מודל של סטאטוזיס ניסיוני במבחנה: תרבית תאי הפטוציט במדיום מותנה בעומס יתר של שומנים

Summary

פרוטוקול זה נועד להיות כלי לחקר סטאטוזיס ואת השינויים המולקולריים, הביוכימיים, התאיים המיוצרים על ידי חשיפה יתר של hepatocytes שומנים במבחנה.

Abstract

מחלת כבד שומני (MAFLD), הידועה בעבר כמחלת כבד שומני לא אלכוהולית (NAFLD), היא מחלת הכבד השכיחה ביותר בעולם בשל הקשר שלה עם השמנת יתר, סוכרת מסוג 2, ודיסליפידמיה. סטאטוזיס כבד, הצטברות של טיפות שומנים בדם בפרנצ'ימה בכבד, היא תכונה מרכזית של המחלה שקדמה לדלקת שנצפו בteatohepatitis, פיברוזיס, ומחלת כבד סופנית. הצטברות שומנים בדם בהפטוציטים עלולה להפריע לחילוף חומרים תקין של קסנוביוטיקה ומולקולות אנדוגניות, כמו גם לגרום לתהליכים תאיים המובילים להתקדמות המחלה. למרות המחקר הניסיוני של steatosis יכול להתבצע vivo, במבחנה גישות לחקר steatosis הם כלים משלימים עם יתרונות שונים. תרבות hepatocyte במדיום מותנה עומס יתר שומנים היא אפשרות רבייה מצוינת לחקר הסטאטוזיס הכבד המאפשר זיהוי של תהליכים תאיים הקשורים הצטברות שומנים, כגון לחצים חמצוניים ורשתית, autophagia, התפשטות, מוות תאים, וכו ', כמו גם בדיקות אחרות כולל יעילות סמים, ובדיקות טוקסיקולוגיות, בין יישומים אפשריים רבים אחרים. כאן, הוא נועד לתאר את המתודולוגיה של תרבית התא hepatocyte במדיום מותנה עומס יתר שומנים. תאי HepG2 היו בתרבית RMPI 1640 בינוני מותנה עם נתרן פלמיטט ונתרן oleate. חשוב לציין, היחס של שני שומנים אלה חיוני כדי להעדיף הצטברות טיפת שומנים בדם, תוך שמירה על התפשטות התאים ושיעור תמותה מתון, כפי שקורה בכבד במהלך המחלה. המתודולוגיה, מהכנת מלאי פתרון השומנים, תערובת, תוספת לתרבות הבינונית וההפטוציט מוצגת. עם גישה זו, ניתן לזהות טיפות שומנים בדם בהפטוציטים שניתן להבחין בהם בקלות על ידי כתמי O אדומים שמן, כמו גם עקומות של שיעורי התפשטות / תמותה.

Introduction

כבד שומני הקשורים בתפקוד המטבולי נפוץ מאוד ברחבי העולם^1,2; ההערכה היא כי עד 25% מהאוכלוסייה מושפע³. מחלה זו הידועה בעבר בשם מחלת כבד שומני לא אלכוהולי (NAFLD), עדכנה את המינוח שלה לתפקוד מטבולי הקשור למחלת כבד שומני (MAFLD) כדי לשקף במדויק את הפתוגנזה הקשורה להשמנת יתר, תנגודת לאינסולין, סוכרת מסוג 2, ודיסליפידמיה, כמו גם את ההנהלות האפשריות של המחלה^3,4.

ללא קשר לשם, המחלה כוללת קשת רחבה של שינויים היסטופתולוגיים המאופיינת בהצטברות גבוהה באופן חריג של שומנים בכבד (>5% מהשומן בהפטוציטים⁵) ועשויה להתקדם דרך הצטברות השומנים שנמצאת בדרך כלל בסטאטוזיס פשוט לסטיאטוהפטיטיס, אשר בתורו עלולה להוביל להתפתחות של פיברוזיס, שחמת הכבד, קרצינומה hepatocellular, ואי ספיקת כבד^5,6,7,8. בשל שכיחותו הגוברת, MAFLD צפוי להיות האינדיקציה הראשונה להשתלת כבד והגורם המוביל לקרצינומה hepatocellular⁹.

