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요약

이 프로토콜은 체외에서지질에 간세포의 과잉 노출에 의해 생성 된 steatosis 및 분자, 생화학, 세포 변화를 연구하는 도구가 될 것입니다.

초록

이전에 비알코올성 지방간 질환(NAFLD)으로 알려진 대사 기능 장애 관련 지방간 질환(MAFLD)은 비만, 당뇨병 제2형 및 이상지질혈증과의 관계로 인해 전 세계적으로 가장 널리 퍼진 간 질환입니다. 간 절제기증에 지질 방울의 축적인 간 질비증은, 염자 간염, 섬유증 및 말기 간 질환에서 관찰되는 염증을 선행하는 질병의 주요 특징이다. 간세포에 지질 축적은 xenobiotics와 내인성 분자의 적절한 신진 대사를 방해할 뿐만 아니라 질병의 진보로 이어지는 세포 과정을 유도할 수 있습니다. steatosis의 실험 연구는 생체 내에서수행 될 수 있지만, 스테토시스의 연구에 대한 체외 접근은 다른 장점을 가진 보완 도구입니다. 지질 과부하 조절 배지의 간세포 배양은 산화 및 망상 응력, 자가식, 증식, 세포사멸, 등등 지질 축적과 관련된 세포 과정의 식별을 허용하는 간 간 스테토시스 연구를 위한 우수한 재현 가능한 옵션뿐만 아니라 약물 효과성, 독성 검사 등 다른 많은 응용 분야 중에서도 볼 수 있다. 여기서, 지질 과부하 조절 배지에서 간세포 배양의 방법론을 기술하는 것을 목표로 하였다. HepG2 세포는 팔미타트 나트륨과 올레아테 나트륨으로 조절된 RMPI 1640 배지에서 배양되었다. 중요한 것은, 이 2개의 지질의 비율은 질병 도중 간에서 생기는 것과 같이 세포 증식 및 적당한 사망률을 유지하면서 지질 물방울 축적을 선호하기 위하여 중요합니다. 방법론은, 지질용액주식의 제조로부터, 혼합물, 배지, 및 간세포 배양에 첨가된 것이 도시된다. 이 접근법으로, 오일 레드 O 스테인링에 의해 쉽게 관찰 할 수있는 간세포에서 지질 방울뿐만 아니라 증식 / 사망률의 곡선을 식별 할 수 있습니다.

서문

신진 대사 기능 장애와 관련 된 지방 간은 전 세계적으로 매우 널리 퍼집니다1,2; 인구의 최대 25%가3에영향을 받는 것으로 추정됩니다. 이전에 비알코올성 지방간질환(NAFLD)으로 알려진 이 질환은 비만, 인슐린 저항성, 당뇨병형 2형, 이상지질혈증과 관련된 병발생을 정확하게 반영하기 위해 대사 기능 장애관련 지방간질환(MAFLD)에 대한 명칭을 업데이트하고 있으며, 질병3,4의가능한 관리와 함께 가능하다.

이름에 관계없이, 질병은 간에서 지질의 비정상적으로 높은 축적을 특징으로 하는 조직 병리학적 변화의 넓은 스펙트럼을 포함 (>5% 간세포에서 지방의 지방의5)그리고 일반적으로 간단한 steatosis에서 발견 지질 축적을 통해 진행 될 수 있습니다., 차례로 섬유증의 개발로 이어질 수 있습니다., cirrhis, cirrhisis의 개발로 이어질 수 있습니다. 간세포 암및 간부전5,6,7,8. 그것의 증가 보급 때문에, MAFLD는 간 이식의 첫번째 표시 및 간세포암9의주요한 원인이 될 것으로 예상됩니다.

그것은 지방 간 질환의 양성 또는 온화한 형태로 간주 되었지만, 간 steatosis는 사실 MAFLD에서 신진 대사 키10. 다른 신진 대사 경로는 간에서 지질 축적에 의해 영향을 받습니다., 포함 하 여 하지만 지질 합성에 제한, 수출, 그리고 신진 대사10. 인슐린 저항성, 산화 스트레스, 망상 스트레스 및 세포 기능 장애는 간 리포독성(11,12)과강하게 연관된다. 한편, 지방 간세포는 반응성 산소 종의 표적으로, 지질 과산화물, 단백질 탄산염 및핵산(13)의부관으로 대사산물을 렌더링한다. 세포 수준에서, 지방 간세포는 미토콘드리아손상(14,세포 노화15,세포 노화16,파이롭토시스12,및자가식(17)을겪을 수 있다.

