌细胞系，所以在分析结果时必须考虑这一点。在这里，显示了脂肪酸混合物在细胞培养中广泛使用的应用:棕榈酸（PA）和油酸（OA）。PA 和 OA 在文化²⁰中都提供了不同的结果。PA （C 16:0） 是最常见的饱和脂肪酸从饮食¹⁶获得。PA被认为是非脂肪生成的生物标志物，是NAFLD²¹发展的关键一步。PA显示为剧毒^22:因此，可能不建议在体外诱发硬化。OA （C 18:1） 是一种单不饱和脂肪酸。与PA相比，OA被建议具有抗炎和抗氧化特性，能够对抗^PA12。PA和OA都是甘油三酯中的主要脂肪酸，无论健康状况或疾病^16。表1提供了肝细胞培养与PA，OA，及其混合物的例子，以及报告的结果12，23，24，25，26，27。其他脂肪酸也用于肝细胞培养，包括乳酸（C 18:0）^{28，29，30，}亚油酸 （C 18:1）^28，30，31及其结合 （CLA）^28，32，棕榈酸 （C 16:1）^29.然而，他们的使用在文献中最不常被报道，也许是因为他们的肝丰度低于PA和^OA16。

同时，这两种脂肪酸类似于体外硬化，提供增殖细胞，与控制条件相比，细胞死亡增加，生存能力降低。值得一提的是，这些脂肪酸的盐是可用的，也可以使用。评估肝细胞培养中的脂质超载时，主要问题之一是毒理模型和最能代表硬化的模型之间的差异。许多模型可以在第一种情况下进行说明。事实上，单单使用PA就可视为其中之一，而高死亡率是最明显的结果12、16、23、24、25、26、27。即使在OA的情况下，使用高剂量也可以被视为毒理学模型。这里显示的协议是根据硬化的发展更高，因为它显示低死亡率相比，观察到的其他模型，并允许它遵循在几天与渐进脂质积累，因为它发生在NAFLD。通过实验条件评估轻度和重度硬化的可能性被认为是另一个优势。

脂肪酸	条件		结果		参考
宾夕法尼亚州	浓度: 200 μM		脂质积累		严等人， 201925.
	时间曝光: 24 小时		肝细胞损伤
			跨氨酶高程
宾夕法尼亚州	浓度: 50、100 和 200 μM		脂质积累		兴等人， 201924.
	时间曝光: 24 小时
宾夕法尼亚州	浓度:250 μM、500 μM、750 μM 和 1，000 μM		脂质积累		王等人， 202026.
	时间曝光: 24 小时		逐步降低细胞生存能力
OA/PA 的混合	浓度: 1mM		脂质积累		肖等人， 202027.
	时间曝光: 24 小时		不报告脂质
	费率: 2OA:1PA
OA/PA 的混合	第一次刺激 200 μM 和 400 μM 的 PA，然后第二次刺激与 200 μM 的 OA		脂质积累。		曾等人， 202012.
	浓度:400 μM PA: 200 μM OA		PA 诱发的脂质性的证据因 OA 的刺激而减少。
	价格: 2PA:1OA
	时间曝光: 24 小时
OA/PA 的混合	浓度: 400 μM PA: 200 μM OA		脂质积累		陈等人， 201823.
	价格: 2PA:1OA
	时间曝光: 24 小时
OA/PA 的混合	浓度 :50 和 500 μM		两种类型的硬化的生成:轻度硬化和 严重的硬化。		坎波斯和古兹曼 2021
	价格: 2PA:1OA		模拟脂质超载的长期阐述
	时间暴露:24小时，2天，3天和4天。

