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Resumen

Este protocolo pretende ser una herramienta para estudiar la esteatosis y los cambios moleculares, bioquímicos, celulares producidos por la sobreexposición de los hepatocitos a los lípidos in vitro.

Resumen

La enfermedad del hígado graso asociada a la disfunción metabólica (MAFLD), anteriormente conocida como enfermedad del hígado graso no alcohólico (NAFLD), es la enfermedad hepática más prevalente en todo el mundo debido a su relación con la obesidad, la diabetes tipo 2 y la dislipidemia. La esteatosis hepática, la acumulación de gotas lipídicas en el parénquima hepático, es una característica clave de la enfermedad que precede a la inflamación observada en la esteatohepatitis, la fibrosis y la enfermedad hepática en etapa terminal. La acumulación de lípidos en los hepatocitos podría interferir con el metabolismo adecuado de los xenobióticos y las moléculas endógenas, así como inducir procesos celulares que conduzcan al avance de la enfermedad. Aunque el estudio experimental de la esteatosis se puede realizar in vivo, losenfoques in vitro para el estudio de la esteatosis son herramientas complementarias con diferentes ventajas. El cultivo de hepatocitos en medio condicionado por sobrecarga lipídica es una excelente opción reproducible para el estudio de la esteatosis hepática que permite la identificación de procesos celulares relacionados con la acumulación de lípidos, como tensiones oxidativas y reticulares, autofagia, proliferación, muerte celular, etcétera, así como otras pruebas que incluyen la eficacia de los fármacos y las pruebas toxicológicas, entre otras muchas posibles aplicaciones. Aquí, se tuvo como objetivo describir la metodología de cultivo de células de hepatocitos en medio condicionado por sobrecarga lipídica. Las células HepG2 se cultivaron en medio RMPI 1640 acondicionado con palmitato de sodio y oleato de sodio. Es importante destacar que la proporción de estos dos lípidos es crucial para favorecer la acumulación de gotas lipídicas, al tiempo que mantiene la proliferación celular y una tasa de mortalidad moderada, como ocurre en el hígado durante la enfermedad. Se muestra la metodología, a partir de la preparación de las existencias de solución lipídica, mezcla, adición al medio y cultivo de hepatocitos. Con este enfoque, es posible identificar gotas de lípidos en los hepatocitos que son fácilmente observables por tinción de O rojo aceite, así como curvas de tasas de proliferación / mortalidad.

Introducción

El hígado graso asociado con la disfunción metabólica es altamente prevalente en todo el mundo1,2; se estima que hasta el 25% de la población se ve afectada3. Esta enfermedad anteriormente conocida como enfermedad del hígado graso no alcohólico (EHGNA), ha actualizado su nomenclatura a disfunción metabólica asociada a la enfermedad del hígado graso (MAFLD) para reflejar con precisión la patogénesis relacionada con la obesidad, la resistencia a la insulina, la diabetes tipo 2 y la dislipidemia, así como los posibles manejos de la enfermedad3,4.

Independientemente del nombre, la enfermedad incluye un amplio espectro de cambios histopatológicos caracterizados por una acumulación anormalmente alta de lípidos en el hígado (>5% de grasa en los hepatocitos5) y podría progresar a través de la acumulación de lípidos típicamente encontrada en la esteatosis simple a esteatohepatitis, que a su vez podría conducir al desarrollo de fibrosis, cirrosis, carcinoma hepatocelular e insuficiencia hepática5,6,7,8. Debido a su creciente prevalencia, se espera que MAFLD se convierta en la primera indicación de trasplante hepático y la principal causa de carcinoma hepatocelular9.

Aunque se ha considerado como una forma benigna o leve de enfermedad del hígado graso, la esteatosis hepática es de hecho la clave metabólica en MAFLD10. Diferentes vías metabólicas se ven afectadas por la acumulación de lípidos en el hígado, incluyendo pero no limitado a la síntesis de lípidos, la exportación y el metabolismo10. La resistencia a la insulina, el estrés oxidativo, el estrés reticular y la disfunción celular están fuertemente asociados a la lipotoxicidad hepática11,12. Por otro lado, los hepatocitos grasos son el objetivo de las especies reactivas de oxígeno, haciendo metabolitos como peróxidos lipídicos, carbonilos proteicos y aductos de ácidos nucleicos13. A nivel celular, los hepatocitos grasos pueden sufrir daño mitocondrial14,senescencia celular15,apoptosis 16,piroptosis12y autofagia17,entre otros eventos.