למרות שזה נחשב כצורה שפירה או קלה של מחלת כבד שומני, סטאטוזיס כבד הוא למעשה המפתח המטבולי ב- MAFLD¹⁰. מסלולים מטבוליים שונים מושפעים הצטברות שומנים בדם בכבד, כולל אך לא מוגבל סינתזה שומנים בדם, ייצוא, חילוף החומרים¹⁰. תנגודת לאינסולין, עקה חמצונית, מתח רשתית, תפקוד לקוי הסלולר קשורים מאוד ליפוטוקסיות בכבד^11,12. מצד שני, הפטוסיטים שומניים הם המטרה של מינים חמצן תגובתי, עיבוד מטבוליטים כמו מי חמצן שומנים, קרבונילים חלבון, ותוספים של חומצות גרעין¹³. ברמה התאית, hepatocytes שומני עלול לעבור נזק מיטוכונדריאלי¹⁴, senescence הסלולר¹⁵, אפופטוזיס¹⁶, pyroptosis¹², ו autophagia¹⁷, בין שאר האירועים.

Hepatocytes אחראים מאוד על חילוף החומרים, detoxification, וסינתזה של מגוון רחב של מולקולות. רבים של פונקציות אלה עלולים להיות בסכנה על ידי הצטברות השומנים שנצפו בסטאטוזיס. לכן, יש חשיבות רבה יש כלים לשחזור המאפשרים הערכה מדויקת של סטאטוזיס. במובן זה, מודלים במבחנה ישימים בקלות וניתן לשחזר מאוד. סטאטוזיס במבחנה שימש עם מטרות שונות^16,18,19. תאי HepG2 נמצאים בשימוש נרחב כקו תאים hepatocyte. יש לו יתרונות כגון להיות קל לתרבות ומאופיין היטב. אולי, החיסרון היחיד של תאי HepG2 הוא העובדה שזה קו תאים מסרטן, ולכן זה חייב להילקח בחשבון בעת ניתוח התוצאות. כאן, היישום של תערובת של חומצות שומן בשימוש נרחב בתרבות התא: חומצה פלמיטית (PA) וחומצה אולאית (OA) מוצג. הן הרשות הפלסטינית והן OA מציעות תוצאות שונות בתרבות²⁰. PA (C 16:0) היא חומצת השומן הרווי הנפוצה ביותר המתקבלת מהתזונה¹⁶. הרשות הפלסטינית נחשבת סמנים ביולוגיים של דה נובו ליפוגנזה, צעד מכריע בהתפתחות NAFLD²¹. הרשות הפלסטינית מוצגת כבעלת²²רעילים ביותר ; לכן, זה לא יכול להיות מומלץ לגרום סטאטוזיס במבחנה. OA (C 18:1) היא חומצת שומן חד בלתי רוויה. בניגוד לרשות הפלסטינית, הוצע ל-OA להחזיק בתכונות אנטי דלקתיות ונוגדי חמצון, להיות מסוגל לנטרל את PA¹². הן PA והן OA הן חומצות השומן העיקריות הקיימות בטריגליצרידים, ללא קשר למצב הבריאות או^{המחלה 16}. טבלה 1 מספקת דוגמאות לתרבות ההפטוציטים עם הרשות הפלסטינית, OA והתערובת שלהם, כמו גם התוצאות שדווחו^{12,23,24,25,26,27}. חומצות שומן אחרות שימשו גם בתרבות הפטוציט, כולל חומצה קאירית (C 18:0)^28,29,30, חומצה לינולאית (C 18:1)^28,30,31 וההצמדות שלה (CLA)^28,32, חומצה פלמיטולאית (C 16:1)²⁹. עם זאת, השימוש בהם מדווח לעתים קרובות ביותר בספרות, אולי בגלל שפע הכבד שלהם נמוך יותר מאשר הרשות הפלסטינית ו OA¹⁶.