表1。肝细胞培养在造菌条件下。 该表介绍了脂肪酸的使用类型、维持的条件以及肝细胞培养的观察结果。PA:棕榈酸。欧亚:油酸。

最后，该模型不仅适用于硬化和脂肪肝的研究，还适用于在硬化背景下的肝代谢、合成和排毒途径。此外， 体外 诱发的硬化可能为确定该疾病的潜在标记和治疗靶点提供证据。

研究方案

1. 标准和有条件的中等准备

1. 要准备标准RPMI 1640，补充RPMI 1640培养介质与10%（v/v）的胎儿牛血清（FBS，以前热灭活）和1%（v/v）青霉素-链霉素溶液。使用 0.22 μm 过滤器将介质存储在 4 °C.消毒。
2. 要准备棕榈酸盐库存溶液，请在标准 RPMI 1640 中准备 50 mM 的棕榈酸盐溶液，以前补充 1% 的牛血清白蛋白（无脂）。该库存的 5-10 mL 的体积就足够了。使用 0.22 μm 过滤器对库存溶液进行消毒。在 4 °C 下存放，最长达 1 个月不受光线照射。
3. 要准备油酸盐库存溶液，请在标准 RPMI 1640 中准备 50 mM 的油酸盐溶液，该溶液以前补充了 1% 的牛血清白蛋白（无脂）。10 mL 的体积就足够了。使用 0.22 μm 过滤器对库存溶液进行消毒。在 -20 °C 下存放，最长达 1 个月不受光线照射。
4. 要从先前准备的库存中准备造血介质，准备一个 1 部分的棕榈酸盐:2 部分油酸盐造血介质介质，在两个可能的水平:轻度和重度硬化。
   1. 轻度凝血:准备 100 mL 的 1 部分棕榈酸盐:2 部分油酸盐 （50 μM） 混合在标准 RPMI 1640 中。使用 0.22 μm 过滤器进行消毒。在 4 °C 下存放长达 1 周。
   2. 严重硬化:准备 100 mL 的 1 部分棕榈酸盐:2 部分油酸盐 （500 μM） 混合在标准 RPMI 1640 中。使用 0.22 μm 过滤器进行消毒。在 4 °C 下存放长达 1 周。
   3. 股票解决方案的替代准备。
      1. 使用上述免费脂质白蛋白使用各自的脂肪酸准备两种库存溶液。
      2. 当缺乏免费脂质白蛋白时，使用棕榈酸盐和油酸盐盐。
         1. 溶解在2mL的绝对乙醇中，然后混合在标准RPMI 1640（5-10 mL）的最终体积中。通过在标准RPMI 1640培养介质中搅拌直接溶解油酸盐。
         2. 允许乙醇蒸发，在70°C的水浴中孵化;彻底混合。
      3. 在每种情况下，使用 0.22 μm 过滤器对两种库存解决方案进行消毒。将棕榈酸盐库存溶液存储在 4 °C 下，将油酸盐库存溶液存储在 - 20 °C。 保护两种解决方案免受光线照射。这些解决方案稳定 1 个月。

2. 文化前

1. 在24井板中每口井播种100，000个赫普G2细胞。添加 1 mL 标准 RPMI 1640。
2. 在 37 °C 和 5% CO 2 的₂₄ 小时预孵育，允许细胞附着。

3. 致病文化

1. 培养前后，丢弃标准RPMI 1640介质，并相应地添加造质介质。
2. 丢弃超高超剂，每24小时加入新鲜的造乳介质。

4. 可行性和死亡率评估

1. 在24井板中每口井播种100，000个赫普G2细胞。添加 1 mL 标准 RPMI 1640。
2. 在 37 °C 和 5% CO 2 下预孵育₂₄小时。
3. 改变标准RPMI 1640介质的造菌介质。
4. 每24小时孵育24小时、2天、3天和4天，每24小时刷新一次造菌介质。
5. 在适当时间后，丢弃超高等。
6. 通过添加 500 μL 的 0.05% Trypsin-EDTA 从井中分离出细胞。在 37 °C 和 5% CO₂下孵育 5 分钟。
7. 在微管中收集重新悬存的细胞。
8. 离心机在300 x g 和丢弃超高。
9. 添加 200 μL 的标准 RPMI 1640 并重新悬回电池。
10. 在新鲜的微管中加入 15 μL 的 0.4% Trypan 蓝色溶液。与之前的电池悬架的 15 μL 混合。
11. 在血细胞计中数一数染色细胞和未染色细胞。
12. 相应地计算生存能力和死亡率。
    可行性 |
    
    死亡率 |
    

5. 脂质染色与油红 O

1. 将细胞培养盖唇放入每个井的 24 井板中。
2. 每口井100，000个赫普G2细胞。添加 1 mL 标准 RPMI 1640。
3. 在 37 °C 和 5% CO 2 的₂₄ 小时预孵育。
4. 改变标准RPMI 1640介质的造菌介质。
5. 孵育24小时，2天，3天，4天，每24小时刷新一次造菌介质。
6. 在适当时间后，丢弃超高等。
7. 用 1 mL 磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 清洗。丢弃超高纳特。
8. 修复与 1 mL 的 4% 的副甲醛在 PBS。
9. 在室温下孵育1小时。
10. 丢弃过量的副甲醛。
11. 用1兆升蒸馏水冲洗细胞。
12. 加入1 mL的70%异丙酚，孵育5分钟。
13. 丢弃过量的等丙醇。此时不需要 PBS 洗涤。
14. 加入1mL油红O溶液，孵育30分钟。
15. 丢弃油红色 O 溶液的过量。
16. 用1兆升蒸馏水冲洗。
17. 添加 500 μL 血氧林溶液。孵化3分钟。
18. 丢弃过量的血氧林溶液。
19. 用1兆升蒸馏水冲洗。
20. 在显微镜下观察放大400倍（目标40倍，眼部10倍）。