Los hepatocitos son altamente responsables del metabolismo, la desintoxicación y la síntesis de una amplia gama de moléculas. Muchas de estas funciones podrían verse comprometidas por la acumulación de lípidos observada en la esteatosis. Por lo tanto, es de gran importancia contar con herramientas reproducibles que permitan una evaluación precisa de la esteatosis. En este sentido, los modelos in vitro son fácilmente aplicables y altamente reproducibles. La esteatosis in vitro se ha utilizado con diferentes objetivos16,18,19. Las células HepG2 son ampliamente utilizadas como línea celular de hepatocitos. Tiene ventajas como ser fácil de cultivar y bien caracterizado. Quizás, la única desventaja de las células HepG2 es el hecho de que es una línea celular cancerígena, por lo que esto debe tenerse en cuenta al analizar los resultados. Aquí, se muestra la aplicación de una mezcla de ácidos grasos muy utilizada en cultivo celular: ácido palmítico (PA) y ácido oleico (OA). Tanto la AP como la OA ofrecen resultados diferentes en la cultura20. PA (C 16:0) es el ácido graso saturado más común obtenido de la dieta16. La AF es considerada como un biomarcador de lipogénesis de novo,un paso crucial en el desarrollo de NAFLD21. La AP ha demostrado ser altamente tóxica22; por lo tanto, es posible que no se recomiende inducir esteatosis in vitro. OA (C 18:1) es un ácido graso monoinsaturado. A diferencia de la AP, se ha sugerido que la OA posee propiedades antiinflamatorias y antioxidantes, pudiendo contrarrestar la PA12. Tanto la AF como la OA son los principales ácidos grasos presentes en los triglicéridos, independientemente del estado de salud o enfermedad16. La Tabla 1 proporciona ejemplos del cultivo de hepatocitos con AF, OA y su mezcla, así como los resultados informados12,23,24,25,26,27. Otros ácidos grasos también se han utilizado en el cultivo de hepatocitos, incluyendo el ácido esteárico (C 18:0)28,29,30,ácido linoleico (C 18:1)28,30,31 y sus conjugados (CLA)28,32,ácido palmitoleico (C 16:1)29. Sin embargo, su uso se informa con menos frecuencia en la literatura, tal vez porque su abundancia hepática es menor que PA y OA16.

En conjunto, ambos ácidos grasos se asemejan a la esteatosis in vitro,proporcionando células proliferantes, con mayor muerte celular y menor viabilidad en comparación con las condiciones de control. Vale la pena mencionar que las respectivas sales de estos ácidos grasos están disponibles y también se pueden usar. Uno de los principales problemas a la hora de valorar la sobrecarga lipídica en cultivo de células hepatocitarias se da en la diferenciación entre los modelos toxicológicos y el modelo que mejor representa la esteatosis. Muchos modelos se pueden contabilizar en el primer caso. De hecho, el uso de AF solo podría considerarse entre ellos, y la alta mortalidad es el resultado más evidente12,16,23,24,25,26,27. El uso de dosis altas incluso en el caso de OA también puede considerarse como un modelo toxicológico. El protocolo aquí mostrado es mayor acorde con el desarrollo de esteatosis ya que muestra baja mortalidad en comparación con la observada en otros modelos y permite seguirlo durante varios días con acumulación progresiva de lípidos tal y como ocurre en NAFLD. La posibilidad de evaluar la esteatosis leve y grave a través de condiciones experimentales se considera otra ventaja.