בשילוב, שתי חומצות השומן דומות לסטיאטוזיס במבחנה, ומספקות תאים מתרבים, עם מוות מוגבר של תאים וכדאיות נמוכה יותר בהשוואה לתנאי בקרה. ראוי להזכיר כי המלחים המתאימים של חומצות שומן אלה זמינים וניתן להשתמש בהם גם כן. אחת הבעיות העיקריות בעת הערכת עומס יתר שומנים בתרבית התא hepatocyte ניתנת בהבחנה בין מודלים טוקסיקולוגיים מודל המייצגים הטוב ביותר סטאטוזיס. מודלים רבים ניתן להסביר במקרה הראשון. למעשה, השימוש ברשות הפלסטינית לבדה עשוי להיחשב ביניהם, והתמותה הגבוהה היא התוצאה הברורה ביותר^{12,16,23,24,25,26,27}. השימוש במינונים גבוהים גם במקרה של OA יכול להיחשב גם כמודל toxicologic. הפרוטוקול המוצג כאן הוא גבוה יותר בהתאם להתפתחות סטאטוזיס שכן הוא מראה תמותה נמוכה לעומת זה שנצפה במודלים אחרים ומאפשר לו להיות אחריו במשך מספר ימים עם הצטברות שומנים מתקדמת כפי שהוא מתרחש ב NAFLD. האפשרות להעריך סטאטוזיס קל וחמורה באמצעות תנאי ניסוי נחשבת יתרון נוסף.

חומצות שומן	תנאים		תוצאות		הפניה
אבא	ריכוז: 200 מיקרומטר		הצטברות שומנים בדם		יאן ואח', 201925.
	חשיפה לזמן: 24 שעות		נזקי הפטוצייט
			גובה טרנסמינאס
אבא	ריכוז: 50, 100 ו 200 מיקרומטר		הצטברות שומנים בדם		Xing et al, 201924.
	חשיפה לזמן: 24 שעות
אבא	ריכוז: 250 מיקרומטר , 500 מיקרומטר , 750 מיקרומטר ו 1,000 מיקרומטר		הצטברות שומנים בדם		וואנג ואח', 202026.
	חשיפה לזמן: 24 שעות		הפחתה הדרגתית של הכדאיות בתא
תערובת של OA/PA	ריכוז: 1 מ"מ		הצטברות שומנים בדם		שיאו ואח', 202027.
	חשיפה לזמן: 24 שעות		אינו מדווח על ליפוטוקסיות
	מחיר: 2OA:1PA
תערובת של OA/PA	גירוי ראשון עם 200 מיקרומטר ו 400 מיקרומטר של PA ולאחר מכן גירוי שני עם 200 מיקרומטר של OA		הצטברות שומנים בדם.		זנג ואח', 202012.
	ריכוז:400 מיקרומטר PA: 200 מיקרומטר OA		ראיות של ליפוטוקסיות הנגרמת על ידי הרשות הפלסטינית צומצמה על ידי גירוי של OA.
	תעריף: 2PA:1OA
	חשיפה לזמן: 24 שעות
תערובת של OA/PA	ריכוז: 400 מיקרומטר PA: 200 מיקרומטר OA		הצטברות שומנים בדם		חן ואח', 201823.
	תעריף: 2PA:1OA
	חשיפה לזמן: 24 שעות
תערובת של OA/PA	ריכוז :50 ו 500 מיקרומטר		דור של שני סוגים של סטאטוזיס: סטאטוזיס קל ו סטאטוזיס חמור.		קמפוס וגוזמן 2021
	תעריף: 2PA:1OA		מדמה תערוכה כרונית של עומס שומנים
	חשיפה לזמן: 24 שעות, יומיים,3 ימים ו-4 ימים.

טבלה 1. תרבות הפטוצייט בתנאים סטטוגניים. הטבלה מציגה את סוג חומצת השומן המשמשת, את התנאים נשמרים, ואת התוצאות שנצפו בתרבות hepatocyte. חומצה פלמיטית. חומצה אולאית.

