Wachtel-Chorioallanto-Membran - ein Werkzeug für die photodynamische Diagnose und Therapie

Zusammenfassung

Die chorioallantoische Membran (CAM) des Vogelembryos ist ein sehr nützliches und anwendbares Werkzeug für verschiedene Forschungsbereiche. Ein spezielles Ex-Ovo-Modell der japanischen Wachtel-CAM eignet sich für die photodynamische Behandlungsuntersuchung.

Zusammenfassung

Die chorioallantoische Membran (CAM) eines Vogelembryos ist eine dünne, extraembryonale Membran, die als primäres Atmungsorgan fungiert. Seine Eigenschaften machen es zu einem ausgezeichneten experimentellen In-vivo-Modell zur Untersuchung von Angiogenese, Tumorwachstum, Medikamentenabgabesystemen oder photodynamischer Diagnose (PDD) und photodynamischer Therapie (PDT). Gleichzeitig adressiert dieses Modell die Anforderung, Versuchstiere durch eine geeignete Alternative zu ersetzen. Ex ovo kultivierter Embryo ermöglicht eine einfache Substanzanwendung, den Zugang, die Überwachung und die Dokumentation. Am häufigsten wird chick CAM verwendet; Dieser Artikel beschreibt jedoch die Vorteile der japanischen Wachtel-CAM als kostengünstiges Modell mit hohem Durchsatz. Ein weiterer Vorteil ist die kürzere Embryonalentwicklung, die einen höheren experimentellen Umsatz ermöglicht. Die Eignung von Wachtel-CAM für PDD und PDT von Krebs und mikrobiellen Infektionen wird hier untersucht. Als Beispiel wird die Verwendung des Photosensibilisators Hypericin in Kombination mit Lipoproteinen oder Nanopartikeln als Abgabesystem beschrieben. Der Schadenswert aus Bildern in weißem Licht und Änderungen der Fluoreszenzintensität des CAM-Gewebes unter violettem Licht (405 nm) wurde zusammen mit der Analyse histologischer Schnitte bestimmt. Die Wachtel-CAM zeigte deutlich die Wirkung der PDT auf das Gefäßsystem und das Gewebe. Darüber hinaus konnten Veränderungen wie Kapillarblutungen, Thrombosen, Lyse kleiner Gefäße und Blutungen größerer Gefäße beobachtet werden. Japanische Wachtel-CAM ist ein vielversprechendes In-vivo-Modell für die photodynamische Diagnose und Therapieforschung mit Anwendungen in Studien der Tumorangiogenese sowie der antivaskulären und antimikrobiellen Therapie.

Einleitung

Das Modell der Chorioallantoischen Hühnermembran (CAM) ist bekannt und in verschiedenen Forschungsbereichen weit verbreitet. Es ist ein reich vaskularisiertes extraembryonales Organ, das für Gasaustausch und Mineraltransport sorgt¹. Durch die Transparenz und Zugänglichkeit dieser Membran können einzelne Blutgefäße und ihre strukturellen Veränderungen in Echtzeit beobachtet werden². Trotz der Vorteile hat Küken-CAM auch einige Einschränkungen (z. B. größere Zuchtanlagen, Eierproduktion und Futterverbrauch), die durch die Verwendung anderer Vogelarten vermieden werden könnten. In diesem Protokoll wird ein alternatives Ex-Ovo-CAM-Modell mit japanischen Wachtelembryonen (Coturnix japonica) beschrieben. Aufgrund seiner geringen Größe ermöglicht es die Verwendung einer viel größeren Anzahl von experimentellen Individuen als Hühner-CAM. Darüber hinaus ist die kürzere 16-tägige Embryonalentwicklung von Wachtelembryonen ein weiterer Vorteil. Die ersten größeren Gefäße auf Wachtel-CAM erscheinen am Embryonaltag (ED) 7. Dies kann direkt mit der Entwicklung von Hühnerembryonen (Stadien 4-35) verglichen werden; Die späteren Entwicklungsstadien sind jedoch nicht mehr vergleichbar und benötigen weniger Zeit für den Wachtelembryo³. Von Interesse ist das regelmäßige Auftreten von mikrovaskulären Verzweigungen ähnlich denen von Hühner-CAMs ^4,5,6. Schnelle sexuelle Reifung, hohe Eierproduktion und kostengünstige Zucht sind weitere Beispiele, die die Verwendung dieses experimentellen Modells^{begünstigen 7}.

