Um modelo de esteatose experimental in vitro: cultura celular hepatocitada em meio lipídidamente condicionado

Resumo

Este protocolo pretende ser uma ferramenta para estudar a esteatose e as alterações moleculares, bioquímicas, celulares produzidas pela exposição excessiva de hepatócitos a lipídios in vitro.

Resumo

A doença hepática gordurosa associada à disfunção metabólica (MAFLD), anteriormente conhecida como doença hepática gordurosa não alcoólica (NAFLD), é a doença hepática mais prevalente em todo o mundo devido à sua relação com obesidade, diabetes tipo 2 e dislipidemia. Esteatose hepática, o acúmulo de gotículas lipídicas no parnchyma hepático, é uma característica fundamental da doença que precede a inflamação observada na esteatohepatite, fibrose e doença hepática em estágio terminal. O acúmulo de lipídios em hepatócitos pode interferir com o metabolismo adequado de xenobióticos e moléculas endógenas, bem como induzir processos celulares que levem ao avanço da doença. Embora o estudo experimental da esteatose possa ser realizado in vivo,abordagens in vitro para o estudo da esteatose são ferramentas complementares com diferentes vantagens. A cultura hepatocito em meio lipídico-condicionado é uma excelente opção reprodutível para o estudo da esteatose hepática que permite a identificação de processos celulares relacionados ao acúmulo de lipídios, como estresses oxidativos e reticulares, autofagia, proliferação, morte celular, etc, bem como outros testes, incluindo eficácia de drogas, e testes toxicológicos, entre muitas outras aplicações possíveis. Aqui, teve como objetivo descrever a metodologia da cultura celular hepatocitada em meio lipídios condicionados por sobrecarga. As células hepG2 foram cultivadas em RMPI 1640 médio condicionado com palmitato de sódio e oleato de sódio. É importante ressaltar que a razão desses dois lipídios é crucial para favorecer o acúmulo de gotículas lipídicas, mantendo a proliferação celular e uma taxa de mortalidade moderada, como ocorre no fígado durante a doença. A metodologia, a partir da preparação dos estoques de solução lipídica, mistura, além do meio, e cultura hepatócida é mostrada. Com essa abordagem, é possível identificar gotículas lipídicas nos hepatócitos que são prontamente observáveis pela mancha O vermelha-óleo, bem como curvas de taxas de proliferação/mortalidade.

Introdução

Fígado gorduroso associado à disfunção metabólica é altamente prevalente em todo o mundo^1,2; estima-se que até 25% da população seja afetada³. Esta doença anteriormente conhecida como doença hepática gordurosa não alcoólica (NAFLD), atualizou sua nomenclatura para disfunção metabólica associada à doença hepática gordurosa (MAFLD) para refletir com precisão a patogênese relacionada à obesidade, resistência à insulina, diabetes tipo 2 e dislipidemia, bem como os possíveis manejos da doença^3,4.

Independe....

Protocolo

1. Preparação média padrão e condicionada

1. Para preparar o RPMI padrão 1640, suplemente o meio de cultura RPMI 1640 com 10% (v/v) de soro bovino fetal (FBS, anteriormente inativado) e 1% (v/v) da solução penicilina-estreptomicina. Armazene o meio a 4 °C.Esterilizar usando filtros de 0,22 μm.
2. Para preparar a solução de estoque palmitato, prepare uma solução de 50 mM de palmitato no RPMI padrão 1640 previamente suplementado com 1% de albumina de soro bovino (livre de lipídios). Um volume de 5-10 mL deste estoque será suficiente. Esterilize a solução de estoque utilizando filtros de 0,22 μm. Armazene a 4 °C protegido da luz por até 1 mês.
3. Par....

Resultados

Hepatócitos cultivados no meio esteatogênico apresentam crescimento em toda a superfície do poço; no entanto, hepatócitos gordurosos apresentam menor taxa de crescimento em comparação com células cultivadas no meio de controle. A proporção proposta e concentração de OA e PA, garantem a sobrevivência celular durante a cultura. Semear 1 x 10⁵ células por poço em placas de 24 poços fornece confluência ideal como mostrado na Figura 1.

A via.......

Discussão

Este protocolo destina-se a fornecer uma estratégia para estudar esteatose in vitro. A cultura celular é uma ferramenta poderosa para estudar aspectos celulares, moleculares, bioquímicos e toxicológicos das células expostas a diferentes condições. Com essa abordagem, a esteatose pode ser visualizada não apenas como um estágio da doença complexa que é a MAFLD, mas também como a superexposição hepatocita aos lipídios e os possíveis desfechos resultantes dessa exposição. Portanto, sua aplicação .......

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Biosafety cabinet	ESCO Airstream	AC2-452+C2:C26	Class II Type A2 Biological Safety Cabinet
Bottle top filter	Corning, US	430513	Non-pyrogenic, polystyrene, sterile. 1 filter/Bag. 0.22 μm, 500 mL.
Bovine serum albimun (BSA)	Gold Biotechnology, US	A-421-10	BSA Fatty Acid Free for cell culture
Culture media RPMI 1640	ThermoFisher-Gibco, US	31800-022	-
Fetal Bovine Serum (FBS)	ThermoFisher-Gibco, US	A4766801	-
Hemocytometer	Marienfeld, DE	640010	-
HepG2 cell line	ATCC, US	HB-8065	Hepatocellular carcinoma human cells.
Humidified incubator	Thermo Electronic Corporation,US	Model: 3110	Temperature (37 °C ± 1 °C), humidity (90% ± 5%) , CO2 (5% ± 1%)
Inverted microscope Eclipse	NIKON, JPN	Model: TE2000-S	-
Isopropanol	Sigma-Aldrich, US	I9030-4L	-
Oil Red O Kit	Abcam, US	ab150678	Kit for histological visualization of neutral fat.
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich, US	P6148-500G	-
Penicillin/streptomycin	ThermoFisher-Gibco, US	15140-122	Antibiotics 10,000 U/mL Penicillin, 10,000 μg/mL Streptomycin
pH meter	Beckman, US	Model: 360 PH/Temp/MV Meter	-
Phosphate buffered saline	ThermoFisher-Gibco, US	10010-023	-
Serological Pipettes	Sarstedt, AUS	86.1253.001	Non-pyrogenic, sterile, 5 mL
Serological Pipettes	Sarstedt, AUS	86.1254.001	Non-pyrogenic, sterile, 10 mL
Sodium bicarbonate	Sigma-Aldrich, US	S5761-1KG	Preparation of culture media
Sodium oleate	Santa Cruz Biotechnology, US	sc-215879A	-
Sodium palmitate	Santa Cruz Biotechnology, US	sc-215881	-
Syring filter	Corning, US	431219	Non-pyrogenic, sterile, 28 mm, 0.2 μm.
Trypan Blue	Sigma-Aldrich, US	T6146-25G	-
Trypsin 0.05% /EDTA 0.53 mM	Corning, US	25-052-Cl	-
24 well cell culture cluster	Corning, US	3524	Flat bottom with lid. Tissue culture treated. Nonpyrogenic, polystyrene, sterile. 1/Pack.
96 well cell culture cluster	Corning, US	3599	Flat bottom with lid. Tissue culture treated. Nonpyrogenic, polystyrene, sterile. 1/Pack.