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In questo articolo

  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

Questo protocollo vuole essere uno strumento per studiare la steatosi e i cambiamenti molecolari, biochimici, cellulari prodotti dalla sovraeposizione degli epatociti ai lipidi in vitro.

Abstract

La steatosi epatica associata alla disfunzione metabolica (MAFLD), precedentemente nota come steatosi epatica non alcolica (NAFLD), è la malattia epatica più diffusa in tutto il mondo a causa della sua relazione con obesità, diabete di tipo 2 e dislipidemia. La steatosi epatica, l'accumulo di goccioline lipidiche nel parenchima epatico, è una caratteristica chiave della malattia che precede l'infiammazione osservata nella steatoepatite, nella fibrosi e nella malattia epatica allo stadio terminale. L'accumulo di lipidi negli epatociti potrebbe interferire con il corretto metabolismo degli xenobiotici e delle molecole endogene, nonché indurre processi cellulari che portano all'avanzamento della malattia. Sebbene lo studio sperimentale della steatosi possa essere eseguito in vivo, gli approcci in vitro allo studio della steatosi sono strumenti complementari con diversi vantaggi. La coltura di epatociti in un mezzo condizionato da sovraccarico lipidico è un'eccellente opzione riproducibile per lo studio della steatosi epatica che consente l'identificazione dei processi cellulari legati all'accumulo lipidico, come stress ossidativo e reticolare, autofagia, proliferazione, morte cellulare, eccetera, nonché altri test tra cui l'efficacia dei farmaci e test tossicologici, tra molte altre possibili applicazioni. Qui, aveva lo scopo di descrivere la metodologia della coltura cellulare degli epatociti in mezzo condizionato da sovraccarico lipidico. Le cellule HepG2 sono state coltivate in terreno RMPI 1640 condizionato con palmitato di sodio e oleato di sodio. È importante sottolineare che il rapporto di questi due lipidi è fondamentale per favorire l'accumulo di goccioline lipidiche, pur mantenendo la proliferazione cellulare e un tasso di mortalità moderato, come accade nel fegato durante la malattia. Viene mostrata la metodologia, dalla preparazione delle scorte di soluzioni lipidiche, dalla miscela, dall'aggiunta al mezzo e dalla coltura degli epatociti. Con questo approccio, è possibile identificare goccioline lipidiche negli epatociti che sono facilmente osservabili dalla colorazione O rosso olio, nonché curve dei tassi di proliferazione / mortalità.

Introduzione

Il fegato grasso associato alla disfunzione metabolica è altamente prevalente in tutto il mondo1,2; si stima che fino al 25% della popolazione sia colpita3. Questa malattia precedentemente nota come steatosi epatica non alcolica (NAFLD), ha aggiornato la sua nomenclatura alla steatosi epatica associata alla disfunzione metabolica (MAFLD) per riflettere accuratamente la patogenesi correlata all'obesità, all'insulino-resistenza, al diabete di tipo 2 e alla dislipidemia, nonché le possibili gestione della malattia3,4.

Indipendentemente dal nome, la malattia comprende un ampio spettro di cambiamenti istopatologici caratterizzati da un accumulo anormalmente elevato di lipidi nel fegato (>5% di grasso negli epatociti5) e potrebbe progredire attraverso l'accumulo lipidico tipicamente riscontrato nella steatosi semplice alla steatoepatite, che a sua volta potrebbe portare allo sviluppo di fibrosi, cirrosi, carcinoma epatocellulare e insufficienzaepatica 5,6,7,8. A causa della sua crescente prevalenza, MAFLD dovrebbe diventare la prima indicazione del trapianto di fegato e la principale causa di carcinoma epatocellulare9.

Sebbene sia stata considerata una forma benigna o lieve di malattia del fegato grasso, la steatosi epatica è in realtà la chiave metabolica in MAFLD10. Diverse vie metaboliche sono influenzate dall'accumulo di lipidi nel fegato, inclusi ma non limitati alla sintesi lipidica, all'esportazione e al metabolismo10. La resistenza all'insulina, lo stress ossidativo, lo stress reticolare e la disfunzione cellulare sono fortemente associati alla linotossicitàepatica 11,12. D'altra parte, gli epatociti grassi sono il bersaglio delle specie reattive dell'ossigeno, rendendo metaboliti come perossidi lipidici, carbonili proteici e addotti di acidi nucleici13. A livello cellulare, gli epatociti grassi potrebbero subire danni mitocondriali14, senescenza cellulare15, apoptosi16, piroptosi12e autofagia17, tra gli altri eventi.