Ein Vogel-CAM-Modell wird häufig in Studien zur photodynamischen Therapie (PDT) verwendet⁸. Die PDT wird zur Behandlung verschiedener Krebsformen (kleine lokalisierte Tumore) und anderer nicht-onkologischer Erkrankungen eingesetzt. Sein Prinzip besteht in der Abgabe eines fluoreszierenden Arzneimittels, eines Photosensibilisators (PS), an das geschädigte Gewebe und dessen Aktivierung mit Licht der entsprechenden Wellenlänge. Ein prospektives PS, das in der Forschung verwendet wird, ist Hypericin, das ursprünglich aus der Heilpflanze Johanniskraut (Hypericum perforatum) isoliert ^wurde9. Die starke photosensibilisierende Wirkung dieser Verbindung beruht auf ihren photochemischen und photophysikalischen Eigenschaften. Diese zeichnen sich durch multiple Fluoreszenzanregungspeaks im Bereich von 400-600 nm aus, die die Emission von Fluoreszenz bei etwa 600 nm induzieren. Die Absorptionsmaxima von Hypericin innerhalb des Spektralbandes liegen im Bereich von 540-590 nm und die Fluoreszenzmaxima im Bereich von 590-640 nm⁹. Um diese photosensibilisierenden Effekte zu erzielen, wird Hypericin nach lokaler Verabreichung durch Laserlicht bei einer Wellenlänge von 405 nm angeregt¹⁰. In Gegenwart von Licht kann Hypericin viruzide, antiproliferative und zytotoxische Wirkungen zeigen¹¹, während keine systemische Toxizität vorliegt, und es wird schnell aus dem Organismus freigesetzt. Hypericin ist eine lipophile Substanz, die wasserunlösliche, nicht fluoreszierende Aggregate bildet, weshalb verschiedene Arten von Nanocarriern, wie polymere Nanopartikel 12,13 oder High- und Low-Density-Lipoproteine (HDL, LDL)^14,15, verwendet werden^, um seine Abgabe und das Eindringen in die Zellen zu unterstützen. Da CAM ein natürlich immundefizientes System ist, können Tumorzellen direkt auf der Membranoberfläche implantiert werden. Das Modell eignet sich auch gut, um das Ausmaß von PDT-induzierten Gefäßschäden nach einem definierten Score^16,17 zu erfassen. Licht mit geringerer Intensität im Vergleich zur PDT kann für die photodynamische Diagnose (PDD) verwendet werden. Die Überwachung des Gewebes unter violetter Anregung LED-Licht führt auch zur Photoaktivierung von Photosensibilisatoren^18,19,20, die zu einer Emission von fluoreszierendem Licht führt, aber nicht genug Energie liefert^, um eine PDT-Reaktion zu starten und die Zellen zu schädigen. Es macht es zu einem guten Werkzeug für die Tumorvisualisierung und Diagnose oder Überwachung der Pharmakokinetik von verwendeten PSs^14,15.

Dieser Artikel beschreibt die Herstellung des Wachtel-Ex-Ovo-CAM-Assays mit Überlebensraten von über 80%. Diese Ex-Ovo-Kultur wurde in einer Vielzahl von Experimenten erfolgreich angewendet.

Protokoll

Die Forschung wurde in Übereinstimmung mit institutionellen Richtlinien durchgeführt. Alle Geräte und Reagenzien müssen mit 70% Ethanol oder UV-Licht autoklaviert oder sterilisiert werden.

1. Inkubation der Eier

1. Lagern Sie befruchtete Wachteleier bei 10-15 °C für maximal 4-5 Tage, bevor Sie mit der Inkubation beginnen. Verwenden Sie nur saubere und unbeschädigte Eier.
2. Inkubieren Sie die Eier in einem Zwangszuginkubator für ~ 53-54 h. Legen Sie die Eier horizontal mit ausgeschalteter Eirotation, bei 50%-60% Luftfeuchtigkeit und 37,5 °C Inkubationstemperatur.

2. Ex ovo Kulturaufbereitung

HINWEIS: Nach der ersten Inkubation sind die Eier geeignet, um mit der Ex-Ovo-Kultivierung zu beginnen.

