鹌鹑绒毛膜尿囊膜 - 光动力诊断和治疗的工具

摘要

禽胚胎的脉络膜尿囊膜（CAM）是各个研究领域非常有用和适用的工具。一种特殊的日本鹌鹑CAM卵外模型适用于光动力处理研究。

摘要

禽胚胎的脉络膜尿囊膜（CAM）是一种薄的胚胎外膜，作为主要的呼吸器官。其特性使其成为研究血管生成、肿瘤生长、药物输送系统或光动力诊断 （PDD） 和光动力疗法 （PDT） 的出色 体内 实验模型。同时，该模型解决了用合适的替代品替换实验动物的要求。 卵外 培养胚胎允许轻松的物质应用、访问、监测和记录。最常用的是小鸡凸轮;但是，本文介绍了日本鹌鹑CAM作为低成本和高通量模型的优势。另一个优点是胚胎发育较短，允许更高的实验周转率。本文探讨了鹌鹑CAM对癌症和微生物感染的PDD和PDT的适用性。作为示例，描述了使用光敏剂金丝桃素与脂蛋白或纳米颗粒组合作为递送系统。确定了白光图像的损伤评分和紫光（405 nm）下CAM组织荧光强度的变化，并分析了组织学切片。鹌鹑CAM清楚地显示了PDT对脉管系统和组织的影响。此外，还可以观察到毛细血管出血、血栓形成、小血管溶解和大血管出血等变化。日本鹌鹑CAM是一种很有前途的光动力诊断和治疗研究的 体内 模型，可用于肿瘤血管生成研究以及抗血管和抗菌治疗。

引言

鸡绒毛膜尿囊膜（CAM）模型是众所周知的，并广泛用于各个研究领域。它是一个血管丰富的胚胎外器官，提供气体交换和矿物质运输¹。由于该膜的透明度和可及性，可以实时观察单个血管及其结构变化²。尽管有这些优点，但雏鸡CAM也有一些限制（例如，更大的繁殖设施，鸡蛋生产和饲料消耗），可以通过使用其他鸟类来避免。在该协议中，描述了使用日本鹌鹑（Coturnix japonica）胚胎的替代卵外CAM模型。由于其体积小，它允许使用比鸡CAM更多的实验个体。此外，鹌鹑胚胎较短的16天胚胎发育是另一个优势。鹌鹑CAM上的第一个较大的血管出现在胚胎日（ED）7。这可以直接与雏鸡胚胎发育（4-35 阶段）进行比较;然而，发育的后期阶段不再具有可比性，并且鹌鹑胚胎需要更少的时间³.令人感兴趣的是类似于鸡CAMs的微血管分支^的定期发生4，^5，6。快速的性成熟，高产蛋量和低成本育种是支持使用这种实验模型⁷的其他例子。

禽CAM模型通常用于光动力疗法（PDT）研究⁸。PDT用于治疗几种形式的癌症（局部小肿瘤）和其他非肿瘤疾病。其原理是将荧光药物，光敏剂（PS）输送到受损组织，并用适当波长的光激活。研究中使用的一种前瞻性PS是金丝桃素，最初从药用植物圣约翰草（金丝桃连翘^）中分离出来9。这种化合物的强光敏作用是基于其光化学和光物理特性。其特征在于400-600nm范围内的多个荧光激发峰，其诱导约600nm处的荧光发射。金丝桃素在光谱带内的最大吸收值在540-590nm范围内，荧光最大值在590-640nm^范围内9。为了达到这些光敏效果，在局部给药¹⁰后，金丝桃素被波长为405nm的激光激发。在光的存在下，金丝桃素可表现出杀病毒，抗增殖和细胞毒性作用¹¹，而没有全身毒性，并且迅速从生物体中释放。金丝桃素是一种亲脂性物质，可形成不溶于水的非荧光聚集体，这就是为什么几种类型的纳米载体，例如聚合物纳米颗粒¹²，¹³或高密度和低密度脂蛋白（HDL，LDL）^14，15，用于帮助其递送和渗透到细胞中。由于CAM是一种天然免疫缺陷系统，肿瘤细胞可以直接植入膜表面。该模型也非常适合根据定义的分数^16，17 记录 PDT 诱导的血管损伤程度。与PDT相比，强度较低的光可用于光动力诊断（PDD）。在紫罗兰激发LED光下监测组织也会导致光敏剂¹⁸，¹⁹，²⁰的光活化，从而导致荧光的发射^，但它不能提供足够的能量来启动PDT反应并损害细胞。它使其成为肿瘤可视化和诊断或监测所用^PSs的药代动力学的良好工具14^，15。