Gli epatociti sono altamente responsabili del metabolismo, della disintossicazione e della sintesi di una vasta gamma di molecole. Molte di queste funzioni potrebbero essere compromesse dall'accumulo lipidico osservato nella steatosi. Pertanto, è di grande importanza disporre di strumenti riproducibili che consentano una valutazione accurata della steatosi. In questo senso, i modelli in vitro sono facilmente applicabili e altamente riproducibili. La steatosi in vitro è stata utilizzata con diversi obiettivi16,18,19. Le cellule HepG2 sono ampiamente utilizzate come linea cellulare di epatociti. Ha vantaggi come essere facile da cultura e ben caratterizzato. Forse, l'unico svantaggio delle cellule HepG2 è il fatto che si tratta di una linea cellulare cancerogena, quindi questo deve essere considerato quando si analizzano i risultati. Qui, viene mostrata l'applicazione di una miscela di acidi grassi ampiamente utilizzati nella coltura cellulare: acido palmitico (PA) e acido oleico (OA). Sia PA che OA offrono risultati diversi nella cultura20. PA (C 16:0) è l'acido grasso saturo più comune ottenuto dalla dieta16. La PA è considerata un biomarcatore della lipogenesi de-novo,un passo cruciale nello sviluppo della NAFLD21. Il PA si è dimostrato altamente tossico22; pertanto, potrebbe non essere raccomandato indurre la steatosi in vitro. OA (C 18:1) è un acido grasso monoinsaturo. In contrasto con la PA, l'OA è stato suggerito per possedere proprietà antinfiammatorie e antiossidanti, essendo in grado di contrastare PA12. Sia PA che OA sono i principali acidi grassi presenti nei trigliceridi, indipendentemente dalle condizioni di salute o dalla malattia16. La Tabella 1 fornisce esempi della coltura di epatociti con PA, OA e la loro miscela, nonché i risultati riportati12,23,24,25,26,27. Altri acidi grassi sono stati utilizzati anche nella coltura degli epatociti, tra cui l'acido stearico (C 18:0)28,29,30,l'acido linoleico (C 18:1)28,30,31 e i suoi coniugati (CLA)28,32,l'acido palmitoleico (C 16:1)29. Tuttavia, il loro uso è meno frequentemente riportato in letteratura, forse perché la loro abbondanza epatica è inferiore a PA e OA16.

In combinazione, entrambi gli acidi grassi assomigliano alla steatosi in vitro, fornendo cellule proliferanti, con aumento della morte cellulare e minore vitalità rispetto alle condizioni di controllo. Vale la pena ricordare che i rispettivi sali di questi acidi grassi sono disponibili e possono essere utilizzati pure. Uno dei problemi principali nella valutazione del sovraccarico lipidico nella coltura cellulare degli epatociti è dato nella differenziazione tra modelli tossicologici e un modello che rappresenta al meglio la steatosi. Molti modelli possono essere contabilizzati nel primo caso. In effetti, l'uso della PA da solo potrebbe essere considerato tra questi, e l'alta mortalità è l'esito più evidente12,16,23,24,25,26,27. L'uso di dosi elevate anche nel caso di OA può anche essere considerato come un modello tossicologico. Il protocollo qui mostrato è in maggiore conformità con lo sviluppo della steatosi poiché mostra una bassa mortalità rispetto a quella osservata in altri modelli e consente di seguirlo per diversi giorni con accumulo lipidico progressivo come si verifica nella NAFLD. La possibilità di valutare la steatosi lieve e grave attraverso condizioni sperimentali è considerata un altro vantaggio.

