메추라기 융모막 막 - 광 역학 진단 및 치료를위한 도구

요약

조류 배아의 융모막 막 (CAM)은 다양한 연구 분야에 매우 유용하고 적용 가능한 도구입니다. 일본 메추라기 CAM의 특수 ex ovo 모델은 광 역학 치료 조사에 적합합니다.

초록

조류 배아의 융모막 막 (CAM)은 일차 호흡 기관으로 기능하는 얇은 배아 외 막입니다. 그 특성은 혈관 신생, 종양 성장, 약물 전달 시스템 또는 광 역학 진단 (PDD) 및 광 역학 치료 (PDT)를 연구하기위한 우수한 생체 내 실험 모델입니다. 동시에이 모델은 실험 동물을 적절한 대안으로 대체하기위한 요구 사항을 해결합니다. Ex ovo 배양 배아는 물질 적용, 접근, 모니터링 및 문서화가 용이합니다. 가장 자주 사용되는 것은 병아리 CAM입니다. 그러나이 기사에서는 일본 메추라기 CAM의 장점을 저비용 및 고 처리량 모델로 설명합니다. 또 다른 장점은 더 짧은 배아 발달로 더 높은 실험 회전율을 허용합니다. 암 및 미생물 감염의 PDD 및 PDT에 대한 메추라기 CAM의 적합성은 여기에서 탐구됩니다. 예로서, 전달 시스템으로서 지단백질 또는 나노입자와 조합된 광감작제 하이페리신의 사용이 설명된다. 백색광 이미지의 손상 점수와 보라색 빛(405nm) 하에서 CAM 조직의 형광 강도 변화를 조직학적 절편의 분석과 함께 결정했습니다. 메추라기 CAM은 PDT가 혈관구조와 조직에 미치는 영향을 명확하게 보여주었습니다. 또한 모세 혈관 출혈, 혈전증, 작은 혈관의 용해 및 큰 혈관의 출혈과 같은 변화가 관찰 될 수 있습니다. 일본 메추라기 CAM은 광역학 진단 및 치료 연구를 위한 유망한 생체 내 모델로, 종양 혈관신생, 항혈관 및 항균 요법 연구에 적용됩니다.

서문

닭 융모막 막 (CAM) 모델은 잘 알려져 있으며 다양한 연구 분야에서 널리 사용됩니다. 그것은 가스 교환 및 광물 수송을 제공하는 풍부한 혈관 화 된 배아 외 기관입니다¹. 이 막의 투명성과 접근성으로 인해 개별 혈관과 그 구조적 변화를 실시간으로 관찰 할 수 있습니다². 장점에도 불구하고 병아리 CAM에는 다른 조류 종을 사용하여 피할 수 있는 몇 가지 제한 사항(예: 더 큰 사육 시설, 계란 생산 및 사료 소비)이 있습니다. 이 프로토콜에서는 일본 메추라기 (Coturnix japonica) 배아를 사용하는 대안적인 ex ovo CAM 모델이 설명됩니다. 크기가 작기 때문에 닭 CAM보다 훨씬 많은 수의 실험 개체를 사용할 수 있습니다. 또한, 메추라기 배아의 짧은 16 일 배아 발달은 또 다른 이점이다. 메추라기 CAM의 첫 번째 큰 혈관은 배아 일 (ED) 7에 나타납니다. 이것은 병아리 배아 발달 (4-35 단계)과 직접 비교할 수 있습니다. 그러나 발달의 후기 단계는 더 이상 비교할 수 없으며 메추라기 배아³에 더 적은 시간을 필요로합니다. 흥미로운 것은 닭 CAM ^4,5,6과 유사한 미세 혈관 분기의 규칙적인 발생입니다. 빠른 성적 성숙, 높은 계란 생산 및 저비용 번식은이 실험 모델⁷의 사용을 선호하는 다른 예입니다.

