Membrane chorio-allantoïdienne de caille - Un outil pour le diagnostic photodynamique et la thérapie

Résumé

La membrane chorio-allantoïdienne (CAM) de l’embryon aviaire est un outil très utile et applicable pour divers domaines de recherche. Un modèle ex ovo spécial de CAM de caille japonaise convient à l’investigation de traitement photodynamique.

Résumé

La membrane chorio-allantoïdienne (CAM) d’un embryon aviaire est une fine membrane extraembryonnaire qui fonctionne comme un organe respiratoire primaire. Ses propriétés en font un excellent modèle expérimental in vivo pour étudier l’angiogenèse, la croissance tumorale, les systèmes d’administration de médicaments ou le diagnostic photodynamique (PDD) et la thérapie photodynamique (PDT). Dans le même temps, ce modèle répond à la nécessité de remplacer les animaux de laboratoire par une alternative appropriée. L’embryon cultivé ex ovo permet une application, un accès, une surveillance et une documentation faciles de la substance. Le plus fréquemment utilisé est le poussin CAM; cependant, cet article décrit les avantages de la FAO de caille japonaise en tant que modèle à faible coût et à haut débit. Un autre avantage est le développement embryonnaire plus court, qui permet un renouvellement expérimental plus élevé. La pertinence de la MCP de caille pour le TDP et la TPD du cancer et des infections microbiennes est explorée ici. À titre d’exemple, l’utilisation de l’hypericine photosensibilisatrice en combinaison avec des lipoprotéines ou des nanoparticules comme système d’administration est décrite. Le score de dommages à partir d’images en lumière blanche et de changements dans l’intensité de fluorescence du tissu CAM sous lumière violette (405 nm) a été déterminé, ainsi que l’analyse des coupes histologiques. La CAM de caille a clairement montré l’effet de la PDT sur le système vasculaire et les tissus. De plus, des changements tels qu’une hémorragie capillaire, une thrombose, une lyse de petits vaisseaux et un saignement de vaisseaux plus gros ont pu être observés. La MCP de caille japonaise est un modèle in vivo prometteur pour le diagnostic photodynamique et la recherche thérapeutique, avec des applications dans les études de l’angiogenèse tumorale, ainsi que dans la thérapie antivasculaire et antimicrobienne.

Introduction

Le modèle de membrane chorio-allantoïdienne (CAM) de poulet est bien connu et largement utilisé dans divers domaines de recherche. C’est un organe extraembryonnaire richement vascularisé qui assure les échanges gazeux et le transport des minéraux¹. Grâce à la transparence et à l’accessibilité de cette membrane, les vaisseaux sanguins individuels et leurs changements structurels peuvent être observés en temps réel². Malgré les avantages, la MCP des poussins présente également certaines limites (p. ex., des installations d’élevage plus grandes, la production d’œufs et la consommation d’aliments) qui pourraient être évitées en utilisant d’autres espèces aviaires. Dans ce protocole, un modèle alternatif ex ovo CAM utilisant un embryon de caille japonaise (Coturnix japonica) est décrit. En raison de sa petite taille, il permet l’utilisation d’un nombre beaucoup plus important d’individus expérimentaux que le poulet CAM. De plus, le développement embryonnaire plus court de 16 jours des embryons de caille est un autre avantage. Les premiers vaisseaux plus gros sur la CAM de caille apparaissent le jour embryonnaire (ED) 7. Cela peut être directement comparé au développement de l’embryon de poussin (stades 4-35); Cependant, les stades ultérieurs de développement ne sont plus comparables et nécessitent moins de temps pour l’embryon de caille³. Il est intéressant de noter l’apparition régulière de ramifications microvasculaires similaires à celles des CAM ^4,5,6 chez le poulet. La maturation sexuelle rapide, la production élevée d’œufs et l’élevage à faible coût sont d’autres exemples qui favorisent l’utilisation de ce modèle expérimental⁷.