AcidiCondizioniRisultatiRiferimento
BABBOConcentrazione: 200 μMAccumulo di lipidiYan et al, 201925.
Tempo di esposizione: 24 hDanno agli epatociti
Elevazione delle transaminasi
BABBOConcentrazione: 50, 100 e 200 μMAccumulo di lipidiXing et al, 201924.
Tempo di esposizione: 24 h
BABBOConcentrazione: 250 μM, 500 μM, 750 μM e 1.000 μMAccumulo di lipidiWang et al, 202026.
Tempo di esposizione: 24 hRiduzione progressiva della vitalità cellulare
Mix di OA/PAConcentrazione: 1 mMAccumulo di lipidiXiao et al, 202027.
Tempo di esposizione: 24 hNon segnala linotossicità
Tariffa: 2OA: 1PA
Mix di OA/PAPrima stimolazione con 200 μM e 400 μM di PA e poi seconda stimolazione con 200 μM di OAAccumulo di lipidi.Zeng et al, 202012.
Concentrazione:400 μM PA: 200 μM OAL'evidenza di licotossicità indotta dalla PA è stata ridotta dalla stimolazione dell'OA.
Tariffa: 2PA: 1OA
Tempo di esposizione: 24 h
Mix di OA/PAConcentrazione: 400 μM PA: 200 μM OAAccumulo di lipidiChen et al, 201823.
Tariffa: 2PA: 1OA
Tempo di esposizione: 24 h
Mix di OA/PAConcentrazione: 50 e 500 μMGenerazione di due tipi di steatosi: steatosi lieve e
steatosi grave.		Campos e Guzmán 2021
Tariffa: 2PA: 1OASimula l'esposizione cronica del sovraccarico lipidico
Tempo di esposizione: 24 h, 2 giorni, 3 giorni e 4 giorni.

Tabella 1. Coltura di epatociti in condizioni steatogene. La tabella presenta il tipo di acido grasso utilizzato, le condizioni mantenute e i risultati osservati nella coltura degli epatociti. PA: Acido palmitico. OA: Acido oleico.

Infine, questo modello è applicabile non solo allo studio della steatosi e del fegato grasso, ma anche alle vie epatiche metaboliche, sintetiche e di disintossicazione nel contesto della steatosi. Inoltre, la steatosi indotta in vitro potrebbe fornire prove per l'identificazione di potenziali marcatori della malattia e bersagli terapeutici.

Protocollo

1. Preparazione del mezzo standard e condizionato

  1. Per preparare rpmI 1640 standard, integrare il terreno di coltura RPMI 1640 con il 10% (v/v) di siero bovino fetale (FBS, precedentemente inattivato dal calore) e l'1% (v/v) di soluzione di penicillina-streptomicina. Conservare il mezzo a 4 °C.Sterilizzare utilizzando filtri da 0,22 μm.
  2. Per preparare la soluzione stock di palmitato, preparare una soluzione di palmitato da 50 mM nello standard RPMI 1640 precedentemente integrato con l'1% di albumina sierica bovina (priva di lipidi). Un volume di 5-10 ml di questo stock sarà sufficiente. Sterilizzare la soluzione stock utilizzando filtri da 0,22 μm. Conservare a 4 °C al riparo dalla luce per un massimo di 1 mese.
  3. Per preparare la soluzione stock di oleati, preparare una soluzione di oleato da 50 mM nello standard RPMI 1640 precedentemente integrato con l'1% di albumina sierica bovina (priva di lipidi). Un volume di 10 ml sarà sufficiente. Sterilizzare la soluzione stock utilizzando filtri da 0,22 μm. Conservare a -20 °C al riparo dalla luce per un massimo di 1 mese.
  4. Per preparare il mezzo steatogeno dalle scorte precedentemente preparate, preparare un palmitato in 1 parte: mezzo steatogeno oleato in 2 parti a due possibili livelli: steatosi lieve e grave.
    1. Steatosi lieve: Preparare 100 mL di palmitato in 1 parte: oleato in 2 parti (50 μM) miscela in RPMI 1640 standard. Sterilizzare utilizzando filtri da 0,22 μm. Conservare a 4 °C per un massimo di 1 settimana.
    2. Steatosi grave: preparare 100 mL di una miscela di palmitato in 1 parte: oleato in 2 parti (500 μM) in RPMI 1640 standard. Sterilizzare utilizzando filtri da 0,22 μm. Conservare a 4 °C per un massimo di 1 settimana.
    3. Preparazione alternativa per le soluzioni stock.
      1. Preparare entrambe le soluzioni stock utilizzando i rispettivi acidi grassi utilizzando l'albumina lipidica libera come indicato sopra.
      2. Quando manca l'albumina lipidica libera, utilizzare sali di palmitato e oleato.
        1. Sciogliere il palmitato o l'oleato in 2 ml di etanolo assoluto e quindi mescolare nel volume finale dello standard RPMI 1640 (5-10 ml). Sciogliere l'oleato direttamente mescolando nel terreno di coltura standard RPMI 1640.
        2. Consentire l'evaporazione dell'etanolo incubandolo a bagnomaria a 70 °C; mescolare accuratamente.
      3. In ogni caso, sterilizzare entrambe le soluzioni stock utilizzando filtri da 0,22 μm. Conservare la soluzione stock di palmitato a 4 °C e la soluzione stock di oleato a - 20 °C. Proteggi entrambe le soluzioni dalla luce. Queste soluzioni sono stabili per 1 mese.