本文介绍了存活率超过 80% 的卵 外 鹌鹑 CAM 测定的制备方法。这种 卵外 培养物成功地应用于大量的实验中。

研究方案

该研究是按照机构指南进行的。所有设备和试剂必须用70%乙醇或紫外线高压灭菌或灭菌。

1. 种蛋孵化

1. 在开始孵化之前，将受精鹌鹑蛋储存在10-15°C最多4-5天。仅使用干净且未损坏的鸡蛋。
2. 将种蛋在强制通风孵化器中孵化~53-54小时。在关闭种蛋旋转的情况下，在50%-60%的湿度和37.5°C的孵化温度下水平产卵。

2. 卵外 培养物制备

注意:初始孵化后，种蛋适合开始 卵外 培养。

1. 用 70% 乙醇消毒鸡蛋表面，不要旋转鸡蛋。
2. 在无菌层流柜中，使用小型无菌手术剪刀打开蛋壳并将内容物转移到 6 孔培养板中。如果做得好，胚胎将躺在未损坏的蛋黄上。每个鸡蛋后，用70%乙醇消毒剪刀。
3. 向 6 孔板的间隙中加入大约 5 mL 的无菌水，因为湿度对于防止 CAM 变干至关重要。
4. 将胚胎放入培养箱中直至进一步实验，同时保持37°C的温度和80%-90%的湿度。
5. 当 CAM 完全显影（从 ED7 开始）时，沿着小毛细管在 CAM 表面上放置一个无菌硅胶环（直径 6 mm，厚度约 1.5 mm）。放置戒指时避免使用主要血管。
   注意:环定义了工作区，有助于标记物质应用的位置，并防止液体内容物泄漏。
6. 根据国家法律终止胚胎培养。
7. 重要的是，在工作期间戴上手套或用70%乙醇消毒双手。用真空吸引器吸出未正确倾斜的胚胎或未受精卵。

图1: 离卵 培养物制备。 （A） 储存和孵化的日本鹌鹑蛋。（B）用乙醇对蛋表面进行消毒。（C）蛋壳用剪刀剪开。（D）将鸡蛋的内容物倒入井中。（E）适当准备的3天大的胚胎，并具有发育中的CAM脉管系统。（F）储存在培养箱中的培养板。 请点击此处查看此图的大图。

图 2:6 孔培养板，顶部放置胚胎和硅胶环。 请点击此处查看此图的大图。

3.肿瘤细胞接种

注意:所有程序都需要使用无菌层流柜。

1. 根据各自的培养方案在烧瓶中培养不同类型的贴壁细胞。
   1. 从烧瓶中取出旧培养基，并用无菌磷酸盐缓冲盐水（PBS）冲洗细胞层以去除培养基的痕量。
   2. 胰蛋白酶消化后，通过加入培养基抑制胰蛋白酶并将细胞收获到离心管中。离心细胞并将细胞沉淀重悬于新鲜培养基中。计数细胞并以所需浓度将其重悬于细胞培养基中。
      注意:也可以使用例如悬挂滴法²¹来生产3D细胞培养物，即球状体。
2. 将 1 x 10^5-1 x 10⁶ 个肿瘤细胞或 5-15 个球体（每个 CAM）植入 30 μL 细胞培养基溶液中，植入 CAM 顶部的硅胶环中。
   注意:体积取决于所用硅胶环的尺寸。如果使用直径较大的硅胶环，则需要更大的体积来覆盖整个区域。根据细胞类型或不同类型的实验，可以使用不同的细胞浓度。有时，CAM的精细刮削用于改善嵌入细胞的粘附。
3. 将带有接种细胞的CAM返回培养箱（37°C和80%-90%湿度）。

图3:用肿瘤接种CAM 。 （A）用移液管抽吸球体，以及（B）植入CAM表面。 请点击此处查看此图的大图。

4.光敏剂的应用

1. 金丝桃素的应用
   1. 在昏暗的灯光下，通过将金丝桃素溶解在100%二甲基亚砜（DMSO）中来制备2 mM金丝桃素储备溶液。在用无菌PBS或盐水溶液进行实验前不久准备79μM金丝桃素的工作溶液。确保所有溶液中DMSO的最终浓度始终低于0.2%，这不会影响胚胎的发育。
   2. 在无菌条件下，将适量的金丝桃素溶液涂在硅胶环上。30 μL 的体积足以填充直径为 6 mm 的环。
   3. 将胚胎保存在37°C和80%-90%湿度的培养箱中。水溶液中的金丝桃素在组织中单构化后具有光活性，在CAM上施用约3小时后。
2. 金丝桃素与低密度脂蛋白、高密度脂蛋白或纳米颗粒作为运输系统的应用
   注意:这些转运系统用于改善金丝桃素对细胞和细胞结构的渗透。
   1. 由于光敏性，请在昏暗的灯光下执行所有步骤，包括溶液的制备，并将溶液储存在黑暗中。
   2. 根据参考^文献15，通过在PBS中混合适当体积的脂蛋白和金丝桃素储备溶液来制备金丝桃素-LDL和金丝桃素-HDL制剂。LDL或HDL与金丝桃素的浓度为20:1¹⁵。
   3. 根据参考文献^12，13通过活阳离子开环聚合合成聚合物纳米颗粒。用PBS调节聚合物纳米颗粒中金丝桃素的浓度至10μM^12，13。

