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Ce protocole se veut un outil d’étude de la stéatose et des changements moléculaires, biochimiques, cellulaires produits par la surexposition des hépatocytes aux lipides in vitro.
La stéatose hépatique associée au dysfonctionnement métabolique (MAFLD), précédemment connue sous le nom de stéatose hépatique non alcoolique (NAFLD), est la maladie du foie la plus répandue dans le monde en raison de sa relation avec l’obésité, le diabète de type 2 et la dyslipidémie. La stéatose hépatique, l’accumulation de gouttelettes lipidiques dans le parenchyme hépatique, est une caractéristique clé de la maladie précédant l’inflammation observée dans la stéatohépatite, la fibrose et la maladie hépatique terminale. L’accumulation de lipides dans les hépatocytes pourrait interférer avec le métabolisme approprié des xénobiotiques et des molécules endogènes, ainsi que pour induire des processus cellulaires conduisant à l’avancée de la maladie. Bien que l’étude expérimentale de la stéatose puisse être réalisée in vivo,les approches in vitro pour l’étude de la stéatose sont des outils complémentaires avec différents avantages. La culture d’hépatocytes dans un milieu conditionné par surcharge lipidique est une excellente option reproductible pour l’étude de la stéatose hépatique permettant l’identification des processus cellulaires liés à l’accumulation de lipides, tels que les stress oxydatifs et réticulaires, l’autophagie, la prolifération, la mort cellulaire, etc., ainsi que d’autres tests, y compris l’efficacité des médicaments et les tests toxicologiques, parmi de nombreuses autres applications possibles. Ici, il s’agissait de décrire la méthodologie de la culture de cellules hépatocytaires dans un milieu conditionné par une surcharge lipidique. Les cellules HepG2 ont été cultivées dans un milieu RMPI 1640 conditionné avec du palmitate de sodium et de l’oléate de sodium. Il est important de noter que le rapport de ces deux lipides est crucial pour favoriser l’accumulation de gouttelettes lipidiques, tout en maintenant la prolifération cellulaire et un taux de mortalité modéré, comme cela se produit dans le foie pendant la maladie. La méthodologie, à partir de la préparation des stocks de solution lipidique, du mélange, de l’addition au milieu et de la culture d’hépatocytes est montrée. Avec cette approche, il est possible d’identifier les gouttelettes lipidiques dans les hépatocytes qui sont facilement observables par coloration O rouge huile, ainsi que les courbes des taux de prolifération / mortalité.
La stéatose hépatique associée à un dysfonctionnement métabolique est très répandue dans le mondeentier 1,2; on estime que jusqu’à 25% de la population est touchée3. Cette maladie précédemment connue sous le nom de stéatose hépatique non alcoolique (NAFLD), a mis à jour sa nomenclature pour la stéatose hépatique associée au dysfonctionnement métabolique (MAFLD) afin de refléter avec précision la pathogenèse liée à l’obésité, à la résistance à l’insuline, au diabète de type 2 et à la dyslipidémie, ainsi que les prises en charge possibles de la maladie3,....
1. Préparation de milieu standard et conditionné
Les hépatocytes cultivés dans le milieu stéatogène présentent une croissance sur toute la surface du puits; cependant, les hépatocytes gras présentent un taux de croissance inférieur à celui des cellules cultivées en milieu témoin. Le rapport et la concentration proposés d’arthrose et d’AP garantissent la survie cellulaire pendant la culture. L’ensemencement de 1 x10 5 cellules par puits dans des plaques de 24 puits permet une confluence optimale comme le montre la figure.......
Ce protocole vise à fournir une stratégie pour étudier la stéatose in vitro. La culture cellulaire est un outil puissant pour étudier les aspects cellulaires, moléculaires, biochimiques et toxicologiques des cellules exposées à différentes conditions. Avec cette approche, la stéatose peut être visualisée non seulement comme un stade de la maladie complexe qu’est la MAFLD, mais aussi comme la surexposition hépatocytaire aux lipides et les résultats possibles résultant d’une telle exposition. Pa.......
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Ce travail a été financé par le Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (Conacyt, CB-221137). Adriana Campos est doctorante au Programa de Doctorado en Ciencias Biomédicas, Universidad Nacional Autónoma de México, et a été soutenue par Conacyt (CVU: 1002502).
....Name | Company | Catalog Number | Comments |
Biosafety cabinet | ESCO Airstream | AC2-452+C2:C26 | Class II Type A2 Biological Safety Cabinet |
Bottle top filter | Corning, US | 430513 | Non-pyrogenic, polystyrene, sterile. 1 filter/Bag. 0.22 μm, 500 mL. |
Bovine serum albimun (BSA) | Gold Biotechnology, US | A-421-10 | BSA Fatty Acid Free for cell culture |
Culture media RPMI 1640 | ThermoFisher-Gibco, US | 31800-022 | - |
Fetal Bovine Serum (FBS) | ThermoFisher-Gibco, US | A4766801 | - |
Hemocytometer | Marienfeld, DE | 640010 | - |
HepG2 cell line | ATCC, US | HB-8065 | Hepatocellular carcinoma human cells. |
Humidified incubator | Thermo Electronic Corporation,US | Model: 3110 | Temperature (37 °C ± 1 °C), humidity (90% ± 5%) , CO2 (5% ± 1%) |
Inverted microscope Eclipse | NIKON, JPN | Model: TE2000-S | - |
Isopropanol | Sigma-Aldrich, US | I9030-4L | - |
Oil Red O Kit | Abcam, US | ab150678 | Kit for histological visualization of neutral fat. |
Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich, US | P6148-500G | - |
Penicillin/streptomycin | ThermoFisher-Gibco, US | 15140-122 | Antibiotics 10,000 U/mL Penicillin, 10,000 μg/mL Streptomycin |
pH meter | Beckman, US | Model: 360 PH/Temp/MV Meter | - |
Phosphate buffered saline | ThermoFisher-Gibco, US | 10010-023 | - |
Serological Pipettes | Sarstedt, AUS | 86.1253.001 | Non-pyrogenic, sterile, 5 mL |
Serological Pipettes | Sarstedt, AUS | 86.1254.001 | Non-pyrogenic, sterile, 10 mL |
Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich, US | S5761-1KG | Preparation of culture media |
Sodium oleate | Santa Cruz Biotechnology, US | sc-215879A | - |
Sodium palmitate | Santa Cruz Biotechnology, US | sc-215881 | - |
Syring filter | Corning, US | 431219 | Non-pyrogenic, sterile, 28 mm, 0.2 μm. |
Trypan Blue | Sigma-Aldrich, US | T6146-25G | - |
Trypsin 0.05% /EDTA 0.53 mM | Corning, US | 25-052-Cl | - |
24 well cell culture cluster | Corning, US | 3524 | Flat bottom with lid. Tissue culture treated. Nonpyrogenic, polystyrene, sterile. 1/Pack. |
96 well cell culture cluster | Corning, US | 3599 | Flat bottom with lid. Tissue culture treated. Nonpyrogenic, polystyrene, sterile. 1/Pack. |
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