Ácidos grasosCondicionesResultadosReferencia
PAPÁConcentración: 200 μMAcumulación de lípidosYan et al, 201925.
Tiempo de exposición: 24 hDaño a hepatocitos
Elevación de transaminasas
PAPÁConcentración: 50, 100 y 200 μMAcumulación de lípidosXing et al, 201924.
Tiempo de exposición: 24 h
PAPÁConcentración: 250 μM, 500 μM, 750 μM y 1.000 μMAcumulación de lípidosWang et al, 202026.
Tiempo de exposición: 24 hReducción progresiva de la viabilidad celular
Mezcla de OA/PAConcentración: 1 mMAcumulación de lípidosXiao et al, 202027.
Tiempo de exposición: 24 hNo reporta lipotoxicidad
Precio: 2OA:1PA
Mezcla de OA/PAPrimera estimulación con 200 μM y 400 μM de PA y luego segunda estimulación con 200 μM de OAAcumulación de lípidos.Zeng et al, 202012.
Concentración: 400 μM PA: 200 μM OALa evidencia de lipotoxicidad inducida por AF se redujo mediante la estimulación de la OA.
Precio: 2PA:1OA
Tiempo de exposición: 24 h
Mezcla de OA/PAConcentración: 400 μM PA: 200 μM OAAcumulación de lípidosChen et al, 201823.
Precio: 2PA:1OA
Tiempo de exposición: 24 h
Mezcla de OA/PAConcentración: 50 y 500 μMGeneración de dos tipos de esteatosis: esteatosis leve y
esteatosis severa.		Campos y Guzmán 2021
Precio: 2PA:1OASimula la exposición crónica de la sobrecarga lipídica
Tiempo de exposición: 24 h, 2 días, 3 días y 4 días.

Tabla 1. Cultivo de hepatocitos en condiciones esteatogénicas. La tabla presenta el tipo de ácido graso utilizado, las condiciones mantenidas y los resultados observados en el cultivo de hepatocitos. PA: Ácido palmítico. OA: Ácido oleico.

Finalmente, este modelo es aplicable no solo al estudio de la esteatosis y el hígado graso, sino también a las vías metabólicas hepáticas, sintéticas y de desintoxicación en el contexto de la esteatosis. Además, la esteatosis inducida in vitro podría proporcionar evidencia para la identificación de marcadores potenciales de la enfermedad, así como objetivos terapéuticos.

Protocolo

1. Preparación de medio estándar y acondicionado

  1. Para preparar el RPMI 1640 estándar, complemente el medio de cultivo RPMI 1640 con 10% (v/v) de suero fetal bovino (FBS, previamente inactivado por calor) y 1% (v/v) de solución de penicilina-estreptomicina. Conservar el medio a 4 °C.Esterilizar con filtros de 0,22 μm.
  2. Para preparar la solución de caldo de palmitato, prepare una solución de palmitato de 50 mM en el estándar RPMI 1640 previamente suplementada con 1% de albúmina sérica bovina (libre de lípidos). Un volumen de 5-10 ml de este stock será suficiente. Esterilizar la solución de material mediante el uso de filtros de 0,22 μm. Conservar a 4 °C protegido de la luz durante un tiempo límite de 1 mes.
  3. Para preparar la solución de caldo de oleato, prepare una solución de oleato de 50 mM en el estándar RPMI 1640 previamente suplementada con 1% de albúmina sérica bovina (libre de lípidos). Un volumen de 10 ml será suficiente. Esterilizar la solución de material mediante el uso de filtros de 0,22 μm. Conservar a -20 °C protegido de la luz durante un plazo de hasta 1 mes.
  4. Para preparar el medio esteatogénico a partir de las existencias preparadas previamente, prepare un palmitato de 1 parte: medio esteatogénico de oleato de 2 partes en dos niveles posibles: esteatosis leve y grave.
    1. Esteatosis leve: Preparar 100 ml de una mezcla de palmitato de 1 parte: oleato de 2 partes (50 μM) en RPMI 1640 estándar. Esterilizar mediante filtros de 0,22 μm. Conservar a 4 °C durante un tiempo de hasta 1 semana.
    2. Esteatosis severa: Prepare 100 ml de una mezcla de palmitato de 1 parte: oleato de 2 partes (500 μM) en RPMI 1640 estándar. Esterilizar mediante filtros de 0,22 μm. Conservar a 4 °C durante un tiempo de hasta 1 semana.
    3. Preparación alternativa para las soluciones de stock.
      1. Prepare ambas soluciones de caldo utilizando los ácidos grasos respectivos mediante el uso de albúmina lipídica libre como se indicó anteriormente.
      2. Cuando carezca de albúmina lipídica libre, use sales de palmitato y oleato.
        1. Disuelva el palmitato o el oleato en 2 ml de etanol absoluto y luego mezcle el volumen final del RPMI 1640 estándar (5-10 ml). Disolver el oleato directamente agitando en el medio de cultivo estándar RPMI 1640.
        2. Permitir la evaporación del etanol incubando en un baño de agua a 70 °C; Homogeneizar.
      3. En todos los casos, esterilice ambas soluciones de stock utilizando filtros de 0,22 μm. Almacene la solución de caldo de palmitato a 4 °C y la solución de caldo de oleato a - 20 °C. Proteja ambas soluciones de la luz. Estas soluciones son estables durante 1 mes.