1. Desinfizieren Sie die Eioberfläche mit 70% Ethanol, ohne das Ei zu drehen.
2. Öffnen Sie in einem sterilen Laminar-Flow-Schrank die Eierschale mit einer kleinen sterilen chirurgischen Schere und geben Sie den Inhalt in eine 6-Well-Kulturplatte. Wenn es richtig gemacht wird, liegt der Embryo auf einem unbeschädigten Eigelb. Desinfizieren Sie die Schere nach jedem Ei mit 70% Ethanol.
3. Fügen Sie ca. 5 ml steriles Wasser in die Lücken in der 6-Well-Platte hinzu, da Feuchtigkeit unerlässlich ist, um das Austrocknen des CAM zu verhindern.
4. Legen Sie die Embryonen bis zu weiteren Versuchen in einen Inkubator, wobei eine Temperatur von 37 ° C und 80% -90% Luftfeuchtigkeit beibehalten wird.
5. Wenn das CAM vollständig entwickelt ist (ab ED7), legen Sie einen sterilisierten Silikonring (6 mm Durchmesser und ca. 1,5 mm dick) entlang der kleinen Kapillaren auf die CAM-Oberfläche. Vermeiden Sie größere Blutgefäße, wenn Sie den Ring platzieren.
   HINWEIS: Der Ring definiert den Arbeitsbereich, markiert den Ort der Stoffanwendung und verhindert, dass der Flüssigkeitsinhalt austritt.
6. Beenden Sie die Kultivierung der Embryonen gemäß der Gesetzgebung des Landes.
7. Wichtig ist, Handschuhe zu tragen oder die Hände während der Arbeit mit 70% Ethanol desinfiziert zu lassen. Saugen Sie falsch gekippte Embryonen oder unbefruchtete Eier mit einem Vakuumsauger ab.

Abbildung 1: Ex-ovo-Kulturvorbereitung . (A) Japanische Wachteleier bei der Lagerung und Bebrütung. (B) Desinfektion der Eioberfläche mit Ethanol. (C) Die Eierschale wird mit einer Schere geschnitten. (D) Der Inhalt des Eies wird in den Brunnen entleert. (E) Richtig vorbereiteter 3 Tage alter Embryo mit sich entwickelndem CAM-Gefäßsystem. (F) In einem Inkubator gelagerte Kulturplatten. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 2: 6-Well-Kulturplatte mit Embryonen und Silikonringen darauf. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

3. Impfung von Tumorzellen

HINWEIS: Alle Verfahren erfordern die Verwendung eines sterilen Laminar-Flow-Schranks.

1. Kultur verschiedener Arten von adhärenten Zellen in Kolben gemäß den jeweiligen Kulturprotokollen.
   1. Entfernen Sie das alte Medium aus den Kolben und spülen Sie die Zellschicht mit steriler phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) ab, um Spuren des Mediums zu entfernen.
   2. Nach der Trypsinisierung das Trypsin durch Zugabe des Kulturmediums hemmen und die Zellen in Zentrifugenröhrchen ernten. Zentrifugieren Sie die Zellen und resuspendieren Sie das Zellpellet in einem frischen Kulturmedium. Zählen Sie die Zellen und resuspendieren Sie sie in einem Zellkulturmedium in der gewünschten Konzentration.
      HINWEIS: Es ist auch möglich, 3D-Zellkulturen, d.h. Sphäroide, beispielsweise mit der Hanging-Drop-Methode²¹ herzustellen.
2. Implantieren Sie 1 x 10 5-1 x 10⁶ Tumorzellen oder^5-15 Sphäroide (pro CAM) in 30 μL Zellmediumlösung in den Silikonring auf der Oberseite des CAM.
   HINWEIS: Das Volumen hängt von der Größe des verwendeten Silikonrings ab. Wird ein Silikonring mit größerem Durchmesser verwendet, wird ein größeres Volumen benötigt, um die gesamte Fläche abzudecken. Je nach Zelltyp oder für verschiedene Arten von Experimenten können unterschiedliche Zellkonzentrationen verwendet werden. Manchmal wird feines Scraping von CAM verwendet, um die Haftung der eingebetteten Zellen zu verbessern.
3. Geben Sie die CAMs mit den beimpften Zellen in den Inkubator zurück (37 °C und 80%-90% Luftfeuchtigkeit).

