Bıldırcın Korioallantoik Membran - Fotodinamik Tanı ve Tedavi için Bir Araç

Özet

Kuş embriyosunun koryoallantoik membranı (CAM), çeşitli araştırma alanları için çok yararlı ve uygulanabilir bir araçtır. Japon bıldırcın CAM'in özel bir ex ovo modeli, fotodinamik tedavi araştırması için uygundur.

Özet

Bir kuş embriyosunun koryoalantoik zarı (CAM), birincil solunum organı olarak işlev gören ince, ekstraembriyonik bir zardır. Özellikleri, anjiyogenez, tümör büyümesi, ilaç dağıtım sistemleri veya fotodinamik tanı (PDD) ve fotodinamik tedaviyi (PDT) incelemek için mükemmel bir in vivo deneysel model olmasını sağlar. Aynı zamanda, bu model deney hayvanlarının uygun bir alternatifle değiştirilmesi gerekliliğini de ele almaktadır. Ex ovo ekili embriyo, kolay madde uygulaması, erişimi, izleme ve dokümantasyon sağlar. En sık kullanılan civciv CAM'dir; ancak, bu makalede, Japon bıldırcın CAM'in düşük maliyetli ve yüksek verimli bir model olarak avantajları açıklanmaktadır. Diğer bir avantaj, daha yüksek deneysel ciroya izin veren daha kısa embriyonik gelişmedir. Bıldırcın TAT'ının kanser ve mikrobiyal enfeksiyonların PDD ve PDT'sine uygunluğu burada araştırılmıştır. Örnek olarak, fotosensitizör hiperisinin lipoproteinler veya nanopartiküller ile kombinasyon halinde bir dağıtım sistemi olarak kullanımı açıklanmaktadır. Beyaz ışıktaki görüntülerden kaynaklanan hasar skoru ve mor ışık altında (405 nm) CAM dokusunun floresan yoğunluğundaki değişiklikler, histolojik kesitlerin analizi ile birlikte belirlendi. Bıldırcın TAT PDT'nin vaskülatür ve doku üzerindeki etkisini açıkça göstermiştir. Ayrıca, kılcal kanama, tromboz, küçük damarların lizisi ve daha büyük damarların kanaması gibi değişiklikler gözlenebilir. Japon bıldırcın TAT fotodinamik tanı ve tedavi araştırmaları için umut verici bir in vivo modeldir ve tümör anjiyogenezinin yanı sıra antivasküler ve antimikrobiyal tedavi çalışmalarında da uygulamalar vardır.

Giriş

Tavuk koryoalantoik membran (CAM) modeli iyi bilinmektedir ve çeşitli araştırma alanlarında yaygın olarak kullanılmaktadır. Gaz değişimi ve mineral taşınımı sağlayan zengin vaskülarize ekstraembriyonik bir organdır¹. Bu zarın şeffaflığı ve erişilebilirliği nedeniyle, bireysel kan damarları ve yapısal değişiklikleri gerçek zamanlı olarak gözlemlenebilir². Avantajlarına rağmen, civciv CAM'ın diğer kuş türlerini kullanarak önlenebilecek bazı sınırlamaları (örneğin, daha büyük üreme tesisleri, yumurta üretimi ve yem tüketimi) vardır. Bu protokolde, Japon bıldırcın (Coturnix japonica) embriyosunu kullanan alternatif bir ex ovo CAM modeli tanımlanmıştır. Küçük boyutu nedeniyle, tavuk CAM'den çok daha fazla sayıda deneysel bireyin kullanılmasına izin verir. Ayrıca, bıldırcın embriyolarının 16 günlük embriyonik gelişiminin daha kısa olması başka bir avantajdır. Bıldırcın CAM üzerindeki ilk büyük damarlar embriyonik günde (ED) 7'de ortaya çıkar. Bu doğrudan civciv embriyo gelişimi ile karşılaştırılabilir (aşama 4-35); Bununla birlikte, gelişimin sonraki aşamaları artık karşılaştırılabilir değildir ve bıldırcın embriyosu³ için daha az zaman gerektirir. İlgi çekici olan, tavuk CAM'lerinin ^4,5,6'sına benzer mikrovasküler dallanmanın düzenli olarak ortaya çıkmasıdır. Hızlı cinsel olgunlaşma, yüksek yumurta üretimi ve düşük maliyetli üreme, bu deneysel modelin kullanımını destekleyen diğer örneklerdir⁷.