2. Pre-cultura

  1. Seed 100.000 células HepG2 por pozo en una placa de 24 pozos. Agregue 1 ml de RPMI 1640 estándar.
  2. Preincubar a 37 °C y 5% de CO2 durante 24 h, permitiendo la unión celular.

3. Cultivo esteatogénico

  1. Después del precultivo, deseche el medio estándar RPMI 1640 y agregue el medio esteatogénico en consecuencia.
  2. Deseche el sobrenadante y agregue el medio esteatogénico fresco cada 24 h.

4. Evaluación de la viabilidad y la mortalidad

  1. Seed 100.000 células HepG2 por pozo en una placa de 24 pozos. Agregue 1 ml de RPMI 1640 estándar.
  2. Preincubar durante 24 h a 37 °C y 5% CO2.
  3. Cambie el medio estándar RPMI 1640 por el medio esteatogénico.
  4. Incubar durante 24 h, 2 días, 3 días y 4 días refrescando el medio esteatogénico cada 24 h.
  5. Después del tiempo apropiado, deseche el sobrenadante.
  6. Separe las células del pozo agregando 500 μL de Tripsina-EDTA al 0,05%. Incubar durante 5 min a 37 °C y 5% CO2.
  7. Recoge las células resuspendidas en un microtubo.
  8. Centrifugar a 300 x g y desechar el sobrenadante.
  9. Agregue 200 μL de RPMI 1640 estándar y resuspenda las células.
  10. Añadir 15 μL de solución de azul de tripano al 0,4% en un microtubo fresco. Mezclar con 15 μL de la suspensión celular anterior.
  11. Cuente las células teñidas y no teñidas en un hemocitómetro.
  12. Calcule las tasas de viabilidad y mortalidad en consecuencia.
    Viabilidad =
    figure-protocol-4412
    Mortalidad =
    figure-protocol-4498

5. Tinción lipídica con Oil-Red O

  1. Coloque una cubierta de cultivo celular en cada pozo en una placa de 24 pozos.
  2. Seed 100.000 células HepG2 por pozo. Agregue 1 ml de RPMI 1640 estándar.
  3. Preincubar a 37 °C y 5% co2 durante 24 h.
  4. Cambie el medio estándar RPMI 1640 por el medio esteatogénico.
  5. Incubar durante 24 h, 2 días, 3 días y 4 días, refrescando el medio esteatogénico cada 24 h.
  6. Después del tiempo apropiado, deseche el sobrenadante.
  7. Lavar con 1 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS). Deseche el sobrenadante.
  8. Fijar con 1 mL de paraformaldehído al 4% en PBS.
  9. Incubar durante 1 h a temperatura ambiente.
  10. Desechar el exceso de paraformaldehído.
  11. Enjuague las células con 1 ml de agua destilada.
  12. Añadir 1 ml de isopropanol al 70% e incubar durante 5 min.
  13. Deseche el exceso de isopropanol. Un lavado de PBS no es necesario en este momento.
  14. Añadir 1 ml de solución de O rojo aceite e incubar durante 30 min.
  15. Deseche el exceso de la solución de O rojo aceite.
  16. Enjuague con 1 ml de agua destilada.
  17. Añadir 500 μL de solución de hematoxilina. Incubar durante 3 min.
  18. Deseche el exceso de solución de hematoxilina.
  19. Enjuague con 1 ml de agua destilada.
  20. Observar bajo el microscopio a un aumento de 400x (Objetivo 40x, Ocular 10x).