Abbildung 3: Impfung von CAM mit Tumoren. (A) Aspiration von Sphäroiden mit einer Pipette und (B) Implantation auf der CAM-Oberfläche. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

4. Anwendung von Photosensibilisator

1. Anwendung von Hypericin
   1. Bereiten Sie bei schwachem Licht eine 2 mM Stammlösung von Hypericin vor, indem Sie sie in 100% Dimethylsulfoxid (DMSO) auflösen. Bereiten Sie kurz vor dem Versuch eine 79 μM Arbeitslösung von Hypericin mit steriler PBS- oder Kochsalzlösung vor. Stellen Sie sicher, dass die Endkonzentration von DMSO in allen Lösungen immer unter 0,2% liegt, was die Entwicklung des Embryos nicht beeinträchtigt.
   2. Unter sterilen Bedingungen ein geeignetes Volumen Hypericinlösung auf den Silikonring auftragen. Ein Volumen von 30 μL reicht aus, um einen Ring mit einem Durchmesser von 6 mm zu füllen.
   3. Bewahren Sie die Embryonen in einem Inkubator bei 37 °C und 80%-90% Luftfeuchtigkeit auf. Hypericin in einer wässrigen Lösung ist nach seiner Monomerisierung im Gewebe photoaktiv, etwa 3 h nach seiner Anwendung auf dem CAM.
2. Anwendung von Hypericin mit LDL, HDL oder Nanopartikeln als Transportsysteme
   HINWEIS: Diese Transportsysteme werden verwendet, um das Eindringen von Hypericin in Zellen und Zellstrukturen zu verbessern.
   1. Aufgrund der Lichtempfindlichkeit führen Sie alle Schritte, einschließlich der Vorbereitung der Lösungen, bei schwachem Licht durch und lagern Sie die Lösungen im Dunkeln.
   2. Die Hypericin-LDL- und Hypericin-HDL-Formulierungen werden durch Mischen geeigneter Mengen von Lipoproteinen und Hypericin-Stammlösungen in PBS gemäß Referenz¹⁵ hergestellt. Die Konzentration von LDL oder HDL zu Hypericin beträgt 20:1¹⁵.
   3. Synthese von Polymernanopartikeln durch lebende kationische Ringöffnungspolymerisation gemäß Referenz^12,13. Die Konzentration von Hypericin in Polymernanopartikeln mit PBS wird auf 10 μM^12,13 eingestellt.

5. PDD und PDT

1. PDD durchführen
   1. Unter sterilen Bedingungen Photosensibilisator (Hypericin, Hypericin-beladene polymere Nanopartikel oder Hypericin mit Lipoproteinträger) auf die CAM-Oberfläche auftragen, mit oder ohne Tumorzellen (ED 7-9).
   2. Beleuchten Sie das CAM mit violettem Anregungslicht (maßgeschneidertes kreisförmiges LED-Licht mit 405 nm Wellenlänge) und erfassen Sie die Fluoreszenz von Hypericin in CAM-Gewebe- und Tumorzellen mit einer Digitalkamera in Zeitintervallen von 0, 1, 3, 5, 24 und 48 h nach Hypericin-Verabreichung.
   3. Wenn die Forschung ein Bild der CAM in weißem Licht erfordert, zeichnen Sie die CAM vor der Hypericin-Verabreichung und am Ende des Experiments, kurz vor der Gewebefixierung, auf, da das Licht die Photoaktivierung von Hypericin beeinflusst.
   4. Bewerten Sie die Fluoreszenzintensität mit einem Bildverarbeitungs- und Analyseprogramm (z. B. ImageJ²²).
      1. Teilen Sie RGB-Bildkanäle in separate Rot-, Grün- und Blaubilder auf. Analysieren Sie das Bild mit roter Intensität in 8-Bit-Form. Bewerten Sie die Rotintensität aus dem Bereich innerhalb des Rings und nähern Sie sich ihr als Hypericinfluoreszenz an. Erhalten Sie ganze Bildprofildiagramme (mit dem Profilplot-Plugin von ImageJ) in verschiedenen Zeitintervallen nach der Hypericin-Verabreichung (d.h. von 0 h, direkt nach der Verabreichung, bis zu 48 h).
2. PDT durchführen
   1. Führen Sie die PDT mindestens 3 h nach der Hypericin-Anwendung durch.
   2. Platzieren Sie die optische Faser über der Oberfläche des CAM, damit der Laserstrahl den gesamten Bereich innerhalb des Silikonrings bedeckt.
   3. Durchführung einer In-vivo-Bestrahlung (1-2 min) mit einem 405 nm Laserlicht bei einer Flukenzrate von 285 mW/^cm2.
   4. Aufzeichnung von CAM mit weißem Licht und 405 nm Fluoreszenzlicht vor und nach der photodynamischen Behandlung (24 h und 48 h).
   5. Erkennen Sie Lichtschäden 24 h und 48 h nach PDT aus den Bildern, die in weißem Licht aufgenommen wurden. Bewerten Sie Gefäßschäden mit einem semiquantitativen Score¹⁶: 1 - keine Zerstörung; 2 - teilweiser Verschluss der Kapillaren (Durchmesser ≤10 μm) ohne Zerstörung von mittleren oder größeren (Durchmesser ≥50 μm) und kleineren Gefäßen (Durchmesser 10-50 μm); 3 - teilweiser Verschluss kleinerer Gefäße mit verschwindenden Kapillaren; 4 - teilweiser Verschluss größerer Gefäße mit kleineren Gefäßen und Kapillaren, die verschwinden; und 5 - totale Photothrombose mit den meisten Gefäßen verschwinden.