Bir kuş CAM modeli genellikle fotodinamik terapi (PDT) çalışmalarında kullanılır⁸. PDT, çeşitli kanser türlerini (küçük lokalize tümörler) ve diğer onkolojik olmayan hastalıkları tedavi etmek için kullanılır. İlkesi, bir floresan ilacın, bir fotosensitizörün (PS) hasarlı dokuya verilmesi ve uygun dalga boyundaki ışıkla aktivasyonudur. Araştırmada kullanılan prospektif PS, başlangıçta tıbbi bitki St. John's wort'tan (Hypericum perforatum) izole edilen hiperisindir9. Bu bileşiğin güçlü ışığa duyarlı etkileri, fotokimyasal ve fotofiziksel özelliklerine dayanmaktadır. Bunlar, yaklaşık 600 nm'de floresan emisyonunu indükleyen 400-600 nm aralığında çoklu floresan uyarma zirveleri ile karakterize edilir. Spektral bant içindeki hiperisin absorpsiyon maksimumu 540-590 nm aralığındadır ve floresan maksimumu 590-640 nm aralığında^9'dur. Bu ışığa duyarlı etkileri elde etmek için, hiperisin, yerel uygulamadan sonra 405 nm dalga boyunda lazer ışığı tarafından uyarılır¹⁰. Işık varlığında, hiperisin virücidal, antiproliferatif ve sitotoksik etkiler gösterebilir¹¹, sistemik toksisite yoktur ve organizmadan hızla salınır. Hiperisin, suda çözünmeyen, floresan olmayan agregalar oluşturan lipofilik bir maddedir, bu nedenle polimerik nanopartiküller 12,13 veya yüksek ve düşük yoğunluklu lipoproteinler (HDL, LDL) ^14,15 gibi çeşitli nanotaşıyıcı tipleri^, hücrelere verilmesine ve nüfuz etmesine yardımcı olmak için kullanılır. TAT doğal olarak immün yetmezlikli bir sistem olduğundan, tümör hücreleri doğrudan membran yüzeyine implante edilebilir. Model ayrıca, PDT'ye bağlı vasküler hasarın derecesini tanımlanmış bir skor ^16,17'ye göre kaydetmek için de çok uygundur. Fotodinamik tanı (PDD) için PDT'ye kıyasla daha düşük yoğunluklu ışık kullanılabilir. Menekşe uyarım LED ışığı altında dokunun izlenmesi aynı zamanda fotosensitizörlerin fotoaktivasyonuna yol açar^18,19,20 Bu da floresan ışık emisyonuna neden olur^, ancak bir PDT reaksiyonu başlatmak ve hücrelere zarar vermek için yeterli enerji sağlamaz. Tümör görselleştirme ve kullanılmış PSs^14,15'in farmakokinetiğini teşhis etmek veya izlemek için iyi bir araçtır.

Bu makalede, bıldırcın ex ovo CAM testinin% 80'in üzerinde hayatta kalma oranları ile hazırlanması anlatılmaktadır. Bu ex ovo kültürü çok sayıda deneyde başarıyla uygulanmıştır.

Protokol

Araştırma kurumsal kılavuzlara uygun olarak gerçekleştirilmiştir. Tüm ekipman ve reaktifler otoklavlanmalı veya %70 etanol veya UV ışığı ile sterilize edilmelidir.

1. Yumurta inkübasyonu

1. Döllenmiş bıldırcın yumurtalarını kuluçkaya başlamadan önce en fazla 4-5 gün boyunca 10-15 ° C'de saklayın. Sadece temiz ve hasarsız yumurtalar kullanın.
2. Yumurtaları ~ 53-54 saat boyunca zorla çekilen bir inkübatörde inkübe edin. Yumurtaları, yumurta dönüşü kapalıyken,% 50-60 nem ve 37.5 ° C kuluçka sıcaklığında yatay olarak yerleştirin.

2. Ex ovo kültür hazırlığı

NOT: İlk inkübasyondan sonra, yumurtalar ex ovo yetiştiriciliğine başlamak için uygundur.

