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Neste Artigo

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Resumo

Este protocolo pretende ser uma ferramenta para estudar a esteatose e as alterações moleculares, bioquímicas, celulares produzidas pela exposição excessiva de hepatócitos a lipídios in vitro.

Resumo

A doença hepática gordurosa associada à disfunção metabólica (MAFLD), anteriormente conhecida como doença hepática gordurosa não alcoólica (NAFLD), é a doença hepática mais prevalente em todo o mundo devido à sua relação com obesidade, diabetes tipo 2 e dislipidemia. Esteatose hepática, o acúmulo de gotículas lipídicas no parnchyma hepático, é uma característica fundamental da doença que precede a inflamação observada na esteatohepatite, fibrose e doença hepática em estágio terminal. O acúmulo de lipídios em hepatócitos pode interferir com o metabolismo adequado de xenobióticos e moléculas endógenas, bem como induzir processos celulares que levem ao avanço da doença. Embora o estudo experimental da esteatose possa ser realizado in vivo,abordagens in vitro para o estudo da esteatose são ferramentas complementares com diferentes vantagens. A cultura hepatocito em meio lipídico-condicionado é uma excelente opção reprodutível para o estudo da esteatose hepática que permite a identificação de processos celulares relacionados ao acúmulo de lipídios, como estresses oxidativos e reticulares, autofagia, proliferação, morte celular, etc, bem como outros testes, incluindo eficácia de drogas, e testes toxicológicos, entre muitas outras aplicações possíveis. Aqui, teve como objetivo descrever a metodologia da cultura celular hepatocitada em meio lipídios condicionados por sobrecarga. As células hepG2 foram cultivadas em RMPI 1640 médio condicionado com palmitato de sódio e oleato de sódio. É importante ressaltar que a razão desses dois lipídios é crucial para favorecer o acúmulo de gotículas lipídicas, mantendo a proliferação celular e uma taxa de mortalidade moderada, como ocorre no fígado durante a doença. A metodologia, a partir da preparação dos estoques de solução lipídica, mistura, além do meio, e cultura hepatócida é mostrada. Com essa abordagem, é possível identificar gotículas lipídicas nos hepatócitos que são prontamente observáveis pela mancha O vermelha-óleo, bem como curvas de taxas de proliferação/mortalidade.

Introdução

Fígado gorduroso associado à disfunção metabólica é altamente prevalente em todo o mundo1,2; estima-se que até 25% da população seja afetada3. Esta doença anteriormente conhecida como doença hepática gordurosa não alcoólica (NAFLD), atualizou sua nomenclatura para disfunção metabólica associada à doença hepática gordurosa (MAFLD) para refletir com precisão a patogênese relacionada à obesidade, resistência à insulina, diabetes tipo 2 e dislipidemia, bem como os possíveis manejos da doença3,4.

Independentemente do nome, a doença inclui um amplo espectro de alterações histopatológicas caracterizadas pelo acúmulo anormalmente alto de lipídios no fígado (>5% de gordura nos hepatócitos5) e pode progredir através do acúmulo lipídudo tipicamente encontrado em esteatose simples à esteatohepatite, o que por sua vez pode levar ao desenvolvimento de fibrose, cirrose, carcinoma hepatocelular e insuficiência hepática5,6,7,8. Devido à sua crescente prevalência, espera-se que o MAFLD se torne a primeira indicação de transplante hepático e a principal causa do carcinoma hepatocelular9.

Embora tenha sido considerada como uma forma benigna ou leve de doença hepática gordurosa, a esteatose hepática é de fato a chave metabólica no MAFLD10. Diferentes vias metabólicas são afetadas pelo acúmulo de lipídios no fígado, incluindo, mas não se limitando à síntese lipídica, exportação e metabolismo10. Resistência à insulina, estresse oxidativo, estresse reticular e disfunção celular estão fortemente associados à lipotoxicidade hepática11,12. Por outro lado, hepatócitos gordurosos são alvo de espécies reativas de oxigênio, tornando metabólitos como peróxidos lipídicos, carbonilas proteicas e adutos de ácidos nucleicos13. No nível celular, hepatócitos gordurosos podem sofrer danos mitocondriais14, senescência celular15, apoptose16,pioptose12e autofagia17,entre outros eventos.