조류 CAM 모델은 종종 광 역학 치료 (PDT) 연구에 사용됩니다⁸. PDT는 여러 형태의 암 (작은 국소 종양) 및 기타 비 종양학 질환을 치료하는 데 사용됩니다. 그 원리는 형광 약물인 감광제(PS)를 손상된 조직에 전달하고 적절한 파장의 빛으로 활성화하는 것입니다. 연구에 사용 된 한 가지 전향 적 PS는 원래 약용 식물 세인트 존스 워트 (Hypericum perforatum⁾⁹에서 분리 된 하이퍼 리신입니다. 이 화합물의 강력한 감광성 효과는 광화학적 및 광물리적 특성을 기반으로 합니다. 이들은 약 600 nm에서 형광의 방출을 유도하는 400-600 nm 범위의 다중 형광 여기 피크를 특징으로합니다. 스펙트럼 대역 내에서 하이퍼리신의 흡수 최대값은 540-590nm 범위에 있고, 형광 최대값은 590-640nm^{범위입니다}9. 이러한 감광성 효과를 달성하기 위해, hypericin은 국소 투여 후 405 nm의 파장에서 레이저 광에 의해 여기된다¹⁰. 빛의 존재 하에서, 하이퍼 리신은 바이러스 성, 항 증식 성 및 세포 독성 효과¹¹를 나타낼 수 있지만, 전신 독성은 없으며, 유기체로부터 빠르게 방출된다. Hypericin은 수 불용성, 비 형광 응집체를 형성하는 친 유성 물질이므로 고분자 나노 입자 12,13 또는 고밀도 및 저밀도 지단백질 (HDL, LDL)^14,15와 같은 여러 유형의 나노 운반체가 세포로의 전달 및 침투를 돕는 데 사용됩니다. CAM은 자연적으로 면역 결핍 시스템이기 때문에 종양 세포를 막 표면에 직접 이식 할 수 있습니다. 이 모델은 또한 정의 된 점수^16,17에 따라 PDT 유발 혈관 손상의 정도를 기록하는 데 매우 적합합니다. PDT에 비해 낮은 강도의 빛은 광역학 진단(PDD)에 사용할 수 있습니다. 보라색 여기 LED 광 하에서 조직을 모니터링하는 것은 또한 형광 광의 방출을 초래하는 광민감제^18,19,20의 광활성화로 이어지지만^, PDT 반응을 시작하고 세포를 손상시키기에 충분한 에너지를 제공하지 않습니다. 종양 시각화 및 진단 또는 사용 된 PS^14,15의 약물 동력학 모니터링에 좋은 도구입니다.

이 기사에서는 생존율이 80 % 이상인 메추라기 ex ovo CAM 분석의 준비에 대해 설명합니다. 이 ex ovo 배양은 많은 실험에서 성공적으로 적용되었습니다.

프로토콜

연구는 기관 지침에 따라 수행되었습니다. 모든 장비와 시약은 70% 에탄올 또는 자외선으로 오토클레이브 또는 멸균해야 합니다.

1. 계란 배양

1. 부화를 시작하기 전에 수정 된 메추라기 알을 10-15 ° C에서 최대 4-5 일 동안 보관하십시오. 깨끗하고 손상되지 않은 계란 만 사용하십시오.
2. 강제 초안 인큐베이터에서 ~ 53-54 시간 동안 알을 품습니다. 계란 회전을 끈 상태에서 50%-60% 습도 및 37.5°C 배양 온도에서 알을 수평으로 놓습니다.

2. 전 오보 배양 준비

알림: 초기 배양 후, 알은 ex ovo 재배를 시작하기에 적합합니다.

1. 계란을 회전시키지 않고 70 % 에탄올로 계란 표면을 소독하십시오.
2. 멸균 층류 캐비닛에서 작은 멸균 수술용 가위를 사용하여 달걀 껍질을 열고 내용물을 6웰 배양 플레이트에 옮깁니다. 제대로 수행되면 배아는 손상되지 않은 노른자 위에 놓입니다. 각 계란 후에 70 % 에탄올로 가위를 소독하십시오.
3. CAM이 건조되는 것을 방지하기 위해 습도가 필수적이므로 약 5mL의 멸균수를 6웰 플레이트의 틈새에 추가합니다.
4. 추가 실험이 있을 때까지 배아를 인큐베이터에 넣고 온도를 37°C 및 80%-90% 습도로 유지합니다.
5. CAM이 완전히 발달되면(ED7에서) 멸균된 실리콘 링(직경 6mm, 두께 약 1.5mm)을 작은 모세혈관을 따라 CAM 표면에 놓습니다. 반지를 놓을 때 주요 혈관을 피하십시오.
   알림: 링은 작업 공간을 정의하고 물질 도포 장소를 표시하는 데 도움이 되며 액체 내용물이 누출되는 것을 방지합니다.
6. 국가의 법률에 따라 배아 재배를 종료하십시오.
7. 중요한 것은 작업 중에 장갑을 착용하거나 70 % 에탄올로 손을 소독하는 것입니다. 진공 흡인기로 부적절하게 기울어진 배아 또는 수정되지 않은 난자를 흡인합니다.