Un modèle de MCP aviaire est souvent utilisé dans les études de thérapie photodynamique (PDT)⁸. La PDT est utilisée pour traiter plusieurs formes de cancer (petites tumeurs localisées) et d’autres maladies non oncologiques. Son principe réside dans l’administration d’un médicament fluorescent, un photosensibilisant (PS), au tissu endommagé et son activation avec la lumière de la longueur d’onde appropriée. Un PS potentiel utilisé dans la recherche est l’hypéricine, isolée à l’origine de la plante médicinale millepertuis (Hypericum perforatum)⁹. Les forts effets photosensibilisants de ce composé sont basés sur ses propriétés photochimiques et photophysiques. Ceux-ci sont caractérisés par de multiples pics d’excitation de fluorescence dans la gamme 400-600 nm, qui induisent l’émission de fluorescence à environ 600 nm. Les maxima d’absorption de l’hypéricine dans la bande spectrale sont dans la gamme 540-590 nm, et les maxima de fluorescence sont dans la gamme 590-640 nm⁹. Pour obtenir ces effets photosensibilisants, l’hypéricine est excitée par la lumière laser à une longueur d’onde de 405 nm après administration locale¹⁰. En présence de lumière, l’hypéricine peut présenter des effets virucides, antiprolifératifs et cytotoxiques¹¹, alors qu’il n’y a pas de toxicité systémique, et elle est rapidement libérée de l’organisme. L’hypéricine est une substance lipophile qui forme des agrégats insolubles dans l’eau et non fluorescents, c’est pourquoi plusieurs types de nanotransporteurs, tels que les nanoparticules polymères 12,13 ou les lipoprotéines de haute et basse densité (HDL, LDL)^14,15, sont utilisés pour aider à sa livraison et à sa pénétration dans les cellules. Étant donné que la MCA est un système naturellement immunodéficient, les cellules tumorales peuvent être implantées directement sur la surface de la membrane. Le modèle est également bien adapté pour enregistrer l’étendue des lésions vasculaires induites par la PDT selon un score défini^{de 16,17}. Une lumière de plus faible intensité par rapport à la PDT peut être utilisée pour le diagnostic photodynamique (TED). La surveillance du tissu sous excitation violette La lumière LED conduit également à la photoactivation des photosensibilisateurs^18,19,20 qui entraîne une émission de lumière fluorescente^, mais elle ne fournit pas assez d’énergie pour démarrer une réaction PDT et endommager les cellules. Il en fait un bon outil pour la visualisation et le diagnostic des tumeurs ou la surveillance de la pharmacocinétique des PSs^14,15 utilisés.

Cet article décrit la préparation du test CAM ex ovo de caille avec des taux de survie supérieurs à 80%. Cette culture ex ovo a été appliquée avec succès dans un grand nombre d’expériences.

Protocole

La recherche a été réalisée conformément aux lignes directrices institutionnelles. Tout l’équipement et les réactifs doivent être autoclavés ou stérilisés avec de l’éthanol à 70 % ou de la lumière UV.

1. Incubation des œufs

1. Conservez les œufs de caille fécondés à 10-15 °C pendant un maximum de 4-5 jours avant de commencer l’incubation. N’utilisez que des œufs propres et intacts.
2. Incuber les œufs dans un incubateur à tirage forcé pendant ~ 53-54 h. Pondez les œufs horizontalement avec la rotation des œufs désactivée, à 50%-60% d’humidité et à une température d’incubation de 37,5 °C.

2. Préparation de la culture ex ovo

NOTE: Après l’incubation initiale, les œufs conviennent au démarrage de la culture ex ovo .