לבסוף, מודל זה ישים לא רק על המחקר של סטאטוזיס וכבד שומני, אלא גם על מסלולי חילוף החומרים הכבד, סינתטי, ו detoxification בהקשר של סטאטוזיס. כמו כן, בסטאטוזיס המושרה במבחנה עשוי לספק ראיות לזיהוי סמנים פוטנציאליים של המחלה, כמו גם מטרות טיפוליות.

Protocol

1. הכנה בינונית סטנדרטית ומותנית

1. כדי להכין RPMI 1640 סטנדרטי, תוספת RPMI 1640 תרבות בינוני עם 10% (v/ v) של סרום בקר עוברי (FBS, בעבר חום מומת) ו 1% (v/v) של פתרון פניצילין-סטרפטומיצין. לאחסן את המדיום ב 4 °C.עיקור באמצעות מסנני 0.22 מיקרומטר.
2. להכנת פתרון מלאי פלמיטט, להכין פתרון 50 mM של פלמיטט RPMI 1640 סטנדרטי בעבר בתוספת עם 1% אלבומין סרום בקר (ללא שומנים). נפח של 5-10 מ"ל של מלאי זה יהיה מספיק. לחטא את פתרון המלאי באמצעות מסנני 0.22 מיקרומטר. יש לאחסן ב-4 °C (50°F) המוגנים מפני אור למשך עד חודש אחד.
3. כדי להכין פתרון מלאי oleate, להכין פתרון 50 mM של oleate RPMI 1640 סטנדרטי בתוספת בעבר עם 1% אלבומין סרום בקר (ללא שומנים). נפח של 10 מ"ל יספיק. לחטא את פתרון המלאי באמצעות מסנני 0.22 מיקרומטר. יש לאחסן ב-20 °C (50°F) המוגן מפני אור למשך עד חודש אחד.
4. כדי להכין מדיום סטטוגני מהמלאי שהוכן בעבר, הכינו פלמיטט בן חלק אחד: מדיום סטאטוגני 2 חלקים בשתי רמות אפשריות: סטאטוזיס קל וקשה.
   1. סטאטוזיס קל: הכן 100 מ"ל של פלמיטט חלק אחד: תערובת oleate 2 חלקים (50 מיקרומטר) ב RPMI 1640 סטנדרטי. לחטא באמצעות מסנני 0.22 מיקרומטר. יש לאחסן ב-4 °C (7%).
   2. סטאטוזיס חמור: הכן 100 מ"ל של פלמיטט חלק אחד: תערובת oleate 2 חלקים (500 מיקרומטר) ב RPMI 1640 סטנדרטי. לחטא באמצעות מסנני 0.22 מיקרומטר. יש לאחסן ב-4 °C (7%).
   3. הכנה חלופית לפתרונות המלאי.
      1. הכן את שני פתרונות המלאי באמצעות חומצות השומן המתאימות באמצעות אלבומין שומנים חינם כפי שצוין לעיל.
      2. כאשר חסר אלבומין שומנים חינם, להשתמש מלחי פלמיטט ו oleate.
         1. להמיס או palmitate או oleate ב 2 מ"ל של אתנול מוחלט ולאחר מכן לערבב בנפח הסופי של RPMI סטנדרטי 1640 (5-10 מ"ל). להמיס oleate ישירות על ידי ערבוב במדיום תרבות RPMI 1640 סטנדרטי.
         2. אפשר אידוי של אתנול על ידי דגירה באמבט מים ב 70 °C (70 °F); מערבבים היטב.
      3. בכל מקרה, לחטא את שני פתרונות המלאי באמצעות מסנני 0.22 מיקרומטר. יש לאחסן את תמסת המלאי של פלמיטט ב-4 °C (5°F) ופתרון מלאי oleate ב- - 20 °C (50 °F). הגן על שני הפתרונות מפני אור. פתרונות אלה יציבים למשך חודש אחד.

2. טרום תרבות

1. זרע 100,000 תאי HepG2 לבאר בצלחת 24-well. הוסף 1 מ"ל של RPMI 1640 סטנדרטי.
2. לפני הדגירה ב 37 °C (5°F) ו 5% CO₂ עבור 24 שעות, המאפשר חיבור לתא.