Abbildung 4: Behandlung von CAM mit Laserlicht. Dieses Bild wurde zur Veranschaulichung aufgenommen. Für PDD oder PDT muss der Raum dunkel sein. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

6. CAM für die weitere Evaluierung vorbereiten

1. Paraffin-Einbettung
   1. Fixieren Sie das CAM-Gewebe in einer Kultivierungsplatte mit 4% Paraformaldehyd (PFA) in PBS für mindestens 2 h und maximal über Nacht.
   2. Entfernen Sie das PFA und schneiden Sie vorsichtig einen Teil des Gewebes im Silikonring aus dem CAM aus.
   3. Dehydrieren Sie sofort das CAM-Gewebe in aufsteigender Alkoholserie wie folgt. Legen Sie das CAM-Gewebe in 70% Ethanol für 3 min, Eosinlösung für 2 min (zur leichteren Lokalisierung des Gewebes im Paraffinblock), 96% Ethanol für 3 x 5 min (immer in einer neuen Petrischale) und 100% Ethanol für 5 min und Xylol für 2 x 10 min.
   4. Mit einem Spatel oder einer dünnen Bürste werden die Proben so schnell wie möglich in das gelöste Paraffin in Petrischalen (59 °C) überführt. Nach 24 h legen Sie das Gewebe in eine histologische Form, füllen Sie es mit Paraffin-Einbettungsmedium und lassen Sie es im Kühlschrank erstarren. Schneiden Sie das erstarrte CAM aus dem Einbettmedium, drehen Sie es im Fach um 90°, füllen Sie es erneut mit dem Einbettmedium und lassen Sie es erstarren.
   5. Bereiten Sie 5-10 μm Schnitte auf einem Mikrotom für die histopathologische Analyse vor, um PDT-induzierte Schäden zu bestimmen.
2. Vorbereitung von eingefrorenen CAM-Profilen für die Histologie
   HINWEIS: Für einige Methoden, einschließlich Histologie, sind gefrorene Schnitte, die auf Kryostatmikrotom hergestellt wurden, besser geeignet. Führen Sie die folgenden Schritte aus, um die eingefrorenen CAM-Abschnitte vorzubereiten.
   1. Montieren Sie vorsichtig natives oder 4% paraformaldehyd-fixiertes CAM auf dem Objektträger.
   2. Füllen Sie die Einbettungsform zur Hälfte mit der optimalen Schnitttemperaturverbindung (OCT) und frieren Sie sie in flüssigem Stickstoff oder einer Mischung aus Trockeneis und Ethanol ein.
   3. Nach dem Einfrieren das CAM vorsichtig kippen und schieben Sie es vom Glasobjektträger auf die Oberseite des gefrorenen OCT-Mediums. Erneut in die Form geben, mit OCT-Medium abdecken und wie in Schritt 6.2.2 einfrieren.
3. Fraktale Analyse von Wachtel-CAM
   ANMERKUNG: Durch PDT verursachte Gefäßveränderungen können durch Berechnung des fraktalen Dimensionskoeffizienten¹⁹ beurteilt werden.
   1. Im Laminar-Flow-Schrank CAM in einer Kultivierungsplatte mit einer vorgewärmten (37 °C) Fixierungslösung aus 4% Paraformaldehyd und 2% Glutaraldehyd in PBS überlaufen.
   2. Entfernen Sie die Fixierlösung nach 48 h. Trennen Sie das CAM vorsichtig mit einer Mikroschere und einer feinen Bürste vom Embryo und waschen Sie es in PBS.
   3. Montieren Sie das gewaschene CAM auf einem Glasobjektträger und lassen Sie es langsam trocknen.
   4. Fotografieren Sie das Dia mit einer Digitalkamera und einem Transilluminator als Quelle für homogenes weißes Licht.
   5. Digitale Bilder mit der ImageJ-Software²² verarbeiten. Wählen Sie für die Analyse einen quadratischen Bereich (512 × 512 Pixel) aus dem Bereich mit distalen arteriellen Ästen aus. Binarisieren und skelettieren Sie die Bilder und berechnen Sie den fraktalen Dimensionskoeffizienten (Df) gemäß den in Referenz³¹ beschriebenen Verfahren.
4. Molekulare Analyse von CAM-Gewebe
   1. Für die molekulare Analyse natives CAM sorgfältig trennen, in flüssigem Stickstoff einfrieren und bei -80 °C lagern.
   2. Bestimmung der Genexpression gemäß Standardprotokollen für RNA-Isolierung²³, reverse Transkription in cDNA und quantitative PCR²⁴.