간세포는 신진 대사에 대 한 높은 책임, 해독, 그리고 분자의 넓은 범위의 합성. 이러한 기능의 대부분은 steatosis에서 관찰 된 지질 축적에 의해 손상 될 수 있습니다. 따라서 steatosis를 정확하게 평가할 수 있는 재현 가능한 도구를 갖는 것이 매우 중요합니다. 이러한 의미에서 체외 모델은 쉽게 적용 가능하고 재현성이 높습니다. 체외에서 Steatosis는 다른 목표와 함께 사용 되었습니다16,18,19. HepG2 세포는 간세포 세포주로서 널리 사용된다. 문화가 쉽고 잘 특징지어지는 등의 장점이 있습니다. 아마도 HepG2 세포의 유일한 단점은 발암 세포주라는 사실이므로 결과를 분석 할 때 고려해야합니다. 여기서, 세포 배양에 널리 사용되는 지방산의 혼합물의 적용이 도시된다: 팔미산(PA) 및 올레산(OA)이 도시된다. PA와 OA 모두 문화20에서다른 결과를 제공합니다. PA(C 16:0)는 다이어트16에서얻은 가장 흔한 포화 지방산이다. PA는 NAFLD21의개발에 중요한 단계인 드노보 리포게네시스의바이오마커로 간주됩니다. PA는 매우 독성이 높은 것으로 나타났다22; 따라서 시험관내에서스테토시스를 유도하는 것이 좋습니다. OA (C 18:1)는 단일 불포화 지방산이다. PA와 는 달리, OA는 항 염증 및 산화 성분을 소유하는 것이 제안되었으며 PA12에중화할 수 있습니다. PA와 OA 는 모두 건강 또는질병(16)의상태에 관계없이 트리글리세라이드에 존재하는 주요 지방산이다. 표 1은 PA, OA 및 그 혼합물을 가진 간세포 배양의 예를 제공하며,12,23,24,25,26,27을보고한 결과도 제공한다. 다른 지방산은 또한 스테레산(C 18:0)28,29,30,리놀레산(C 18:1)28,30,31 및 그 컨쥬게이트(CLA)28,32,팔미톨레산(C 16:1)29를포함하는 간세포 배양에도 사용되어 왔다. 그러나, 그들의 사용은 문헌에서 가장 자주 보고됩니다, 아마도 그들의 간 풍부가 PA와 OA16보다는 더 낮기 때문에.

함께, 두 지방산은 시험관 내의 스테토시스와 유사하여, 증식 세포를 제공하며, 세포 사망률이 증가하고 대조군 조건에 비해 생존가능성이 낮습니다. 이러한 지방산의 각 염분도 사용할 수 있으며 사용할 수 있다는 점을 언급할 가치가 있습니다. 간세포 배양에서 지질 과부하를 평가할 때 주요 문제 중 하나는 독성 모델과 스테토시스를 가장 잘 나타내는 모델 간의 분화에서 주어진다. 첫 번째 경우많은 모델을 설명할 수 있습니다. 사실, PA의 사용만으로도 그 중에서도 고려될 수 있으며, 사망률이 가장 높은 결과는12,16,23,24,25,26, 26,27로가장 뚜렷한 결과이다. OA의 경우에도 고용량의 사용은 독성 모델로 간주 될 수있다. 여기에 표시된 프로토콜은 다른 모델에서 관찰된 것과 비교하여 낮은 사망률을 나타내고 NAFLD에서 발생하는 점진적 지질 축적으로 며칠 동안 따를 수 있기 때문에 steatosis 발달에 따라 더 높습니다. 실험 조건을 통해 경미하고 가혹한 steatosis를 평가하는 가능성은 또 다른 이점으로 간주됩니다.