2. Pre-cultura

  1. Semina 100.000 cellule HepG2 per pozzetti in una piastra a 24 pozzetti. Aggiungere 1 mL di RPMI 1640 standard.
  2. Pre-incubazione a 37 °C e 5% di CO2 per 24 ore, consentendo il fissaggio della cella.

3. Coltura steatogena

  1. Dopo la precoltura, scartare il mezzo standard RPMI 1640 e aggiungere il mezzo steatogeno di conseguenza.
  2. Scartare il surnatante e aggiungere un mezzo steatogeno fresco ogni 24 ore.

4. Valutazione della vitalità e della mortalità

  1. Semina 100.000 cellule HepG2 per pozzetti in una piastra a 24 pozzetti. Aggiungere 1 mL di RPMI 1640 standard.
  2. Pre-incubazione per 24 ore a 37 °C e 5% CO2.
  3. Cambiare il mezzo standard RPMI 1640 per il mezzo steatogeno.
  4. Incubare per 24 ore, 2 giorni, 3 giorni e 4 giorni rinfrescando il mezzo steatogeno ogni 24 ore.
  5. Dopo il tempo appropriato, scartare il surnatante.
  6. Staccare le cellule dal pozzo aggiungendo 500 μL di tripsina-EDTA allo 0,05%. Incubare per 5 minuti a 37 °C e 5% CO2.
  7. Raccogliere le cellule sospese in un microtubo.
  8. Centrifugare a 300 x g ed eliminare il surnatante.
  9. Aggiungere 200 μL di RPMI 1640 standard e risospentare le celle.
  10. Aggiungere 15 μL di soluzione blu di trypan allo 0,4% in un microtubo fresco. Mescolare con 15 μL della precedente sospensione cellulare.
  11. Contare le cellule macchiate e non macchiate in un emocitometro.
  12. Calcola i tassi di vitalità e mortalità di conseguenza.
    Vitalità =
    figure-protocol-4429
    Mortalità =
    figure-protocol-4514

5. Colorazione lipidica con Oil-Red O

  1. Metti una copertura di coltura cellulare in ogni pozzo in una piastra a 24 pozzetti.
  2. Semina 100.000 cellule HepG2 per pozzo. Aggiungere 1 mL di RPMI 1640 standard.
  3. Pre-incubazione a 37 °C e 5% CO2 per 24 ore.
  4. Cambiare il mezzo standard RPMI 1640 per il mezzo steatogeno.
  5. Incubare per 24 ore, 2 giorni, 3 giorni e 4 giorni, rinfrescando il mezzo steatogeno ogni 24 ore.
  6. Dopo il tempo appropriato, scartare il surnatante.
  7. Lavare con 1 mL di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS). Scartare il surnatante.
  8. Fissare con 1 ml di paraformaldeide al 4% in PBS.
  9. Incubare per 1 ora a temperatura ambiente.
  10. Scartare l'eccesso di paraformaldeide.
  11. Risciacquare le cellule con 1 mL di acqua distillata.
  12. Aggiungere 1 mL di isopropanolo al 70% e incubare per 5 min.
  13. Scartare l'eccesso di isopropanolo. Un lavaggio PBS non è necessario a questo punto.
  14. Aggiungere 1 mL di soluzione di O rosso olio e incubare per 30 minuti.
  15. Scartare l'eccesso della soluzione O rosso olio.
  16. Risciacquare con 1 mL di acqua distillata.
  17. Aggiungere 500 μL di soluzione di ematossilina. Incubare per 3 min.
  18. Scartare l'eccesso di soluzione di ematossilina.
  19. Risciacquare con 1 mL di acqua distillata.
  20. Osservare al microscopio con un ingrandimento di 400x (Obiettivo 40x, Oculare 10x).