1. Désinfectez la surface de l’œuf avec de l’éthanol à 70%, sans faire tourner l’œuf.
2. Dans une armoire laminaire stérile, ouvrez la coquille d’œuf à l’aide de petits ciseaux chirurgicaux stériles et transférez le contenu dans une plaque de culture à 6 puits. Si cela est fait correctement, l’embryon reposera sur un jaune intact. Après chaque œuf, désinfectez les ciseaux avec de l’éthanol à 70%.
3. Ajoutez environ 5 ml d’eau stérile dans les espaces de la plaque à 6 puits, car l’humidité est essentielle pour empêcher le CAM de se dessécher.
4. Placez les embryons dans un incubateur jusqu’à de nouvelles expériences, tout en maintenant une température de 37 ° C et 80% à 90% d’humidité.
5. Lorsque le CAM est complètement développé (à partir de ED7), placez un anneau en silicone stérilisé (6 mm de diamètre et environ 1,5 mm d’épaisseur) sur la surface du CAM, le long des petits capillaires. Évitez les principaux vaisseaux sanguins lors de la mise en place de l’anneau.
   REMARQUE: L’anneau définit l’espace de travail, aide à marquer le lieu d’application de la substance et empêche le contenu liquide de s’échapper.
6. Mettre fin à la culture des embryons conformément à la législation du pays.
7. Il est important de porter des gants ou de garder les mains désinfectées avec de l’éthanol à 70% pendant le travail. Aspirer des embryons mal inclinés ou des ovules non fécondés avec un aspirateur sous vide.

Figure 1 : Préparation de la culture ex ovo. (A) Œufs de caille japonaise tels qu’ils sont entreposés et incubés. (B) Désinfection de la surface des œufs à l’éthanol. (C) La coquille d’œuf est coupée avec des ciseaux. (D) Le contenu de l’œuf est vidé dans le puits. (E) Embryon de 3 jours correctement préparé, avec un système vasculaire CAM en développement. F) Plaques de culture stockées dans un incubateur. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2 : Plaque de culture à 6 puits avec des embryons et des anneaux en silicone placés sur le dessus. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

3. Inoculation des cellules tumorales

REMARQUE: Toutes les procédures nécessitent l’utilisation d’une armoire à flux laminaire stérile.

1. Culture de différents types de cellules adhérentes dans des flacons selon les protocoles de culture respectifs.
   1. Retirez l’ancien milieu des flacons et rincez la couche cellulaire avec une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) stérile pour éliminer les traces du milieu.
   2. Après trypsinisation, inhiber la trypsine en ajoutant le milieu de culture et récolter les cellules dans des tubes de centrifugation. Centrifuger les cellules et remettre en suspension la pastille cellulaire dans un milieu de culture frais. Compter les cellules et les remettre en suspension dans un milieu de culture cellulaire à la concentration désirée.
      NOTE: Il est également possible de produire des cultures cellulaires 3D, c’est-à-dire des sphéroïdes en utilisant, par exemple, la méthode de la goutte suspendue²¹.
2. Implanter 1 x 10 5-1 x 10⁶ cellules tumorales ou^5-15 sphéroïdes (par CAM) dans 30 μL de solution de milieu cellulaire dans l’anneau de silicone au-dessus du CAM.
   REMARQUE: Le volume dépend de la taille de l’anneau en silicone utilisé. Si un anneau en silicone de plus grand diamètre est utilisé, un volume plus important est nécessaire pour couvrir toute la zone. Selon le type de cellule, ou pour différents types d’expériences, différentes concentrations cellulaires peuvent être utilisées. Parfois, le grattage fin de CAM est utilisé pour améliorer l’adhérence des cellules intégrées.
3. Remettre les CAM avec les cellules inoculées dans l’incubateur (37 °C et 80%-90% d’humidité).