지방산여건결과참조
PA농도: 200 μM지질 축적Yan et al, 201925.
시간 노출: 24 시간간세포 손상
트라미나제 고도
PA농도: 50, 100 및 200 μM지질 축적Xing 외, 201924.
시간 노출: 24 시간
PA농도: 250 μM, 500 μM, 750 μM 및 1,000 μM지질 축적왕 외, 202026.
시간 노출: 24 시간세포 생존가능성의 점진적 감소
OA/PA의 혼합농도: 1 mM지질 축적샤오 외, 202027.
시간 노출: 24 시간리포 독성을 보고하지 않음
요금: 2OA:1PA
OA/PA의 혼합PA 200 μM 및 400 μM의 첫 번째 자극 및 OA 200 μM의 두 번째 자극지질 축적.Zeng 외, 202012.
농도:400 μM PA: 200 μM OAPA에 의해 유도된 지방 독성의 증거는 OA의 자극에 의해 감소되었다.
요금: 2PA:1OA
시간 노출: 24 시간
OA/PA의 혼합농도: 400 μM PA: 200 μM OA지질 축적첸 외, 201823.
요금: 2PA:1OA
시간 노출: 24 시간
OA/PA의 혼합농도 :50 및 500 μM두 가지 유형의 스테토시스 의 생성 : 온화한 스테토시스와
심한 스테토시스.		캄포스와 구즈만 2021
요금: 2PA:1OA지질 과부하의 만성 박람회 시뮬레이션
시간 노출: 24시간, 2일, 3일, 4일.

표 1. 스테토원성 조건에서 간세포 배양. 표는 사용된 지방산의 모형, 유지된 조건 및 간세포 배양에 있는 관찰된 결과를 제시합니다. PA: 팔미산. OA: 올레산.

마지막으로,이 모델은 steatosis와 지방 간뿐만 아니라 steatosis의 맥락에서 간 대사, 합성 및 해독 경로에 적용 할 수 있습니다. 또한, 체외 유도 된 steatosis 질병의 잠재적인 마커뿐만 아니라 치료 대상의 식별에 대 한 증거를 제공할 수 있습니다.

프로토콜

1. 표준 및 조건된 중간 준비

  1. 표준 RPMI 1640을 준비하기 위해, 페니실린-스트렙토마이신 용액의 10% (v/v) 및 페니실린-스트렙토마이신 용액의 1%(v/v)를 보충한다. 0.22 μm 필터를 사용하여 매체를 4°C.에 저장합니다.
  2. 팔미타테 스톡 솔루션을 준비하려면 이전에 소 세럼 알부민(지질 프리)의 1%로 보충된 표준 RPMI 1640에서 50mMMM 의 팔미타테 솔루션을 준비합니다. 이 주식의 5-10 mL의 부피로 충분합니다. 0.22 μm 필터를 사용하여 스톡 용액을 살균합니다. 최대 1개월 동안 빛으로부터 보호된 4°C에 보관하십시오.
  3. 올레아테 스톡 솔루션을 준비하려면, 이전에 소 세럼 알부민 (지질 무료)의 1 %로 보충 된 표준 RPMI 1640에서 올레아테의 50 mM 솔루션을 준비합니다. 10mL의 부피가 충분합니다. 0.22 μm 필터를 사용하여 스톡 용액을 살균합니다. 최대 1개월 동안 빛으로부터 보호 -20°C에 보관하십시오.
  4. 이전에 준비된 주식에서 스테토겐성 배지를 준비하려면 1부 팔미타테(2부 올레아테 스테토겐성 배지)를 2부로 준비합니다.
    1. 온화한 Steatosis: 1 부 팔미타테의 100 mL를 준비: 표준 RPMI 1640에 2 부 올레아테 (50 μM) 믹스. 0.22 μm 필터를 사용하여 살균하십시오. 최대 1 주일 동안 4 °C에 보관하십시오.
    2. 심한 Steatosis: 1부 팔미타테 100mL 준비: 표준 RPMI 1640에서 2부 올레아테(500 μM) 믹스를 준비한다. 0.22 μm 필터를 사용하여 살균하십시오. 최대 1 주일 동안 4 °C에 보관하십시오.
    3. 주식 솔루션에 대한 대체 준비.
      1. 상기와 같이 자유지질 알부민을 사용하여 각각의 지방산을 사용하여 두 가지 스톡 솔루션을 모두 준비한다.
      2. 무료 지질 알부민이 부족한 경우 팔미타테와 올레아테 소금을 사용하십시오.
        1. 절대 에탄올2mL에 팔미타제 또는 올레아테를 녹인 다음 표준 RPMI 1640(5-10mL)의 최종 부피에 섞는다. 표준 RPMI 1640 배양 배지에서 교반하여 직접 올레아테를 녹입니다.
        2. 70°C에서 수조에서 배양하여 에탄올의 증발을 허용; 완전히 섞으세요.
      3. 모든 경우에 0.22 μm 필터를 사용하여 두 스톡 솔루션을 모두 소독합니다. 팔미타테 스톡 용액을 4°C에 저장하고 20°C에서 재고 용액을 올레아테합니다. 두 솔루션을 모두 빛으로부터 보호합니다. 이러한 솔루션은 1개월 동안 안정적입니다.