Hepatocitas são altamente responsáveis pelo metabolismo, desintoxicação e síntese de uma ampla gama de moléculas. Muitas dessas funções podem ser comprometidas pelo acúmulo lipídudo observado na esteatose. Portanto, é de grande importância ter ferramentas reprodutíveis que permitam uma avaliação precisa da esteatose. Nesse sentido, os modelos in vitro são prontamente aplicáveis e altamente reprodutíveis. Esteatose in vitro tem sido usada com diferentes gols16,18,19. As células HepG2 são amplamente utilizadas como linha celular hepatocitte. Tem vantagens como ser fácil de cultivar e bem caracterizado. Talvez, a única desvantagem das células HepG2 seja o fato de ser uma linha celular cancerígena, por isso isso deve ser considerado ao analisar os desfechos. Aqui, mostra-se a aplicação de uma mistura de ácidos graxos amplamente utilizados na cultura celular: ácido palmítico (PA) e ácido oleico (OA). Tanto o PA quanto o OA oferecem resultados diferentes na cultura20. Pa (C 16:0) é o ácido graxo saturado mais comum obtido da dieta16. A AF é considerada biomarcadora da lipogênese de-novo,um passo crucial no desenvolvimento do NAFLD21. Pa é mostrado como altamente tóxico22; portanto, pode não ser recomendado induzir esteatose in vitro. OA (C 18:1) é um ácido graxo monoinsaturado. Em contraste com a AF, foi sugerido que a OA possui propriedades anti-inflamatórias e antioxidantes, sendo capaz de neutralizar a PA12. Tanto a AF quanto a OA são os principais ácidos graxos presentes nos triglicérides, independentemente da condição de saúde ou doença16. A Tabela 1 fornece exemplos da cultura hepatocitte com PA, OA e sua mistura, bem como os resultados relatados12,23,24,25,26,27. Outros ácidos graxos também têm sido utilizados na cultura hepatocita, incluindo ácido esteárico (C 18:0)28,29,30, ácido linoleico (C 18:1)28,30,31 e seus conjugados (CLA)28,32, ácido palmitoleico (C 16:1)29. No entanto, seu uso é menos frequentemente relatado na literatura, talvez porque sua abundância hepática é menor que a PA e OA16.

Em conjunto, ambos os ácidos graxos se assemelham à esteatose in vitro,proporcionando células proliferadoras, com maior morte celular e menor viabilidade em comparação com as condições de controle. Vale ressaltar que os respectivos sais desses ácidos graxos estão disponíveis e também podem ser usados. Um dos principais problemas na avaliação da sobrecarga lipídica na cultura celular hepatocitte é dado na diferenciação entre modelos toxicológicos e um modelo que melhor representa a esteatose. Muitos modelos podem ser contabilizados no primeiro caso. De fato, o uso apenas de PA pode ser considerado entre eles, e a alta mortalidade é o desfecho mais evidente12,16,23,24,25,26,27. O uso de altas doses mesmo no caso de OA também pode ser considerado como um modelo toxicológico. O protocolo aqui mostrado está em maior conformidade com o desenvolvimento da esteatose, pois mostra baixa mortalidade em comparação com o observado em outros modelos e permite que seja seguido durante vários dias com acúmulo progressivo de lipídios como ocorre na NAFLD. A possibilidade de avaliar esteatose leve e grave por meio de condições experimentais é considerada outra vantagem.