3. תרבות סטטוגנית

1. לאחר טרום-תרבות, להשליך את RPMI 1640 סטנדרטי בינוני ולהוסיף את המדיום steatogenic בהתאם.
2. יש להשליך את הסופר-נט ולהוסיף מדיום סטטוגני טרי כל 24 שעות.

4. הערכת כדאיות ותמותה

1. זרע 100,000 תאי HepG2 לבאר בצלחת 24-well. הוסף 1 מ"ל של RPMI 1640 סטנדרטי.
2. לפני הדגירה עבור 24 שעות ב 37 °C (5% CO_2).
3. שנה RPMI 1640 בינוני סטנדרטי למדיום סטטוגני.
4. דגירה במשך 24 שעות, 2 ימים, 3 ימים, ו 4 ימים מרענן את מדיום steatogenic כל 24 שעות.
5. לאחר הזמן המתאים, להשליך את supernatant.
6. לנתק תאים מהבאר על ידי הוספת 500 μL של 0.05% טריפסין-EDTA. דגירה במשך 5 דקות ב 37 °C (5% CO_2).
7. לאסוף את התאים respended במיקרו-Tube.
8. צנטריפוגה ב-300 על גרם ותשליך את הסופר-טבעי.
9. הוסף 200 μL של RPMI 1640 סטנדרטי ו resuspend התאים.
10. הוסף 15 μL של 0.4% פתרון כחול טריפן במיקרו-Tube טרי. לערבב עם 15 μL של ההשעיה התא הקודם.
11. תספור את התאים המוכתמים והלא מוכתמים בהמוציטומטר.
12. חשב את שיעורי הכדאיות והתמותה בהתאם.
    כדאיות =
    
    תמותה =
    

5. כתמי שומנים בדם עם שמן אדום O

1. שים כיסוי תרבית תא בכל באר בצלחת 24-well.
2. זרע 100,000 תאי HepG2 לבאר. הוסף 1 מ"ל של RPMI 1640 סטנדרטי.
3. לפני הדגירה ב 37 °C (5% CO₂ עבור 24 שעות.
4. שנה RPMI 1640 בינוני סטנדרטי למדיום סטטוגני.
5. דגירה במשך 24 שעות, 2 ימים, 3 ימים, ו 4 ימים, מרענן את מדיום steatogenic כל 24 שעות.
6. לאחר הזמן המתאים, להשליך את supernatant.
7. לשטוף עם 1 מ"ל של תמיסת מלח חוצצת פוספט (PBS). זרוק את סופר-טבעי.
8. תקן עם 1 מ"ל של 4% paraformaldehyde ב- PBS.
9. דגירה במשך שעה בטמפרטורת החדר.
10. להשליך את עודף paraformaldehyde.
11. לשטוף את התאים עם 1 מ"ל של מים מזוקקים.
12. יש להוסיף 1 מ"ל של 70% איזופרופנול ודגרה למשך 5 דקות.
13. להשליך את עודף איזופרופנול. אין צורך בשטיפת PBS בשלב זה.
14. הוסיפו 1 מ"ל של תמיסה O אדומה ושמן ודגרה למשך 30 דקות.
15. להשליך את עודף של תמיסה O שמן אדום.
16. יש לשטוף במ"ל אחד של מים מזוקקים.
17. הוסף 500 μL של פתרון המטוקסילין. דגירה במשך 3 דקות.
18. להשליך את עודף של פתרון המטוקסילין.
19. יש לשטוף במ"ל אחד של מים מזוקקים.
20. צפה מתחת למיקרוסקופ בהגדלה של 400x (אובייקט 40x, עינית 10x).

6. הערכה מורפומטרית של תכולת השומנים

1. בחר ולכוד באופן אקראי תצלומים של 10 שדות אופטיים מהאזור המלא של הבאר. חזור על הפעולה על כל באר.
2. להעריך את אחוז השטח המוכתם האדום באמצעות הכלי סף צבע בתוכנת ImageJ על פי פריירה ו Rasband³³.
3. השווה את האזור המוכתם עם האזור המלא של השדה האופטי באמצעות הכלי לנתח חלקיקים בתוכנת ImageJ על פי פריירה ו Rasband³³.
4. חשב את האחוז הממוצע של כל באר.