5. PDD 和 PDT

1. 进行PDD
   1. 在无菌条件下，在CAM表面上应用光敏剂（金丝桃素，加载金丝桃素的聚合物纳米颗粒或带有脂蛋白载体的金丝桃素），有或没有肿瘤细胞（ED 7-9）。
   2. 使用紫色激发光（405nm波长的定制圆形LED灯）照亮CAM，并在金丝桃素给药后0，1，3，5，24和48小时的时间间隔内用数码相机记录CAM组织和肿瘤细胞中金丝桃素的荧光。
   3. 如果研究需要白光下的CAM图像，请在金丝索霉素给药前和实验结束时，在组织固定前不久记录CAM，因为光会影响金丝桃素的光活化。
   4. 使用图像处理和分析程序（例如，ImageJ²²）评估荧光强度。
      1. 将 RGB 图像通道拆分为单独的红色、绿色和蓝色图像。以 8 位形式分析红色强度图像。评估环内区域的红色强度，并将其近似为金丝桃素荧光。在金丝桃素给药后（即从0小时，给药后立即到48小时）以不同的时间间隔获得整个图像配置文件图（使用ImageJ的配置文件图插件）。
2. 进行PDT
   1. 在金丝桃素应用后至少3小时进行PDT。
   2. 将光纤放在CAM表面上方，以使激光覆盖硅胶环内的整个区域。
   3. 用405nm激光以285mW^{/ cm 2}的通量率进行体内照射（1-2分钟）。
   4. 在光动力处理前后（24小时和48小时）使用白光和405nm荧光记录CAM。
   5. 从白光下拍摄的图像中检测PDT后24小时和48小时的光损伤。通过半定量评分¹⁶:1评估血管损伤 - 无破坏;2 - 部分关闭毛细管（直径≤10μm），不破坏中等或更大（直径≥50μm）和较小的血管（直径10-50μm）;3 - 部分关闭毛细血管消失的较小血管;4 - 较大血管部分关闭，较小血管和毛细血管消失;和 5 - 总光血栓形成，大部分血管消失。

图 4:用激光处理 CAM。 这张照片仅用于说明目的。对于 PDD 或 PDT，房间必须是黑暗的。 请点击此处查看此图的大图。

6. 准备 CAM 以进行进一步评估

1. 石蜡包埋
   1. 将CAM组织固定在PBS中含有4%多聚甲醛（PFA）的培养板中至少2小时，最多过夜。
   2. 取出PFA，小心地从CAM上切出硅胶环内的一部分组织。
   3. 立即使升序酒精系列中的CAM组织脱水，如下所示。将CAM组织置于70%乙醇中3分钟，伊红溶液2分钟（以便组织更容易在石蜡块中定位），96%乙醇3 x 5分钟（始终在新培养皿中），100%乙醇5分钟和二甲苯2 x 10分钟。
   4. 使用刮刀或细刷子，尽快将样品转移到培养皿（59°C）中溶解的石蜡中。24小时后，将组织置于组织学模具中，用石蜡包埋培养基填充，使其在冰箱中固化。从包埋介质上切下凝固的CAM，将其在托盘中旋转90°，再次用包埋介质填充，然后使其凝固。
   5. 在切片机上准备5-10μm切片进行组织病理学分析，以确定PDT诱导的损伤。
2. 用于组织学的冷冻CAM切片的制备
   注意:对于包括组织学在内的某些方法，在低温恒温器切片机上制备的冷冻切片更合适。请按照以下步骤准备冻结的 CAM 部分。
   1. 小心地将天然或 4% 多聚甲醛固定的 CAM 安装在载玻片上。
   2. 用最佳切割温度化合物（OCT）将嵌入模具填充成两半，并在液氮或干冰和乙醇的混合物中冷冻。
   3. 冷冻后，小心地倾斜CAM并将其从载玻片滑到冷冻的OCT介质的顶部。再次放入模具中，用OCT介质覆盖，并按照步骤6.2.2冷冻。
3. 鹌鹑CAM的分形分析
   注意:PDT引起的脉管系统变化可以通过计算分形维数^系数19来评估。
   1. 在层流柜中，将CAM溢在培养板中，该培养板具有4%多聚甲醛和2%戊二醛在PBS中的预热（37°C）固定溶液。
   2. 48小时后取出固定溶液。用微型剪刀和细刷小心地将CAM与胚胎分开，然后在PBS中清洗。
   3. 将洗好的 CAM 安装在载玻片上，让它慢慢干燥。
   4. 使用数码相机和透射仪作为均匀白光源拍摄载玻片。
   5. 使用 ImageJ 软件处理数字图像²².对于分析，从具有远端动脉分支的区域中选择一个正方形区域（512 × 512 像素）。按照参考^文献31中描述的程序对图像进行二值化和骨架化，并计算分形维数系数（Df）。
4. CAM组织的分子分析
   1. 对于分子分析，仔细分离天然CAM，在液氮中冷冻，并储存在-80°C。
   2. 根据 RNA 分离²³、逆转录为 cDNA 和定量 PCR²⁴ 的标准方案确定基因表达。