6. 脂质含量的形态测量评估

1. 随机从井的整个区域选择并捕获 10 个光学场的照片。每口井重复一次。
2. 根据费雷拉和拉斯班德³³评估使用 ImageJ 软件中的颜色阈值工具的红色染色区域百分比。
3. 根据费雷拉和拉斯班德^33，使用 ImageJ 软件中的分析粒子工具将染色区域与光学场的完整区域进行比较。
4. 计算每口井的平均百分比。

结果

培养在造菌介质中培养的肝细胞在井表面显示生长:然而，脂肪肝细胞的生长速度低于控制介质培养的细胞。OA和PA的拟议比例和浓度，保证细胞在培养过程中的存活。在24井板中每口井播种1×10⁵ 个细胞，如 图1所示，提供最佳汇合。

与对照条件相比，培养细胞在造血组（轻度和重度）中的生存能力较低。事实上，随着文化时间的增加，生存能力?...

讨论

该协议旨在提供一个战略，研究体 外硬化。细胞培养是研究暴露在不同条件下的细胞的细胞、分子、生化和毒理学方面的有力工具。通过这种方法，硬化不仅可以被想象为MAFLD复杂疾病的一个阶段，而且可以被想象为肝细胞过度暴露在脂质中以及这种接触可能的结果。因此，它的应用并不局限于MAFLD的生理病理学，而是脂肪肝患者接触到治疗药物、污染物以及其他可能受硬化影响的疾病。?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Biosafety cabinet	ESCO Airstream	AC2-452+C2:C26	Class II Type A2 Biological Safety Cabinet
Bottle top filter	Corning, US	430513	Non-pyrogenic, polystyrene, sterile. 1 filter/Bag. 0.22 μm, 500 mL.
Bovine serum albimun (BSA)	Gold Biotechnology, US	A-421-10	BSA Fatty Acid Free for cell culture
Culture media RPMI 1640	ThermoFisher-Gibco, US	31800-022	-
Fetal Bovine Serum (FBS)	ThermoFisher-Gibco, US	A4766801	-
Hemocytometer	Marienfeld, DE	640010	-
HepG2 cell line	ATCC, US	HB-8065	Hepatocellular carcinoma human cells.
Humidified incubator	Thermo Electronic Corporation,US	Model: 3110	Temperature (37 °C ± 1 °C), humidity (90% ± 5%) , CO2 (5% ± 1%)
Inverted microscope Eclipse	NIKON, JPN	Model: TE2000-S	-
Isopropanol	Sigma-Aldrich, US	I9030-4L	-
Oil Red O Kit	Abcam, US	ab150678	Kit for histological visualization of neutral fat.
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich, US	P6148-500G	-
Penicillin/streptomycin	ThermoFisher-Gibco, US	15140-122	Antibiotics 10,000 U/mL Penicillin, 10,000 μg/mL Streptomycin
pH meter	Beckman, US	Model: 360 PH/Temp/MV Meter	-
Phosphate buffered saline	ThermoFisher-Gibco, US	10010-023	-
Serological Pipettes	Sarstedt, AUS	86.1253.001	Non-pyrogenic, sterile, 5 mL
Serological Pipettes	Sarstedt, AUS	86.1254.001	Non-pyrogenic, sterile, 10 mL
Sodium bicarbonate	Sigma-Aldrich, US	S5761-1KG	Preparation of culture media
Sodium oleate	Santa Cruz Biotechnology, US	sc-215879A	-
Sodium palmitate	Santa Cruz Biotechnology, US	sc-215881	-
Syring filter	Corning, US	431219	Non-pyrogenic, sterile, 28 mm, 0.2 μm.
Trypan Blue	Sigma-Aldrich, US	T6146-25G	-
Trypsin 0.05% /EDTA 0.53 mM	Corning, US	25-052-Cl	-
24 well cell culture cluster	Corning, US	3524	Flat bottom with lid. Tissue culture treated. Nonpyrogenic, polystyrene, sterile. 1/Pack.
96 well cell culture cluster	Corning, US	3599	Flat bottom with lid. Tissue culture treated. Nonpyrogenic, polystyrene, sterile. 1/Pack.