Ácidos graxosCondiçõesResultadosReferência
PAPAIConcentração: 200 μMAcúmulo de lipídiosYan et al, 201925.
Exposição de tempo: 24 hDano à hepatocita
Elevação de transminases
PAPAIConcentração: 50, 100 e 200 μMAcúmulo de lipídiosXing et al, 201924.
Exposição de tempo: 24 h
PAPAIConcentração: 250 μM , 500 μM, 750 μM e 1.000 μMAcúmulo de lipídiosWang et al, 202026.
Exposição de tempo: 24 hRedução progressiva da viabilidade celular
Mistura de OA/PAConcentração: 1 mMAcúmulo de lipídiosXiao et al, 202027.
Exposição de tempo: 24 hNão relata lipotoxicidade
Taxa: 2OA:1PA
Mistura de OA/PAPrimeiro estimulação com 200 μM e 400 μM de PA e depois segundo estímulo com 200 μM de OAAcúmulo de lipídios.Zeng et al, 202012.
Concentração:400 μM PA: 200 μM OAA evidência de lipotoxicidade induzida pela AF foi reduzida por estimulação de OA.
Taxa: 2PA:1OA
Exposição de tempo: 24 h
Mistura de OA/PAConcentração: 400 μM PA: 200 μM OAAcúmulo de lipídiosChen et al, 201823.
Taxa: 2PA:1OA
Exposição de tempo: 24 h
Mistura de OA/PAConcentração :50 e 500 μMGeração de dois tipos de esteatose: esteatose leve e
esteatose grave.		Campos e Guzmán 2021
Taxa: 2PA:1OASimula exposição crônica de sobrecarga lipídica
Exposição de tempo: 24h, 2 dias,3 dias e 4 dias.

Mesa 1. Cultura hepatocita em condições esteatogênicas. A tabela apresenta o tipo de ácido graxo utilizado, as condições mantidas e os desfechos observados na cultura hepatócica. Pa: Ácido palmítico. Ácido oleico.

Por fim, este modelo é aplicável não apenas ao estudo da esteatose e fígado gorduroso, mas também às vias hepáticas metabólicas, sintéticas e desintoxicação no contexto da esteatose. Além disso, a esteatose in vitro induzida pode fornecer evidências para a identificação de potenciais marcadores da doença, bem como alvos terapêuticos.

Protocolo

1. Preparação média padrão e condicionada

  1. Para preparar o RPMI padrão 1640, suplemente o meio de cultura RPMI 1640 com 10% (v/v) de soro bovino fetal (FBS, anteriormente inativado) e 1% (v/v) da solução penicilina-estreptomicina. Armazene o meio a 4 °C.Esterilizar usando filtros de 0,22 μm.
  2. Para preparar a solução de estoque palmitato, prepare uma solução de 50 mM de palmitato no RPMI padrão 1640 previamente suplementado com 1% de albumina de soro bovino (livre de lipídios). Um volume de 5-10 mL deste estoque será suficiente. Esterilize a solução de estoque utilizando filtros de 0,22 μm. Armazene a 4 °C protegido da luz por até 1 mês.
  3. Para preparar a solução de estoque oleate, prepare uma solução de 50 mM de oleate no RPMI padrão 1640 previamente suplementado com 1% de albumina de soro bovino (livre de lipídio). Um volume de 10 mL será suficiente. Esterilize a solução de estoque utilizando filtros de 0,22 μm. Armazene a -20 °C protegido contra luz por até 1 mês.
  4. Para preparar o meio esteatogênico dos estoques previamente preparados, prepare um palmitato de 1 parte: meio esteatogênico oleatogênico de 2 partes em dois níveis possíveis: esteatose leve e grave.
    1. Steatosis leve: Prepare 100 mL de uma palmitate de 1 parte: mistura de oleato de 2 partes (50 μM) no RPMI padrão 1640. Esterilize usando filtros de 0,22 μm. Guarde a 4 °C por até 1 semana.
    2. Steatosis grave: Prepare 100 mL de uma palmitate de 1 parte: mistura de oleato de 2 partes (500 μM) no RPMI padrão 1640. Esterilize usando filtros de 0,22 μm. Guarde a 4 °C por até 1 semana.
    3. Preparação alternativa para as soluções de estoque.
      1. Prepare ambas as soluções de estoque usando os respectivos ácidos graxos usando albumina lipídica gratuita, conforme indicado acima.
      2. Quando não ter albumina lipídica livre, use palmitato e sais de oleato.
        1. Dissolva palmitato ou oleate em 2 mL de etanol absoluto e, em seguida, misture no volume final do RPMI padrão 1640 (5-10 mL). Dissolva oleate diretamente mexendo no meio de cultura RPMI padrão 1640.
        2. Permitir a evaporação do etanol incubando em um banho de água a 70 °C; Homogeneizar.
      3. Em todos os casos, esterilize ambas as soluções de estoque usando filtros de 0,22 μm. Armazene a solução de estoque palmitate a 4 °C e a solução de estoque oleate a - 20 °C. Proteja ambas as soluções da luz. Essas soluções estão estáveis por 1 mês.

