用于鉴定黑色素瘤转移新介质的强大发现平台

摘要

本文介绍了用于测试黑色素瘤转移的新型候选介质及其作用机制的技术工作流程。

摘要

转移是一个复杂的过程，需要细胞克服仅通过 体外 测定不完全建模的障碍。使用稳健，可重复 的体内 模型和标准化方法建立了系统工作流程，以识别黑色素瘤转移的新参与者。这种方法允许在特定实验阶段进行数据推断，以精确表征基因在转移中的作用。通过将转基因黑色素瘤细胞通过心内，皮内或皮下注射引入小鼠，然后用连续 体内 成像进行监测来建立模型。一旦达到预先确定的终点，就会收获和处理原发性肿瘤和/或携带转移瘤的器官以进行各种分析。肿瘤细胞可以进行分类并经受几种“组学”平台中的任何一种，包括单细胞RNA测序。器官接受影像学和免疫组织病理学分析，以量化转移的总体负担并绘制其特定的解剖位置。这种优化的管道，包括用于移植，监测，组织收获，处理和分析的标准化方案，可以用于患者来源的短期培养物以及各种固体癌症类型的已建立的人和小鼠细胞系。

引言

与转移性黑色素瘤相关的高死亡率加上全球黑色素瘤发病率的增加¹ （预计到2025年将增加7.86%），需要新的治疗方法。靶标发现的进步取决于可重复的转移模型，这是一个高度复杂的过程。在转移级联反应的整个步骤中，黑色素瘤细胞必须克服无数障碍才能实现免疫系统的规避和远处组织的定植²。黑色素瘤细胞的弹性和适应性来自多种因素，包括它们的高基因突变负担³ 和它们的神经嵴起源，这赋予了关键的表型可塑性^3，4，5。在每个步骤中，转录程序允许转移性黑色素瘤细胞根据与微环境的串扰的线索从一种状态切换到另一种状态，包括免疫系统⁶，细胞外环境^7，8和它们接触的物理屏障⁹ 的细胞结构。例如，黑色素瘤细胞通过下调重要的免疫启动肿瘤分泌因子⁶的表达来逃避免疫监视。

研究描述了一种“前转移生态位”，其中黑色素瘤细胞分泌趋化因....

研究方案

注：以下协议中涉及的动物程序已获得纽约大学机构动物护理和使用委员会（IACUC）的批准。所有程序均在实验室动物护理国际评估和认证协会（AAALAC）批准的设施中进行。 图1 描述了一般的实验方法。

1. 患者来源的黑色素瘤短期培养 （STCs）

1. 将组织置于60mm培养皿中，其中1mL完全RPMI（RPMI 1640补充10%胎牛血清（FBS），2mM L-谷氨酰胺，1mM丙酮酸钠，1x MEM非必需氨基酸溶液和青霉素（100 IU / mL）/链霉素（100μg/ mL））。
   注意：为了增加肿瘤细胞的比例，如果需要，使用无菌手术器械在显微镜下解剖并去除培养皿中肿瘤周围的组织。
2. 使用灭菌剃须刀刀片将新鲜组织精细切割成1-2毫米的立方体。加入4 mL完全RPMI，并用10 mL血清学移液管将板的内容物上下移液5-10次。
3. 将细胞悬浮液转移到15mL聚丙烯锥形管中，并在4°C下将细胞向下旋转（180× g5 分钟）。吸出上清液，将细胞沉淀重悬于1mL新鲜培养基中，并将悬浮液转移到25cm² 组织培养瓶中。
4. 为了帮助组织片段附着在底部，将烧瓶在37°C，5_{%CO 2} 的组织培养箱中以20°-30°角倾斜20分钟。
5. 将烧瓶平放，....

结果

下图说明了所描述的工作流程如何应用于鉴定黑色素瘤转移的新驱动因素。 图2 总结了一项已发表的研究的结果，其中研究了沉默岩藻糖基转移酶FUT8 在体内 黑色素瘤转移中的作用²⁶。简而言之，对人类患者血糖数据（通过凝集素阵列获得）和转录组学分析的分析显示，与从原发性到转移性黑色素瘤进展相关的α-1，6-岩藻糖水平升高，与相应岩藻糖?.......

讨论

本技术报告的目的是为黑色素瘤转移中潜在参与者的调查提供标准化的自上而下的工作流程。由于 体内 实验可能既昂贵又耗时，因此最大限度地提高效率和增加所获信息价值的策略至关重要。

必须始终使用互补方法在同一实验中交叉验证结果。例如，NuMA免疫组化染色和BLI都是定量转移负荷的补充方法，因为两者都不是全面的。虽然BLI是一种在 体内跟踪肿瘤进?.......