2. 문화 이전

  1. 24웰 플레이트에서 잘 당 100,000 HepG2 세포를 시드. 표준 RPMI 1640의 1mL을 추가합니다.
  2. 24시간 동안 37°C 및 5% CO2에서 사전 배양하여 세포 부착을 허용합니다.

3. 스테토제닉 문화

  1. 사전 배양 후 표준 RPMI 1640 배지를 폐기하고 그에 따라 스테토겐성 배지를 추가합니다.
  2. 상체를 버리고 24 시간마다 신선한 steatogenic 배지를 추가하십시오.

4. 생존 능력 및 사망률 평가

  1. 24웰 플레이트에서 잘 당 100,000 HepG2 세포를 시드. 표준 RPMI 1640의 1mL을 추가합니다.
  2. 37°C에서 24시간 및 5% CO2에대한 사전 배양.
  3. steatogenic 배지에 대한 표준 RPMI 1640 배지를 변경합니다.
  4. 24시간, 2일, 3일, 4일 동안 배양하여 24시간마다 스테토겐성 배지를 상쾌하게 한다.
  5. 적절한 시간 후에 는 상체를 폐기하십시오.
  6. 0.05%의 500 μL을 트립신-EDTA의 500 μL을 추가하여 우물에서 세포를 분리합니다. 37°C에서 5분, CO25% 배양한다.
  7. 마이크로튜브에서 재중단된 세포를 수집합니다.
  8. 300 x g의 원심 분리기와 상체를 폐기하십시오.
  9. 표준 RPMI 1640의 200 μL을 추가하고 셀을 다시 일시 중지합니다.
  10. 신선한 마이크로튜브에 0.4% 트립팬 블루 용액 15μL을 추가합니다. 이전 셀 서스펜션의 15 μL과 섞는다.
  11. 혈종계에 얼룩진 및 비염색세포를 계산합니다.
  12. 그에 따라 생존율과 사망률을 계산합니다.
    생존 가능성 =
    figure-protocol-2451
    사망률 =
    figure-protocol-2530

5. 오일 레드 O와 지질 염색

  1. 24웰 플레이트에 모든 웰에 세포 배양 커버슬립을 넣습니다.
  2. 씨앗 100,000 잘 당 HepG2 세포. 표준 RPMI 1640의 1mL을 추가합니다.
  3. 37°C에서 사전 배양하고 24시간 동안 5%CO2를 배양합니다.
  4. steatogenic 배지에 대한 표준 RPMI 1640 배지를 변경합니다.
  5. 24시간, 2일, 3일, 4일 동안 배양하고, 24시간마다 스테토겐성 배지를 상쾌하게 한다.
  6. 적절한 시간 후에 는 상체를 폐기하십시오.
  7. 인산완충식식염(PBS)의 1mL로 세척합니다. 상부체를 폐기합니다.
  8. PBS에서 4 % 파라 포름 알데히드의 1 mL로 수정하십시오.
  9. 실온에서 1시간 동안 배양합니다.
  10. 파라포름알데히드의 과잉을 폐기하십시오.
  11. 증류수 1mL로 세포를 헹구는 다.
  12. 70% 이소프로판올 1mL을 넣고 5분 동안 배양합니다.
  13. 이소프로판올의 과잉을 버리십시오. 이 시점에서 PBS 세척이 필요하지 않습니다.
  14. 오일 레드 O 용액 1mL을 넣고 30분 동안 배양합니다.
  15. 오일 레드 O 용액의 초과를 폐기합니다.
  16. 증류수 1mL로 헹구는 다.
  17. 헤마톡슬린 용액 500 μL을 추가합니다. 3 분 동안 배양하십시오.
  18. 헤마톡슬린 용액의 과잉을 버리십시오.
  19. 증류수 1mL로 헹구는 다.
  20. 400x배율(목표 40배, 안구 10x)에서 현미경으로 관찰하십시오.

6. 지질 함량의 형태측정 평가

  1. 웰의 전체 영역에서 10개의 광학 필드의 사진을 무작위로 선택하고 캡처합니다. 모든 우물에 대해 반복합니다.
  2. 페레이라(33)에따라 ImageJ 소프트웨어의 색상 임계값 도구를 사용하여 빨간색 스테인드 영역의 백분율을 평가한다.
  3. 페레이라(33)에따라 ImageJ 소프트웨어의 입자 분석 도구를 사용하여 스테인드 영역을 광학 분야의 전체 영역과 비교한다.
  4. 모든 우물의 평균 백분율을 계산합니다.