Abbildung 5: CAM-Gewebe für die fraktale Analyse. Nach der PDT wird CAM fixiert, auf einen Objektträger montiert und für die fraktale Analyse getrocknet. Das Bild wurde in weißem Licht mit einem Transilluminator aufgenommen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Ergebnisse

Die Lokalisation des Tumors auf der CAM-Oberfläche ist bei weißem Licht schwierig. Es wird erwartet, dass der bei PDD verwendete Photosensibilisator (hier Hypericin) selektiv vom Tumor aufgenommen wird und hilft, den Tumor sichtbar zu machen. Die Zugabe von Hypericin und die Verwendung von Fluoreszenzlicht (z.B. 405 nm) zeigten die Position des Tumors (Plattenepithelkarzinom TE1) sehr gut (Abbildung 6A). Die histologische Analyse zeigte, dass lebenswichtige Tumorzellen in gesundes Gewebe e...

Diskussion

Für einen erfolgreichen Ex-Ovo-Anbau ist es wichtig, das obige Protokoll zu befolgen. Wenn die Eier nicht sorgfältig genug geöffnet werden oder während der Kultivierung nicht genügend Feuchtigkeit vorhanden ist, haftet der Dottersack an der Schale und reißt oft. Der Beginn einer Ex-Ovo-Kultivierung zum Zeitpunkt von ca. 60 h Eiinkubation sichert die hohe Überlebensrate der Embryonen, da sie bereits groß genug sind, um die Handhabung zu überstehen. In den späteren Entwicklungsstadien wird das C...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
6-Well Cell Culture Plate	Sarstedt	83.392	Transparent polystyrene, sterile
CO2 Incubator ESCO CCL-0508	ESCO, Singapore	CCL-050B-8	CO2 cell culture incubator
cryocut Leica CM 1800	Reichert-Jung, USA
digital camera Canon EOS 6D II	Canon, Japan
diode laser 405 nm	Ocean Optics, USA
DMSO	Sigma-Aldrich	67-68-5	dimethyl sulfoxid
eosin	Sigma-Aldrich	15086-94-9
ethanol	Sigma-Aldrich	64-17-5
fine brush size 2	Faber-Castell	281802	brush for CAM separation and manipulation
glutaraldehyde	Sigma-Aldrich	111-30-8
hematoxylin	Sigma-Aldrich	517-28-2
hypericin	Sigma-Aldrich	84082-80-4
incubator Bios Midi	Bios Sedlany, Czech Republic		Forced draught incubator for initial incubation
incubator Memmert IF160	Memmert, Germany		Forced air circulation incubator for CAM incubation
Kaiser slimlite plano, LED light box	Kaiser, Germany	2453	Transilluminator
LED light 405 nm			custom made circular LED light
macro lens Canon MP- E 65 mm f/2.8	Canon, Japan
microscope Kapa 2000	Kvant, Slovakia		optical microscope
microtome Auxilab 508	Auxilab, Spain		manual rotary microtome
paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	30525-89-4
Paraplast Plus	Sigma-Aldrich	P3683	parafin medium for tissue embedding
PBS	Sigma-Aldrich	P4417	Phosphate saline buffer
scissors Castroviejo	Orimed	OR66-108	micro scissors for CAM separation
software ImageJ 1.53	public domain		image processing and analysis program
stock solution HDL	Sigma-Aldrich	437641-10MG	high density lipoproteins
stock solution LDL	Sigma-Aldrich	437644-10MG	low density lipoproteins
Tissue-Tek O.C.T. Compound	Sakura Finetek	4583	Optimal Cutting Temperature Compound 118 mL squeeze bottles