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
#15 Scapel Blade	WPI	500242	For surgical procedures
#3 Scapel Handle	WPI	500236	For surgical procedures
1 mL Tuberculin syringe, slip tip	BD	309626	Injections
10 mL syringe, slip tip	BD	301029	Perfusion
10% Formalin Sodium Buffered	EK Industries	4499-20L	For perfusion/tissue fixative
15 mL Conical	Corning	430052	Cell culture
15 mL Conical Polypropylene Centrifuge Tubes	Falcon	352196	Cell culture
200 Proof Ethanol	Deacon Labs	04-355-223	Histology
22G – 22mm needle	BD	305156	Perfusion
4-0 Vicryl Suture	Ethicon	J464G	Suture
4% Carson's phosphate buffered paraformaldehyde	EMS	15733-10	For perfusion/tissue fixative
40µm	Corning	431750	Tissue processing
5-0 Absorbable Suture	Ethicon	6542000	Closure
50 mL Conical	Corning	430828	Cell culture
50mL Conical Polypropylene Centrifuge Tubes	Falcon	352070	Cell culture
7-0 Silk suture	FST	18020-70	Ligature
70µm	Corning	431751	Tissue processing
Anti-fade mounting media	Vector Labs	H-1000-10	Immunofluorescence
Approximator applying Forceps, 10cm	WPI	14189	For microsurgical procedures
Avance	Bruker	3 HD	NMR Console
Biospec 7030	Bruker	7030	Micro MRI
BSA	Bioreg	A941	NuMA Staining
Castroviejo suturing forceps, straight tips 5.5mm tying platform, 11cm	WPI	WP5025501	For microsurgical procedures
Coplin Staining Jar	Bel-Art	F44208-1000	Histology
DAPI	Sigma-Aldrich	D9542-1MG	Immunofluorescence
dCas9-KRAB	Addgene	110820	Genetic manipulation
DNase I	NEB	M0303L	Tissue processing
DPBS	Corning	21-030-CM	Tissue processing
Extra Sharp Uncoated Single Edge Blade	GEM	62-0167	Tissue processing
Extracellular Matrix Substrate	Corning	354234	Consider the Growth Factor Reduced ( as alternative
FBS	Cytiva	SH30910.03	Cell culture
Fiji Image J	Fiji Image J	Software	Immunofluorescence
Goat anti-rabbit HRP conjugated multimer	Thermo Fisher	A16104	NuMA Staining
Goat Serum	Gibco	PCN5000	Immunofluorescence
HBSS	Corning	21-020-CV	Tissue processing
Hematoxylin	Richard-Allan Scientific	7231	Histology
Illumina III	PerkinElmer	CLS136334	BLI Instrument
Insulin syringe 28G - 8mm needle	BD	329424	Injections
Insulin syringe 31G - 6mm needle	BD	326730	Injections
Iris Forceps, 10.2cm, Full Curve, serrated	WPI	504478	For perfusion and surgical procedures
Isoflurane USP	Covetrus	11695067772	Anesthesia
Jewelers #7 Forceps Titanium 11 cm 0.07 x 0.01 mm Tip	WPI	WP6570	For microsurgical procedures
Ketamine HCl 100mg/mL	Mylan Ind.	1049007	Anesthesia
lentiCRISPRv2	Addgene	98290	Genetic manipulation
Lycopersicon Esculentum (Tomato) Lectin, DyLight 649	Invitrogen	L32472	Vascular endothelial cells marker
MEM non-essential amino acids X 100	Corning	25-025-CI	Cell culture
Metzenbaum Scissors	WPI	503269	For surgical procedures
Microinjection Unit	KOPF	5000	Intracardiac injections
NaCl	Fisher	S25877	NuMA Staining
Needle 30G x 25mm	BD	305128	Intracardiac Injection
Needle 33G x 15mm	Hamilton	7747-01	Intracarotid Injection
Needle holder, Castroviejo, 14cm, with lock, 1.2mm Serrated Jaws	WPI	14137-G	For microsurgical procedures
NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ mice	The Jackson Laboratory	005557	Murine model
NU/J mice	The Jackson Laboratory	002019	Murine model
Nuclear Mitotic Apparatus Protein polyclonal rabbit anti-human	Abcam	97585	NuMA Staining
Penicillin-Streptomycin 10000U/mL	Gibco	15140122	Cell culture
Percoll	GE	0891-01	density separation solution
PI Classic Surgical Gloves	Cardinal Health	2D72PT75X	Surgery
pLKO Tet-On	Addgene	21915	Genetic manipulation
Povidone-Iodine 10% Solution	Medline	MDS093943	Surgery
Proparacaine Drops 0.5%	Akorn Pharma	AX0501	Opthalmic local anesthetic
Puralube Petrolatum Opthalmic Ointment	Dechra	83592	Anesthesia
Razor Blade Double Edge Blades	EMS	72000	Shaving and Vibrotome Brain Slicing
Reflex 9mm EZ Clip	Braintree	EZC- KIT	Wound closure
RPMI 1640	Corning	10-040-CM	Cell culture
Scissors, Spring 10.5cm Str, 8mm Blades	WPI	501235	For microsurgical procedures
Semi-Automatic Vibrating Blade Microtome	Leica	VT1200	Brain Slice Immunofluorescence
Single Channel Anesthesia Vaporizer System	Kent Scientific	VetFlo-1210S	Anesthesia
Smartbox Tabletop Chamber System and Exhaust Blower	EZ Systems	TT4000	CO2 Euthanasia
Sterile Fenestrated Disposable Drape	Medline	NON21002	Surgery
Sterile Non-Reinforced Aurora Surgical Gowns with Set-In Sleeves	Medline	DYNJP2715	Surgery
T25 Flask	Corning	430639	Cell culture
Tris	Corning	46-031-CM	NuMA Staining
Triton X-100	Sigma-Aldrich	X100-500ML	Immunofluorescence
Troutman tying forceps, 10cm, Curved G pattern, 0.52mm tip with tying platform	WPI	WP505210	For microsurgical procedures
Vessel clips 10G Pressure 5x 0.8mm Jaws, 5/pkg	WPI	15911	For microsurgical procedures
Visiopharm	Visiopharm	Visiopharm	NuMA Staining Quantification Software
Xylasine 100mg/mL	Akorn Pharma	59399-111-50	Anesthesia
Xylene	Fisher	X3P-1GAL	Histology