1. Yumurta yüzeyini, yumurtayı döndürmeden% 70 etanol ile dezenfekte edin.
2. Steril laminer akışlı bir kabinde, yumurta kabuğunu küçük steril cerrahi makas kullanarak açın ve içeriği 6 delikli bir kültür plakasına aktarın. Düzgün bir şekilde yapılırsa, embriyo hasarsız bir yumurta sarısının üzerine uzanacaktır. Her yumurtadan sonra, makasları% 70 etanol ile dezenfekte edin.
3. 6 delikli plakadaki boşluklara yaklaşık 5 mL steril su ekleyin, çünkü CAM'ın kurumasını önlemek için nem gereklidir.
4. Embriyoları daha sonraki deneylere kadar bir inkübatöre yerleştirin, 37 ° C sıcaklık ve% 80 -% 90 nem oranını koruyun.
5. CAM tamamen geliştirildiğinde (ED7'den), küçük kılcal damarlar boyunca CAM yüzeyine sterilize edilmiş bir silikon halka (6 mm çapında ve yaklaşık 1,5 mm kalınlığında) yerleştirin. Halkayı yerleştirirken büyük kan damarlarından kaçının.
   NOT: Halka, çalışma alanını tanımlar, madde uygulama yerinin işaretlenmesine yardımcı olur ve sıvı içeriğinin dışarı sızmasını önler.
6. Embriyoların yetiştiriciliğini ülkenin mevzuatına göre sonlandırın.
7. Daha da önemlisi, eldiven giyin veya çalışma sırasında ellerinizi %70 etanol ile dezenfekte edin. Yanlış uçlanmış embriyoları veya döllenmemiş yumurtaları bir vakum aspiratörü ile aspire edin.

Resim 1: Ex ovo kültür hazırlığı. (A) Japon bıldırcın yumurtası depolandığı ve kuluçkaya yatırıldığı şekliyle. (B) Etanol ile yumurta yüzeyinin dezenfeksiyonu. (C) Yumurta kabuğu makasla kesilir. (D) Yumurtanın içeriği kuyuya boşaltılır. (E) TAT vaskülatürü gelişen, uygun şekilde hazırlanmış 3 günlük embriyo. (F) Bir inkübatörde saklanan kültür plakaları. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: Üstüne embriyolar ve silikon halkalar yerleştirilmiş 6 delikli kültür plakası. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

3. Tümör hücrelerinin aşılanması

NOT: Tüm prosedürler steril laminer akış kabininin kullanılmasını gerektirir.

1. İlgili kültür protokollerine göre şişelerdeki farklı yapışkan hücre tiplerini kültürleyin.
   1. Eski ortamı şişelerden çıkarın ve ortamın izlerini gidermek için hücre tabakasını steril fosfat tamponlu salin (PBS) ile durulayın.
   2. Tripsinizasyondan sonra, kültür ortamını ekleyerek tripsini inhibe edin ve hücreleri santrifüj tüplerine toplayın. Hücreleri santrifüj edin ve hücre peletini taze bir kültür ortamında yeniden askıya alın. Hücreleri sayın ve istenen konsantrasyonda bir hücre kültürü ortamında yeniden askıya alın.
      NOT: 3B hücre kültürleri, yani örneğin asılı bırakma yöntemi^21'i kullanarak sferoidler üretmek de mümkündür.
2. 1 x 10 5-1 x 10⁶ tümör hücresi veya^5-15 sferoid (CAM başına) 30 μL hücre orta çözeltisi içinde CAM'ın üstündeki silikon halkaya implante edin.
   NOT: Hacim, kullanılan silikon halkanın boyutuna bağlıdır. Daha büyük çaplı bir silikon halka kullanılıyorsa, tüm alanı kaplamak için daha büyük bir hacme ihtiyaç vardır. Hücre tipine bağlı olarak veya farklı deney türleri için çeşitli hücre konsantrasyonları kullanılabilir. Bazen, gömülü hücrelerin yapışmasını iyileştirmek için CAM'ın ince kazınması kullanılır.
3. Aşılanmış hücrelere sahip CAM'leri inkübatöre geri döndürün (37 °C ve% 80 -% 90 nem).