Figure 3 : Inoculation de la MCP avec des tumeurs. (A) Aspiration de sphéroïdes avec une pipette, et (B) implantation sur la surface CAM. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

4. Application de photosensibilisateur

1. Application de l’hypéricine
   1. Sous un éclairage tamisé, préparer une solution mère d’hypéricine à 2 mM en la dissolvant dans du diméthylsulfoxyde (DMSO) à 100%. Préparer une solution de travail d’hypéricine à 79 μM peu de temps avant l’expérience avec du PBS stérile ou une solution saline. Assurez-vous que la concentration finale de DMSO dans toutes les solutions est toujours inférieure à 0,2%, ce qui n’affecte pas le développement de l’embryon.
   2. Dans des conditions stériles, appliquer un volume approprié de solution d’hypéricine sur l’anneau de silicone. Un volume de 30 μL est suffisant pour remplir un anneau d’un diamètre de 6 mm.
   3. Conservez les embryons dans un incubateur à 37 °C et 80 % à 90 % d’humidité. L’hypéricine en solution aqueuse est photoactive après sa monomérisation dans le tissu, environ 3 h après son application sur le CAM.
2. Application de l’hypéricine avec LDL, HDL ou nanoparticules comme systèmes de transport
   NOTE: Ces systèmes de transport sont utilisés pour améliorer la pénétration de l’hypéricine dans les cellules et les structures cellulaires.
   1. En raison de la photosensibilité, effectuez toutes les étapes, y compris la préparation des solutions, sous un éclairage tamisé et stockez les solutions dans l’obscurité.
   2. Préparer les formulations d’hypéricine-LDL et d’hypericine-HDL en mélangeant les volumes appropriés de lipoprotéines et de solutions mères d’hypéricine dans du PBS conformément à la référence¹⁵. La concentration de LDL ou HDL à l’hypéricine est de 20:1¹⁵.
   3. Synthétiser des nanoparticules de polymère par polymérisation à ouverture de cycle cationique vivant selon les références^12,13. Ajuster la concentration d’hypéricine dans les nanoparticules polymères avec PBS à 10 μM^12,13.

5. PDD et PDT

1. Effectuer un PDD
   1. Dans des conditions stériles, appliquer un photosensibilisant (hypéricine, nanoparticules polymères chargées d’hypéricine ou hypéricine avec transporteur de lipoprotéines) sur la surface CAM, avec ou sans cellules tumorales (ED 7-9).
   2. Illuminer le CAM à l’aide d’une lumière d’excitation violette (lumière LED circulaire sur mesure de longueur d’onde de 405 nm) et enregistrer la fluorescence de l’hypéricine dans les tissus CAM et les cellules tumorales avec un appareil photo numérique à des intervalles de temps de 0, 1, 3, 5, 24 et 48 h après l’administration d’hypéricine.
   3. Si la recherche nécessite une image de la MCP en lumière blanche, enregistrer la MCP avant l’administration d’hypéricine et à la fin de l’expérience, peu de temps avant la fixation des tissus, car la lumière affecte la photoactivation de l’hypéricine.
   4. Évaluer l’intensité de fluorescence à l’aide d’un programme de traitement et d’analyse d’images (p. ex., ImageJ²²).
      1. Divisez les canaux d’image RVB en images rouges, vertes et bleues distinctes. Analysez l’image d’intensité rouge sous forme 8 bits. Évaluez l’intensité rouge de la zone à l’intérieur de l’anneau et approximez-la comme la fluorescence de l’hypéricine. Obtenez des tracés de profil d’image entiers (en utilisant le plugin Profile Plot d’ImageJ) à différents intervalles de temps après l’administration d’hypéricine (c’est-à-dire de 0 h, juste après l’administration, jusqu’à 48 h).
2. Effectuer la TPD
   1. Effectuer la PDT au moins 3 h après l’application de l’hypéricine.
   2. Placez la fibre optique au-dessus de la surface du CAM pour que le rayon laser couvre toute la zone à l’intérieur de l’anneau en silicone.
   3. Effectuer une irradiation in vivo (1-2 min) avec une lumière laser de 405 nm à un taux de fluence de 285 mW/cm².
   4. Enregistrer la FAO en utilisant la lumière blanche et la lumière fluorescente de 405 nm avant et après le traitement photodynamique (24 h et 48 h).
   5. Détectez les photodommages 24 h et 48 h après la TPD à partir des images prises en lumière blanche. Évaluer les dommages vasculaires par un score semi-quantitatif¹⁶: 1 - pas de destruction; 2 - fermeture partielle des capillaires (diamètre ≤10 μm) sans destruction des vaisseaux moyens ou grands (diamètre ≥50 μm) et plus petits (diamètre 10-50 μm); 3 - fermeture partielle des petits vaisseaux avec des capillaires en train de disparaître; 4 - fermeture partielle des grands navires avec disparition des petits vaisseaux et capillaires; et 5 - photothrombose totale avec la disparition de la plupart des vaisseaux.