图 5:用于分形分析的 CAM 组织。 PDT 后，将 CAM 固定、安装在载玻片上并干燥以进行分形分析。照片是使用透射仪在白光下拍摄的。 请点击此处查看此图的大图。

结果

在白光下，CAM表面肿瘤的定位是困难的。用于PDD的光敏剂（此处为金丝桃素）有望被肿瘤选择性吸收，并有助于可视化肿瘤。添加金丝桃素和使用荧光灯（例如，405nm）可以很好地显示肿瘤（鳞状细胞癌TE1）的位置（图6A）。组织学分析显示重要的肿瘤细胞侵入健康组织。异常鳞状细胞的同心结构，通常在鳞状细胞癌组织（角蛋白珍珠）中描述，是可见的（图...

讨论

为了成功的 卵外 培养，遵循上述协议很重要。此外，如果鸡蛋打开得不够小心或在培养过程中湿度不足，蛋黄袋会粘在壳上并经常破裂。在鸡蛋孵化约60小时时开始卵 外 培养可确保胚胎的高存活率，因为它们已经足够大，可以在处理中存活下来。在后期发育阶段，CAM变薄并粘附在蛋壳上，导致膜破裂。

从孵化第7天开始，胚胎对搅拌的敏感性降低;CAM区几乎覆盖...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
6-Well Cell Culture Plate	Sarstedt	83.392	Transparent polystyrene, sterile
CO2 Incubator ESCO CCL-0508	ESCO, Singapore	CCL-050B-8	CO2 cell culture incubator
cryocut Leica CM 1800	Reichert-Jung, USA
digital camera Canon EOS 6D II	Canon, Japan
diode laser 405 nm	Ocean Optics, USA
DMSO	Sigma-Aldrich	67-68-5	dimethyl sulfoxid
eosin	Sigma-Aldrich	15086-94-9
ethanol	Sigma-Aldrich	64-17-5
fine brush size 2	Faber-Castell	281802	brush for CAM separation and manipulation
glutaraldehyde	Sigma-Aldrich	111-30-8
hematoxylin	Sigma-Aldrich	517-28-2
hypericin	Sigma-Aldrich	84082-80-4
incubator Bios Midi	Bios Sedlany, Czech Republic		Forced draught incubator for initial incubation
incubator Memmert IF160	Memmert, Germany		Forced air circulation incubator for CAM incubation
Kaiser slimlite plano, LED light box	Kaiser, Germany	2453	Transilluminator
LED light 405 nm			custom made circular LED light
macro lens Canon MP- E 65 mm f/2.8	Canon, Japan
microscope Kapa 2000	Kvant, Slovakia		optical microscope
microtome Auxilab 508	Auxilab, Spain		manual rotary microtome
paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	30525-89-4
Paraplast Plus	Sigma-Aldrich	P3683	parafin medium for tissue embedding
PBS	Sigma-Aldrich	P4417	Phosphate saline buffer
scissors Castroviejo	Orimed	OR66-108	micro scissors for CAM separation
software ImageJ 1.53	public domain		image processing and analysis program
stock solution HDL	Sigma-Aldrich	437641-10MG	high density lipoproteins
stock solution LDL	Sigma-Aldrich	437644-10MG	low density lipoproteins
Tissue-Tek O.C.T. Compound	Sakura Finetek	4583	Optimal Cutting Temperature Compound 118 mL squeeze bottles