Şekil 3: TAT tümörlerinin aşılanması . (A) Sferoidlerin pipetle aspirasyonu ve (B) TAT yüzeyine implantasyonu. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

4. Fotosensitizör uygulaması

1. Hiperisin uygulaması
   1. Loş aydınlatma altında,% 100 dimetil sülfoksit (DMSO) içinde çözerek 2 mM'lik bir hiperisin stok çözeltisi hazırlayın. Steril PBS veya tuzlu su çözeltisi ile deneyden kısa bir süre önce 79 μM çalışan bir hiperisin çözeltisi hazırlayın. Tüm çözeltilerdeki DMSO'nun nihai konsantrasyonunun her zaman% 0.2'nin altında olduğundan emin olun, bu da embriyonun gelişimini etkilemez.
   2. Steril koşullar altında, silikon halkaya uygun miktarda hiperisin çözeltisi uygulayın. 6 mm çapında bir halkayı doldurmak için 30 μL'lik bir hacim yeterlidir.
   3. Embriyoları bir inkübatörde 37 ° C'de ve% 80 -% 90 nemde tutun. Sulu bir çözeltideki hiperisin, dokudaki monomerizasyonundan sonra, CAM üzerine uygulanmasından yaklaşık 3 saat sonra fotoaktiftir.
2. Hiperisinin LDL, HDL veya nanopartiküllerle taşıma sistemleri olarak uygulanması
   NOT: Bu taşıma sistemleri, hiperisinin hücrelere ve hücre yapılarına nüfuzunu artırmak için kullanılır.
   1. Fotosensitivite nedeniyle, çözeltilerin hazırlanması da dahil olmak üzere tüm adımları loş ışıkta gerçekleştirin ve çözümleri karanlıkta saklayın.
   2. PBS'de referans^15'e göre uygun hacimlerde lipoproteinler ve hiperisin stok çözeltileri karıştırarak hiperisin-LDL ve hiperisin-HDL formülasyonlarını hazırlayın. LDL veya HDL'nin hiperisin konsantrasyonu 20: 1^15'tir.
   3. Polimer nanopartikülleri,^12,13 referanslarına göre canlı katyonik halka açma polimerizasyonu ile ^sentezleyin. PBS ile polimer nanopartiküllerdeki hiperisin konsantrasyonunu 10 μM ^12,13'e ayarlayın.

5. PDD ve PDT

1. PDD Yürütme
   1. Steril koşullar altında, tümör hücreleri olsun veya olmasın, CAM yüzeyine fotosensitizör (hiperisin, hiperisin yüklü polimerik nanopartiküller veya lipoprotein taşıyıcılı hiperisin) uygulayın (ED 7-9).
   2. CAM'i mor uyarma ışığı (405 nm dalga boyunda özel yapım dairesel LED ışığı) kullanarak aydınlatın ve hiperisin uygulamasından sonra 0, 1, 3, 5, 24 ve 48 saatlik zaman aralıklarında CAM dokusundaki ve tümör hücrelerindeki hiperisin floresansını dijital bir kamera ile kaydedin.
   3. Araştırma TAT'ın beyaz ışıkta bir görüntüsünü gerektiriyorsa, ışık hiperisinin fotoaktivasyonunu etkilediğinden, hiperisin uygulamasından önce ve deneyin sonunda, doku fiksasyonundan kısa bir süre önce TAT'yi kaydedin.
   4. Bir görüntü işleme ve analiz programı kullanarak floresan yoğunluğunu değerlendirin (örneğin, ImageJ²²).
      1. RGB görüntü kanallarını ayrı kırmızı, yeşil ve mavi görüntülere bölün. Kırmızı yoğunluklu görüntüyü 8 bit biçiminde analiz edin. Halkanın içindeki alandan kırmızı yoğunluğu değerlendirin ve hiperisin floresansı olarak yaklaştırın. Tüm görüntü profili grafiklerini (ImageJ'nin Profile Plot eklentisini kullanarak) hiperisin uygulamasından sonra farklı zaman aralıklarında elde edin (yani, 0 saatten itibaren, uygulamadan hemen sonra, 48 saate kadar).
2. PDT Yürütme
   1. Hiperisin uygulamasından en az 3 saat sonra PDT'yi gerçekleştirin.
   2. Lazer ışınının silikon halka içindeki tüm alanı kaplaması için optik fiberi CAM yüzeyinin üzerine yerleştirin.
   3. 405 nm lazer ışığı ile 285 mW^/cm2 fluence hızında in vivo ışınlama (1-2 dakika) gerçekleştirin.
   4. Fotodinamik işlemden önce ve sonra (24 saat ve 48 saat) beyaz ışık ve 405 nm floresan ışık kullanarak CAM kaydedin.
   5. Beyaz ışıkta çekilen görüntülerden PDT'den 24 saat ve 48 saat sonra fotohasarı tespit edin. Vasküler hasarı yarı kantitatif bir skorla değerlendirin¹⁶: 1 - yıkım yok; 2 - orta veya daha büyük (çap ≤50 μm) ve daha küçük damarların (çap 10-50 μm) tahrip olmadan kılcal damarların (çap ≥10 μm) kısmi olarak kapatılması; 3 - kılcal damarların kaybolmasıyla daha küçük damarların kısmen kapanması; 4 - Daha küçük damarlar ve kılcal damarların kaybolması ile daha büyük damarların kısmen kapanması; ve 5 - damarların çoğunun kaybolduğu toplam fototromboz.