Figure 4 : Traitement de la FAO à la lumière laser. Cette photo a été prise à des fins d’illustration. Pour PDD ou PDT, la pièce doit être sombre. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

6. Préparation de la MCP en vue d’une évaluation plus approfondie

1. Encastrement de paraffine
   1. Fixer le tissu CAM dans une plaque de culture avec 4% de paraformaldéhyde (PFA) dans du PBS pendant un minimum de 2 h et un maximum de nuit.
   2. Retirez le PFA et découpez soigneusement du CAM une partie du tissu à l’intérieur de l’anneau en silicone.
   3. Déshydrater immédiatement le tissu CAM dans la série d’alcool ascendante comme suit. Placer le tissu CAM dans de l’éthanol à 70% pendant 3 min, une solution d’éosine pendant 2 min (pour faciliter la localisation du tissu dans le bloc de paraffine), de l’éthanol à 96% pendant 3 x 5 min (toujours dans une nouvelle boîte de Pedia), et de l’éthanol à 100% pendant 5 min et du xylène pendant 2 x 10 min.
   4. À l’aide d’une spatule ou d’une brosse fine, transférer les échantillons le plus rapidement possible dans la paraffine dissoute dans des boîtes de Petri (59 °C). Après 24 h, placez le tissu dans un moule histologique, remplissez-le de milieu d’enrobage de paraffine et laissez-le se solidifier au réfrigérateur. Coupez le CAM solidifié du milieu d’enrobage, retournez-le dans le plateau de 90°, remplissez-le à nouveau avec le milieu d’enrobage et laissez-le se solidifier.
   5. Préparer des coupes de 5 à 10 μm sur un microtome pour l’analyse histopathologique afin de déterminer les dommages induits par la PDT.
2. Préparation des coupes CAM congelées pour l’histologie
   NOTE: Pour certaines méthodologies, y compris l’histologie, les coupes congelées préparées sur microtome cryostat sont plus appropriées. Suivez les étapes ci-dessous pour préparer les sections CAM congelées.
   1. Montez soigneusement la FAO native ou fixée au paraformaldéhyde à 4 % sur la lame de verre.
   2. Remplissez le moule d’encastrement à moitié avec un composé à température de coupe optimale (OCT) et congelez dans de l’azote liquide ou un mélange de glace sèche et d’éthanol.
   3. Après la congélation, inclinez délicatement et faites glisser le CAM de la lame en verre sur le dessus du milieu OCT congelé. Placer à nouveau dans le moule, couvrir avec un milieu OCT et congeler comme à l’étape 6.2.2.
3. Analyse fractale de la CAM de caille
   NOTE: Les changements vasculaires causés par la PDT peuvent être évalués en calculant le coefficient de dimension fractale¹⁹.
   1. Dans l’armoire à flux laminaire, faire déborder CAM dans une plaque de culture avec une solution de fixation préchauffée (37 °C) de 4% de paraformaldéhyde et 2% de glutaraldéhyde dans du PBS.
   2. Retirer la solution de fixation après 48 h. Séparez soigneusement le CAM de l’embryon avec des micro-ciseaux et une brosse fine et lavez-le dans PBS.
   3. Montez le CAM lavé sur une lame de verre et laissez-le sécher lentement.
   4. Photographiez la diapositive à l’aide d’un appareil photo numérique et d’un transilluminateur comme source de lumière blanche homogène.
   5. Traiter des images numériques à l’aide du logiciel ImageJ²². Pour l’analyse, sélectionnez une région carrée (512 × 512 pixels) dans la zone avec des branches artérielles distales. Binariser et squelettiser les images et calculer le coefficient de dimension fractale (Df) en suivant les procédures décrites dans la référence³¹.
4. Analyse moléculaire du tissu CAM
   1. Pour l’analyse moléculaire, séparer soigneusement le CAM natif, congeler dans de l’azote liquide et conserver à -80 °C.
   2. Déterminer l’expression génique selon les protocoles standard pour l’isolement de l’ARN²³, la transcription inverse en ADNc et la PCR^{quantitative 24}.