2. Pré-cultura

  1. Semente 100.000 células HepG2 por poço em uma placa de 24 poços. Adicione 1 mL de RPMI padrão 1640.
  2. Pré-incubação a 37 °C e 5% de CO2 por 24 h, permitindo a fixação celular.

3. Cultura esteatogênica

  1. Após a pré-cultura, descarte o meio RPMI padrão 1640 e adicione o meio esteatogênico em conformidade.
  2. Descarte o supernasal e adicione meio esteatogênico fresco a cada 24 horas.

4. Avaliação de viabilidade e mortalidade

  1. Semente 100.000 células HepG2 por poço em uma placa de 24 poços. Adicione 1 mL de RPMI padrão 1640.
  2. Pré-incubação por 24h a 37 °C e 5% de CO2.
  3. Alterar o meio RPMI padrão 1640 para o meio esteatogênico.
  4. Incubar por 24h, 2 dias, 3 dias e 4 dias refrescando o meio esteatogênico a cada 24h.
  5. Após o tempo apropriado, descarte o supernatante.
  6. Despemar células do poço adicionando 500 μL de 0,05% Trypsin-EDTA. Incubar por 5 min a 37 °C e 5% de CO2.
  7. Colete as células resuspended em um microtubo.
  8. Centrifugar a 300 x g e descartar o supernatante.
  9. Adicione 200 μL de RPMI padrão 1640 e resuspense as células.
  10. Adicione 15 μL de solução azul Trypan de 0,4% em um microtubo fresco. Misture com 15 μL da suspensão anterior da célula.
  11. Conte as células manchadas e não manchadas em um hemócito.
  12. Calcule as taxas de viabilidade e mortalidade em conformidade.
    Viabilidade =
    figure-protocol-4140
    Mortalidade =
    figure-protocol-4227

5. Mancha lipídica com O-Vermelho-Óleo

  1. Coloque uma cultura celular em cada poço em uma placa de 24 poços.
  2. Sementes 100.000 células HepG2 por poço. Adicione 1 mL de RPMI padrão 1640.
  3. Pré-incubação a 37 °C e 5% de CO2 por 24 h.
  4. Alterar o meio RPMI padrão 1640 para o meio esteatogênico.
  5. Incubar por 24h, 2 dias, 3 dias e 4 dias, refrescando o meio esteatogênico a cada 24h.
  6. Após o tempo apropriado, descarte o supernatante.
  7. Lave com 1 mL de salina tamponada de fosfato (PBS). Descarte o supernatante.
  8. Corrija com 1 mL de 4% de paraformaldeído em PBS.
  9. Incubar por 1h à temperatura ambiente.
  10. Descarte o excesso de paraformaldeído.
  11. Enxágüe as células com 1 mL de água destilada.
  12. Adicione 1 mL de isopropanol de 70% e incubar por 5 min.
  13. Descarte o excesso de isopropanol. Uma lavagem pbs não é necessária neste momento.
  14. Adicione 1 mL de solução O vermelho-óleo e incubar por 30 min.
  15. Descarte o excesso da solução O vermelho-óleo.
  16. Enxágüe com 1 mL de água destilada.
  17. Adicione 500 μL de solução de hematoxilina. Incubar por 3 min.
  18. Descarte o excesso de solução de hematoxilina.
  19. Enxágüe com 1 mL de água destilada.
  20. Observe sob o microscópio em uma ampliação de 400x (Objetivo 40x, Ocular 10x).

6. Avaliação morfométrica do conteúdo lipídudo

  1. Selecione e capture aleatoriamente fotografias de 10 campos ópticos da área completa do poço. Repita para cada poço.
  2. Avalie a porcentagem de área manchada de vermelho utilizando a ferramenta Limiar de Cor no software ImageJ de acordo com Ferreira e Rasband33.
  3. Compare a área manchada com a área completa do campo óptico utilizando a ferramenta Analisar Partículas no software ImageJ de acordo com Ferreira e Rasband33.
  4. Calcule a porcentagem média de cada poço.