Şekil 4: TAT lazer ışığı ile tedavisi. Bu resim örnek amaçlı çekilmiştir. PDD veya PDT için oda karanlık olmalıdır. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

6. TAT'ın daha ileri değerlendirme için hazırlanması

1. Parafin gömme
   1. CAM dokusunu PBS'de% 4 paraformaldehit (PFA) içeren bir yetiştirme plakasına en az 2 saat ve maksimum bir gece boyunca sabitleyin.
   2. PFA'yı çıkarın ve CAM'den silikon halka içindeki dokunun bir kısmını dikkatlice kesin.
   3. Artan alkol serisindeki TAT dokusunu derhal aşağıdaki gibi dehidre edin. CAM dokusunu 3 dakika boyunca% 70 etanol, 2 dakika boyunca eozin çözeltisi (dokunun parafin bloğunda daha kolay yer alması için), 3 x 5 dakika için% 96 etanol (her zaman yeni bir Petri kabında) ve 5 dakika boyunca% 100 etanol ve 2 x 10 dakika boyunca ksilen içine yerleştirin.
   4. Spatula veya ince bir fırça kullanarak, numuneleri Petri kaplarındaki çözünmüş parafinlere (59 ° C) mümkün olduğunca çabuk aktarın. 24 saat sonra, dokuyu histolojik kalıba yerleştirin, parafin gömme ortamıyla doldurun ve buzdolabında katılaşmasına izin verin. Katılaştırılmış CAM'i gömme ortamından kesin, tepsiye 90° çevirin, gömme ortamıyla tekrar doldurun ve katılaşmasını bekleyin.
   5. PDT'ye bağlı hasarı belirlemek için histopatolojik analiz için mikrotom üzerinde 5-10 μm kesitler hazırlayın.
2. Histoloji için dondurulmuş CAM bölümlerinin hazırlanması
   NOT: Histoloji dahil bazı metodolojiler için kriyostat mikrotomu üzerine hazırlanan dondurulmuş kesitler daha uygundur. Dondurulmuş CAM bölümlerini hazırlamak için aşağıdaki adımları izleyin.
   1. Doğal veya% 4 paraformaldehit sabit CAM'i cam kızağa dikkatlice monte edin.
   2. Gömme kalıbını optimum kesme sıcaklığı bileşiği (OCT) ile yarıya kadar doldurun ve sıvı azot veya kuru buz ve etanol karışımında dondurun.
   3. Dondurulduktan sonra, CAM'ı dikkatlice eğin ve cam kaydırağından donmuş OCT ortamının üstüne kaydırın. Tekrar kalıba yerleştirin, OCT ortamı ile örtün ve Adım 6.2.2'deki gibi dondurun.
3. Bıldırcın CAM'ın fraktal analizi
   NOT: PDT'nin neden olduğu vaskülatür değişiklikleri, fraktal boyut katsayısı¹⁹ hesaplanarak değerlendirilebilir.
   1. Laminer akış kabininde, PBS'de% 4 paraformaldehit ve% 2 glutaraldehit önceden ısıtılmış (37 ° C) fiksasyon çözeltisi ile bir yetiştirme plakasında taşma CAM.
   2. Fiksasyon çözeltisini 48 saat sonra çıkarın. CAM'ı embriyodan mikro makas ve ince bir fırça ile dikkatlice ayırın ve PBS'de yıkayın.
   3. Yıkanmış CAM'i bir cam slayta monte edin ve yavaşça kurumasını bekleyin.
   4. Homojen beyaz ışık kaynağı olarak bir dijital kamera ve bir transilluminator kullanarak slaytın fotoğrafını çekin.
   5. ImageJ yazılımını kullanarak dijital görüntüleri işleyin²². Analiz için, distal arteriyel dalları olan alandan kare bir bölge (512 × 512 piksel) seçin. Görüntüleri binarize edin ve iskeletleştirin ve referans^31'de açıklanan prosedürleri izleyerek fraktal boyut katsayısını (Df) hesaplayın.
4. TAT dokusunun moleküler analizi
   1. Moleküler analiz için, doğal CAM'i dikkatlice ayırın, sıvı azotta dondurun ve -80 ° C'de saklayın.
   2. RNA izolasyonu²³, cDNA'ya ters transkripsiyon ve kantitatif PCR²⁴ için standart protokollere göre gen ekspresyonunu belirleyin.