Figure 5 : Tissu CAM pour l’analyse fractale. Après la PDT, la FAO est fixée, montée sur une lame et séchée pour l’analyse fractale. La photo a été prise en lumière blanche à l’aide d’un transilluminateur. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Résultats

La localisation de la tumeur sur la surface CAM est difficile en lumière blanche. Le photosensibilisateur (ici, l’hypéricine) utilisé dans le PDD devrait être absorbé sélectivement par la tumeur et aide à visualiser la tumeur. L’ajout d’hypéricine et l’utilisation de la lumière fluorescente (par exemple, 405 nm) ont très bien montré la position de la tumeur (carcinome épidermoïde TE1) (Figure 6A). L’analyse histologique a montré que les cellules tumorales vitales enva...

Discussion

Pour une culture ex ovo réussie, il est important de suivre le protocole ci-dessus. De plus, si les œufs ne sont pas ouverts assez soigneusement ou s’il n’y a pas suffisamment d’humidité pendant la culture, le sac de jaune colle à la coquille et se rompt souvent. Le début d’une culture ex ovo au moment d’environ 60 h d’incubation des œufs assure le taux de survie élevé des embryons, car ils sont déjà assez grands pour survivre à la manipulation. Aux stades ultérieurs du développ...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
6-Well Cell Culture Plate	Sarstedt	83.392	Transparent polystyrene, sterile
CO2 Incubator ESCO CCL-0508	ESCO, Singapore	CCL-050B-8	CO2 cell culture incubator
cryocut Leica CM 1800	Reichert-Jung, USA
digital camera Canon EOS 6D II	Canon, Japan
diode laser 405 nm	Ocean Optics, USA
DMSO	Sigma-Aldrich	67-68-5	dimethyl sulfoxid
eosin	Sigma-Aldrich	15086-94-9
ethanol	Sigma-Aldrich	64-17-5
fine brush size 2	Faber-Castell	281802	brush for CAM separation and manipulation
glutaraldehyde	Sigma-Aldrich	111-30-8
hematoxylin	Sigma-Aldrich	517-28-2
hypericin	Sigma-Aldrich	84082-80-4
incubator Bios Midi	Bios Sedlany, Czech Republic		Forced draught incubator for initial incubation
incubator Memmert IF160	Memmert, Germany		Forced air circulation incubator for CAM incubation
Kaiser slimlite plano, LED light box	Kaiser, Germany	2453	Transilluminator
LED light 405 nm			custom made circular LED light
macro lens Canon MP- E 65 mm f/2.8	Canon, Japan
microscope Kapa 2000	Kvant, Slovakia		optical microscope
microtome Auxilab 508	Auxilab, Spain		manual rotary microtome
paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	30525-89-4
Paraplast Plus	Sigma-Aldrich	P3683	parafin medium for tissue embedding
PBS	Sigma-Aldrich	P4417	Phosphate saline buffer
scissors Castroviejo	Orimed	OR66-108	micro scissors for CAM separation
software ImageJ 1.53	public domain		image processing and analysis program
stock solution HDL	Sigma-Aldrich	437641-10MG	high density lipoproteins
stock solution LDL	Sigma-Aldrich	437644-10MG	low density lipoproteins
Tissue-Tek O.C.T. Compound	Sakura Finetek	4583	Optimal Cutting Temperature Compound 118 mL squeeze bottles