6. Valutazione morfometrica del contenuto lipidico

  1. Seleziona e cattura in modo casuale fotografie di 10 campi ottici dall'area completa del pozzo. Ripeti per ogni pozzo.
  2. Valuta la percentuale di area macchiata di rosso utilizzando lo strumento Soglia colore nel software ImageJ secondo Ferreira e Rasband33.
  3. Confronta l'area macchiata con l'area completa del campo ottico utilizzando lo strumento Analizza particelle nel software ImageJ secondo Ferreira e Rasband33.
  4. Calcola la percentuale media di ogni pozzo.

Risultati

Gli epatociti coltivati nel mezzo steatogeno mostrano una crescita su tutta la superficie del pozzo; tuttavia, gli epatociti grassi mostrano un tasso di crescita inferiore rispetto alle cellule coltivate in mezzo di controllo. Il rapporto proposto e la concentrazione di OA e PA, garantiscono la sopravvivenza cellulare durante la coltura. La semina 1 x 105 cellule per pozzetti in piastre a 24 pozzetti fornisce una confluenza ottimale come mostrato nella Figura 1.

Discussione

Questo protocollo ha lo scopo di fornire una strategia per studiare la steatosi in vitro. La coltura cellulare è un potente strumento per studiare gli aspetti cellulari, molecolari, biochimici e tossicologici delle cellule esposte a diverse condizioni. Con questo approccio, la steatosi può essere visualizzata non solo come uno stadio della malattia complessa che è MAFLD, ma anche come la sovraesposizione degli epatociti ai lipidi e i possibili esiti derivanti da tale esposizione. Pertanto, la sua applicazione...

Divulgazioni

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Riconoscimenti

Questo lavoro è stato finanziato dal Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (Conacyt, CB-221137). Adriana Campos è una dottoranda presso il Programa de Doctorado en Ciencias Biomédicas, Universidad Nacional Autónoma de México, ed è stata sostenuta da Conacyt (CVU: 1002502).

Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
Biosafety cabinetESCO AirstreamAC2-452+C2:C26Class II Type A2 Biological Safety Cabinet
Bottle top filterCorning, US430513 Non-pyrogenic, polystyrene, sterile. 1 filter/Bag. 0.22 μm, 500 mL.
Bovine serum albimun (BSA)Gold Biotechnology, USA-421-10BSA Fatty Acid Free for cell culture
Culture media RPMI 1640ThermoFisher-Gibco, US31800-022-
Fetal Bovine Serum (FBS)ThermoFisher-Gibco, USA4766801-
HemocytometerMarienfeld, DE640010-
HepG2 cell lineATCC, USHB-8065Hepatocellular carcinoma human cells.
Humidified incubatorThermo Electronic Corporation,USModel: 3110Temperature (37 °C ± 1 °C), humidity (90% ± 5%) , CO2 (5% ± 1%)
Inverted microscope EclipseNIKON, JPNModel: TE2000-S-
IsopropanolSigma-Aldrich, USI9030-4L-
Oil Red O KitAbcam, USab150678Kit for histological visualization of neutral fat.
ParaformaldehydeSigma-Aldrich, USP6148-500G-
Penicillin/streptomycinThermoFisher-Gibco, US15140-122Antibiotics 10,000 U/mL Penicillin, 10,000 μg/mL Streptomycin
pH meterBeckman, USModel: 360 PH/Temp/MV Meter-
Phosphate buffered salineThermoFisher-Gibco, US10010-023-
Serological PipettesSarstedt, AUS86.1253.001 Non-pyrogenic, sterile, 5 mL
Serological PipettesSarstedt, AUS 86.1254.001 Non-pyrogenic, sterile, 10 mL
Sodium bicarbonateSigma-Aldrich, USS5761-1KGPreparation of culture media
Sodium oleateSanta Cruz Biotechnology, USsc-215879A-
Sodium palmitateSanta Cruz Biotechnology, USsc-215881-
Syring filterCorning, US431219 Non-pyrogenic, sterile, 28 mm, 0.2 μm.
Trypan BlueSigma-Aldrich, UST6146-25G-
Trypsin 0.05% /EDTA 0.53 mMCorning, US25-052-Cl-
24 well cell culture clusterCorning, US3524Flat bottom with lid. Tissue culture treated. Nonpyrogenic, polystyrene, sterile. 1/Pack.
96 well cell culture clusterCorning, US3599Flat bottom with lid. Tissue culture treated. Nonpyrogenic, polystyrene, sterile. 1/Pack.

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