6. Evaluación morfométrica del contenido lipídico

  1. Seleccione y capture aleatoriamente fotografías de 10 campos ópticos del área completa del pozo. Repetir para cada pozo.
  2. Evalúe el porcentaje de área teñida de rojo utilizando la herramienta Umbral de color en el software ImageJ de acuerdo con Ferreira y Rasband33.
  3. Compare el área teñida con el área completa del campo óptico utilizando la herramienta Analizar partículas en el software ImageJ según Ferreira y Rasband33.
  4. Calcule el porcentaje promedio de cada pozo.

Resultados

Los hepatocitos cultivados en el medio esteatogénico muestran crecimiento en toda la superficie del pozo; sin embargo, los hepatocitos grasos muestran una tasa de crecimiento más baja en comparación con las células cultivadas en medio de control. La relación y concentración propuesta de OA y PA, garantizan la supervivencia celular durante el cultivo. La siembra de 1 x 105 células por pozo en placas de 24 pozos proporciona una confluencia óptima como se muestra en la Figura 1.

Discusión

Este protocolo pretende proporcionar una estrategia para estudiar la esteatosis in vitro. El cultivo celular es una herramienta poderosa para estudiar aspectos celulares, moleculares, bioquímicos y toxicológicos de las células expuestas a diferentes condiciones. Con este enfoque, la esteatosis se puede visualizar no solo como una etapa de la enfermedad compleja que es MAFLD, sino también como la sobreexposición de los hepatocitos a los lípidos y los posibles resultados resultantes de dicha exposición. Por...

Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Este trabajo fue financiado por el Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (Conacyt, CB-221137). Adriana Campos es estudiante de doctorado en el Programa de Doctorado en Ciencias Biomédicas, Universidad Nacional Autónoma de México, y contó con el apoyo del Conacyt (CVU: 1002502).

Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
Biosafety cabinetESCO AirstreamAC2-452+C2:C26Class II Type A2 Biological Safety Cabinet
Bottle top filterCorning, US430513 Non-pyrogenic, polystyrene, sterile. 1 filter/Bag. 0.22 μm, 500 mL.
Bovine serum albimun (BSA)Gold Biotechnology, USA-421-10BSA Fatty Acid Free for cell culture
Culture media RPMI 1640ThermoFisher-Gibco, US31800-022-
Fetal Bovine Serum (FBS)ThermoFisher-Gibco, USA4766801-
HemocytometerMarienfeld, DE640010-
HepG2 cell lineATCC, USHB-8065Hepatocellular carcinoma human cells.
Humidified incubatorThermo Electronic Corporation,USModel: 3110Temperature (37 °C ± 1 °C), humidity (90% ± 5%) , CO2 (5% ± 1%)
Inverted microscope EclipseNIKON, JPNModel: TE2000-S-
IsopropanolSigma-Aldrich, USI9030-4L-
Oil Red O KitAbcam, USab150678Kit for histological visualization of neutral fat.
ParaformaldehydeSigma-Aldrich, USP6148-500G-
Penicillin/streptomycinThermoFisher-Gibco, US15140-122Antibiotics 10,000 U/mL Penicillin, 10,000 μg/mL Streptomycin
pH meterBeckman, USModel: 360 PH/Temp/MV Meter-
Phosphate buffered salineThermoFisher-Gibco, US10010-023-
Serological PipettesSarstedt, AUS86.1253.001 Non-pyrogenic, sterile, 5 mL
Serological PipettesSarstedt, AUS 86.1254.001 Non-pyrogenic, sterile, 10 mL
Sodium bicarbonateSigma-Aldrich, USS5761-1KGPreparation of culture media
Sodium oleateSanta Cruz Biotechnology, USsc-215879A-
Sodium palmitateSanta Cruz Biotechnology, USsc-215881-
Syring filterCorning, US431219 Non-pyrogenic, sterile, 28 mm, 0.2 μm.
Trypan BlueSigma-Aldrich, UST6146-25G-
Trypsin 0.05% /EDTA 0.53 mMCorning, US25-052-Cl-
24 well cell culture clusterCorning, US3524Flat bottom with lid. Tissue culture treated. Nonpyrogenic, polystyrene, sterile. 1/Pack.
96 well cell culture clusterCorning, US3599Flat bottom with lid. Tissue culture treated. Nonpyrogenic, polystyrene, sterile. 1/Pack.

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