결과

간세포는 우물의 표면 전체에 걸쳐 성장하는 스테토생 성 배지 디스플레이에서 배양; 그러나, 지방 간세포는 제어 매체에서 배양된 세포에 비해 더 낮은 성장속도를 보여줍니다. OA 및 PA의 제안 된 비율 및 농도는 배양 중에 세포 생존을 보장합니다. 24웰 플레이트에서 잘 매리면 1 x 105 세포를 파종하면 도 1에도시된 바와 같이 최적의 인플루엔자 역할을 한다.

토론

이 프로토콜은 시험관 내에서steatosis를 연구하는 전략을 제공하기 위한 것입니다. 세포 배양은 세포, 분자, 생화학 및 다른 조건에 노출된 세포의 독성학적 측면을 연구하는 강력한 도구입니다. 이 접근법으로, steatosis는 MAFLD인 복잡한 질병의 단계로뿐만 아니라 지질에 대한 간세포 과다 노출 및 그러한 노출로 인한 가능한 결과로 도포될 수 있습니다. 따라서, 그것의 응용 프로그램은 MAFLD의...

공개

저자는 공개 할 것이 없습니다.

감사의 말

이 작품은 콘세조 나시오날 드 시엔시아 y Tecnología (코나시트, CB-221137)에 의해 투자되었다. 아드리아나 캄포스는 플라스타 드 닥터라도 엔 시엔시아스 비오메디카, 유니버시다드 나시오날 오토노마 데 멕시코의 박사 과정 학생이며, 코나시트(CVU: 1002502)의 지원을 받았습니다.

자료

NameCompanyCatalog NumberComments
Biosafety cabinetESCO AirstreamAC2-452+C2:C26Class II Type A2 Biological Safety Cabinet
Bottle top filterCorning, US430513 Non-pyrogenic, polystyrene, sterile. 1 filter/Bag. 0.22 μm, 500 mL.
Bovine serum albimun (BSA)Gold Biotechnology, USA-421-10BSA Fatty Acid Free for cell culture
Culture media RPMI 1640ThermoFisher-Gibco, US31800-022-
Fetal Bovine Serum (FBS)ThermoFisher-Gibco, USA4766801-
HemocytometerMarienfeld, DE640010-
HepG2 cell lineATCC, USHB-8065Hepatocellular carcinoma human cells.
Humidified incubatorThermo Electronic Corporation,USModel: 3110Temperature (37 °C ± 1 °C), humidity (90% ± 5%) , CO2 (5% ± 1%)
Inverted microscope EclipseNIKON, JPNModel: TE2000-S-
IsopropanolSigma-Aldrich, USI9030-4L-
Oil Red O KitAbcam, USab150678Kit for histological visualization of neutral fat.
ParaformaldehydeSigma-Aldrich, USP6148-500G-
Penicillin/streptomycinThermoFisher-Gibco, US15140-122Antibiotics 10,000 U/mL Penicillin, 10,000 μg/mL Streptomycin
pH meterBeckman, USModel: 360 PH/Temp/MV Meter-
Phosphate buffered salineThermoFisher-Gibco, US10010-023-
Serological PipettesSarstedt, AUS86.1253.001 Non-pyrogenic, sterile, 5 mL
Serological PipettesSarstedt, AUS 86.1254.001 Non-pyrogenic, sterile, 10 mL
Sodium bicarbonateSigma-Aldrich, USS5761-1KGPreparation of culture media
Sodium oleateSanta Cruz Biotechnology, USsc-215879A-
Sodium palmitateSanta Cruz Biotechnology, USsc-215881-
Syring filterCorning, US431219 Non-pyrogenic, sterile, 28 mm, 0.2 μm.
Trypan BlueSigma-Aldrich, UST6146-25G-
Trypsin 0.05% /EDTA 0.53 mMCorning, US25-052-Cl-
24 well cell culture clusterCorning, US3524Flat bottom with lid. Tissue culture treated. Nonpyrogenic, polystyrene, sterile. 1/Pack.
96 well cell culture clusterCorning, US3599Flat bottom with lid. Tissue culture treated. Nonpyrogenic, polystyrene, sterile. 1/Pack.

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