Resultados

Hepatócitos cultivados no meio esteatogênico apresentam crescimento em toda a superfície do poço; no entanto, hepatócitos gordurosos apresentam menor taxa de crescimento em comparação com células cultivadas no meio de controle. A proporção proposta e concentração de OA e PA, garantem a sobrevivência celular durante a cultura. Semear 1 x 105 células por poço em placas de 24 poços fornece confluência ideal como mostrado na Figura 1.

A via...

Discussão

Este protocolo destina-se a fornecer uma estratégia para estudar esteatose in vitro. A cultura celular é uma ferramenta poderosa para estudar aspectos celulares, moleculares, bioquímicos e toxicológicos das células expostas a diferentes condições. Com essa abordagem, a esteatose pode ser visualizada não apenas como um estágio da doença complexa que é a MAFLD, mas também como a superexposição hepatocita aos lipídios e os possíveis desfechos resultantes dessa exposição. Portanto, sua aplicação ...

Divulgações

Os autores não têm nada a revelar.

Agradecimentos

Este trabalho foi financiado pelo Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (Conacyt, CB-221137). Adriana Campos é doutoranda no Programa de Doutorado em Ciencias Biomédicas, Universidad Nacional Autónoma de México, e foi apoiada pela Conacyt (CVU: 1002502).

Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
Biosafety cabinetESCO AirstreamAC2-452+C2:C26Class II Type A2 Biological Safety Cabinet
Bottle top filterCorning, US430513 Non-pyrogenic, polystyrene, sterile. 1 filter/Bag. 0.22 μm, 500 mL.
Bovine serum albimun (BSA)Gold Biotechnology, USA-421-10BSA Fatty Acid Free for cell culture
Culture media RPMI 1640ThermoFisher-Gibco, US31800-022-
Fetal Bovine Serum (FBS)ThermoFisher-Gibco, USA4766801-
HemocytometerMarienfeld, DE640010-
HepG2 cell lineATCC, USHB-8065Hepatocellular carcinoma human cells.
Humidified incubatorThermo Electronic Corporation,USModel: 3110Temperature (37 °C ± 1 °C), humidity (90% ± 5%) , CO2 (5% ± 1%)
Inverted microscope EclipseNIKON, JPNModel: TE2000-S-
IsopropanolSigma-Aldrich, USI9030-4L-
Oil Red O KitAbcam, USab150678Kit for histological visualization of neutral fat.
ParaformaldehydeSigma-Aldrich, USP6148-500G-
Penicillin/streptomycinThermoFisher-Gibco, US15140-122Antibiotics 10,000 U/mL Penicillin, 10,000 μg/mL Streptomycin
pH meterBeckman, USModel: 360 PH/Temp/MV Meter-
Phosphate buffered salineThermoFisher-Gibco, US10010-023-
Serological PipettesSarstedt, AUS86.1253.001 Non-pyrogenic, sterile, 5 mL
Serological PipettesSarstedt, AUS 86.1254.001 Non-pyrogenic, sterile, 10 mL
Sodium bicarbonateSigma-Aldrich, USS5761-1KGPreparation of culture media
Sodium oleateSanta Cruz Biotechnology, USsc-215879A-
Sodium palmitateSanta Cruz Biotechnology, USsc-215881-
Syring filterCorning, US431219 Non-pyrogenic, sterile, 28 mm, 0.2 μm.
Trypan BlueSigma-Aldrich, UST6146-25G-
Trypsin 0.05% /EDTA 0.53 mMCorning, US25-052-Cl-
24 well cell culture clusterCorning, US3524Flat bottom with lid. Tissue culture treated. Nonpyrogenic, polystyrene, sterile. 1/Pack.
96 well cell culture clusterCorning, US3599Flat bottom with lid. Tissue culture treated. Nonpyrogenic, polystyrene, sterile. 1/Pack.

Referências

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