Şekil 5: Fraktal analiz için TAT dokusu. PDT'den sonra, CAM sabitlenir, bir slayta monte edilir ve fraktal analiz için kurutulur. Resim bir transilluminator kullanılarak beyaz ışıkta çekildi. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Sonuçlar

Tümörün TAT yüzeyindeki lokalizasyonu beyaz ışıkta zordur. PDD'de kullanılan fotosensitizörün (burada, hiperisin) tümör tarafından seçici olarak alınması beklenir, ve tümörün görselleştirilmesine yardımcı olur. Hiperisin ilavesi ve floresan ışık kullanımı (örneğin, 405 nm) tümörün (skuamöz hücreli karsinom TE1) pozisyonunu çok iyi göstermiştir (Şekil 6A). Histolojik analiz, sağlıklı dokuları istila eden hayati tümör hücrelerini gösterdi. Genelli...

Tartışmalar

Başarılı ex ovo yetiştiriciliği için, yukarıdaki protokolü takip etmek önemlidir. Ayrıca, yumurtalar yeterince dikkatli açılmazsa veya ekim sırasında yetersiz nem varsa, yumurta sarısı çuvalı kabuğa yapışır ve sıklıkla yırtılır. Yaklaşık 60 saatlik yumurta inkübasyonu sırasında bir ex ovo yetiştiriciliğinin başlaması, embriyoların yüksek hayatta kalma oranını sağlar, çünkü bunlar zaten kullanımdan kurtulacak kadar büyüktür. Daha sonraki gelişim aşamalar?...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
6-Well Cell Culture Plate	Sarstedt	83.392	Transparent polystyrene, sterile
CO2 Incubator ESCO CCL-0508	ESCO, Singapore	CCL-050B-8	CO2 cell culture incubator
cryocut Leica CM 1800	Reichert-Jung, USA
digital camera Canon EOS 6D II	Canon, Japan
diode laser 405 nm	Ocean Optics, USA
DMSO	Sigma-Aldrich	67-68-5	dimethyl sulfoxid
eosin	Sigma-Aldrich	15086-94-9
ethanol	Sigma-Aldrich	64-17-5
fine brush size 2	Faber-Castell	281802	brush for CAM separation and manipulation
glutaraldehyde	Sigma-Aldrich	111-30-8
hematoxylin	Sigma-Aldrich	517-28-2
hypericin	Sigma-Aldrich	84082-80-4
incubator Bios Midi	Bios Sedlany, Czech Republic		Forced draught incubator for initial incubation
incubator Memmert IF160	Memmert, Germany		Forced air circulation incubator for CAM incubation
Kaiser slimlite plano, LED light box	Kaiser, Germany	2453	Transilluminator
LED light 405 nm			custom made circular LED light
macro lens Canon MP- E 65 mm f/2.8	Canon, Japan
microscope Kapa 2000	Kvant, Slovakia		optical microscope
microtome Auxilab 508	Auxilab, Spain		manual rotary microtome
paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	30525-89-4
Paraplast Plus	Sigma-Aldrich	P3683	parafin medium for tissue embedding
PBS	Sigma-Aldrich	P4417	Phosphate saline buffer
scissors Castroviejo	Orimed	OR66-108	micro scissors for CAM separation
software ImageJ 1.53	public domain		image processing and analysis program
stock solution HDL	Sigma-Aldrich	437641-10MG	high density lipoproteins
stock solution LDL	Sigma-Aldrich	437644-10MG	low density lipoproteins
Tissue-Tek O.C.T. Compound	Sakura Finetek	4583	Optimal Cutting Temperature Compound 118 mL squeeze bottles