תוצאות

Hepatocytes מתורבת בצמיחת התצוגה הבינונית steatogenic על פני השטח של הבאר; עם זאת, hepatocytes שומן להראות שיעור צמיחה נמוך יותר בהשוואה לתאים בתרבית בינונית שליטה. היחס והריכוז המוצעים של OA ו- PA, מבטיחים הישרדות תאים במהלך התרבות. זריעת 1 x 10⁵ תאים לבאר בלוחות של 24 בארות מספקת מפגש אופטימלי כפי שמוצג

Discussion

פרוטוקול זה נועד לספק אסטרטגיה לחקר סטאטוזיס במבחנה. תרבית התאים היא כלי רב עוצמה לחקר היבטים תאיים, מולקולריים, ביוכימיים וטוקסיקולוגיים של התאים החשופים לתנאים שונים. עם גישה זו, ניתן לדמיין סטאטוזיס לא רק כשלב של המחלה המורכבת שהיא MAFLD, אלא גם כמו חשיפת יתר hepatocyte שומנים ואת התוצאות ...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Biosafety cabinet	ESCO Airstream	AC2-452+C2:C26	Class II Type A2 Biological Safety Cabinet
Bottle top filter	Corning, US	430513	Non-pyrogenic, polystyrene, sterile. 1 filter/Bag. 0.22 μm, 500 mL.
Bovine serum albimun (BSA)	Gold Biotechnology, US	A-421-10	BSA Fatty Acid Free for cell culture
Culture media RPMI 1640	ThermoFisher-Gibco, US	31800-022	-
Fetal Bovine Serum (FBS)	ThermoFisher-Gibco, US	A4766801	-
Hemocytometer	Marienfeld, DE	640010	-
HepG2 cell line	ATCC, US	HB-8065	Hepatocellular carcinoma human cells.
Humidified incubator	Thermo Electronic Corporation,US	Model: 3110	Temperature (37 °C ± 1 °C), humidity (90% ± 5%) , CO2 (5% ± 1%)
Inverted microscope Eclipse	NIKON, JPN	Model: TE2000-S	-
Isopropanol	Sigma-Aldrich, US	I9030-4L	-
Oil Red O Kit	Abcam, US	ab150678	Kit for histological visualization of neutral fat.
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich, US	P6148-500G	-
Penicillin/streptomycin	ThermoFisher-Gibco, US	15140-122	Antibiotics 10,000 U/mL Penicillin, 10,000 μg/mL Streptomycin
pH meter	Beckman, US	Model: 360 PH/Temp/MV Meter	-
Phosphate buffered saline	ThermoFisher-Gibco, US	10010-023	-
Serological Pipettes	Sarstedt, AUS	86.1253.001	Non-pyrogenic, sterile, 5 mL
Serological Pipettes	Sarstedt, AUS	86.1254.001	Non-pyrogenic, sterile, 10 mL
Sodium bicarbonate	Sigma-Aldrich, US	S5761-1KG	Preparation of culture media
Sodium oleate	Santa Cruz Biotechnology, US	sc-215879A	-
Sodium palmitate	Santa Cruz Biotechnology, US	sc-215881	-
Syring filter	Corning, US	431219	Non-pyrogenic, sterile, 28 mm, 0.2 μm.
Trypan Blue	Sigma-Aldrich, US	T6146-25G	-
Trypsin 0.05% /EDTA 0.53 mM	Corning, US	25-052-Cl	-
24 well cell culture cluster	Corning, US	3524	Flat bottom with lid. Tissue culture treated. Nonpyrogenic, polystyrene, sterile. 1/Pack.
96 well cell culture cluster	Corning, US	3599	Flat bottom with lid. Tissue culture treated. Nonpyrogenic, polystyrene, sterile. 1/Pack.