그림 1: Ex ovo 배양 준비. (A) 일본 메추라기 알이 저장되고 배양되는 경우. (B) 에탄올로 계란 표면 소독. (C) 달걀 껍질을 가위로 자른다. (D) 계란의 내용물을 우물에 비웁니다. (E) CAM 혈관 구조가 발달하여 3 일 된 배아를 적절하게 준비했습니다. (F) 배양기에 보관 된 배양 플레이트. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2: 배아와 실리콘 링이 위에 놓인 6웰 배양 플레이트. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

3. 종양세포 접종

알림: 모든 절차에는 멸균 층류 캐비닛을 사용해야 합니다.

1. 각각의 배양 프로토콜에 따라 플라스크에서 다양한 유형의 부착 세포를 배양합니다.
   1. 플라스크에서 오래된 배지를 제거하고 멸균 인산염 완충 식염수(PBS)로 세포층을 헹구어 배지의 흔적을 제거합니다.
   2. 트립신 화 후 배양액을 추가하여 트립신을 억제하고 세포를 원심분리 튜브로 수확합니다. 세포를 원심분리하고 세포 펠릿을 새로운 배양 배지에 재현탁시킨다. 세포를 계수하고 원하는 농도의 세포 배양 배지에 재현탁시킵니다.
      참고: 예를 들어, 행드롭 방법(²¹)을 사용하여 3D 세포 배양물, 즉 스페로이드를 생산하는 것도 가능하다.
2. 30μL의 세포 배지 용액에 1 x 10 5-1 x 10⁶개의 종양 세포 또는^5-15개의 스페로이드(CAM당)를 CAM 상단의 실리콘 링에 이식합니다.
   알림: 부피는 사용된 실리콘 링의 크기에 따라 다릅니다. 더 큰 직경의 실리콘 링을 사용하는 경우 전체 영역을 덮기 위해 더 큰 부피가 필요합니다. 세포 유형에 따라, 또는 상이한 유형의 실험에 대해, 다양한 세포 농도가 사용될 수 있다. 때로는 CAM의 미세 스크래핑을 사용하여 임베디드 셀의 접착력을 향상시킵니다.
3. 접종 된 세포가있는 CAM을 인큐베이터 (37 ° C 및 80 % -90 % 습도)로 되돌립니다.

그림 3 : 종양이있는 CAM 접종. (A) 피펫을 이용한 스페로이드 흡인 및 (B) CAM 표면에 이식. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

4. 감광제의 적용

1. 하이페리신의 적용
   1. 희미한 조명 하에서 2mM 하이페리신 저장 용액을 100% 디메틸설폭사이드(DMSO)에 용해시켜 준비합니다. 멸균 PBS 또는 식염수로 실험 직전에 하이퍼리신의 79μM 작업 용액을 준비하십시오. 모든 용액에서 DMSO의 최종 농도가 항상 배아의 발달에 영향을 미치지 않는 0.2% 미만인지 확인하십시오.
   2. 멸균 상태에서 적절한 양의 하이퍼리신 용액을 실리콘 링에 바릅니다. 30 μL의 부피는 직경 6 mm의 링을 채우기에 충분합니다.
   3. 배아를 37 ° C 및 80 % -90 % 습도의 인큐베이터에 보관하십시오. 수용액의 Hypericin은 조직에서 단량체 화 후 CAM에 적용한 후 약 3 시간 후에 광활성을 나타냅니다.
2. LDL, HDL 또는 나노 입자를 수송 시스템으로 사용하는 하이퍼리신의 적용
   참고: 이러한 수송 시스템은 세포 및 세포 구조에 대한 하이페리신의 침투를 개선하는 데 사용됩니다.
   1. 감광성으로 인해 희미한 조명 아래에서 용액 준비를 포함한 모든 단계를 수행하고 용액을 어둠 속에 보관하십시오.
   2. 참고문헌¹⁵에 따라 PBS 중 적절한 부피의 지단백질 및 하이페리신 스톡 용액을 혼합하여 하이페리신-LDL 및 하이페리신-HDL 제형을 제조한다. 하이페리신에 대한 LDL 또는 HDL의 농도는 20:1¹⁵입니다.
   3. 참고문헌^12,13에 따른 살아있는 양이온 개환중합에 의해 고분자 나노입자를 합성한다. PBS로 고분자 나노 입자의 하이퍼 리신 농도를 10 μM^12,13으로 조정하십시오.

5. PDD 및 PDT

1. PDD 수행
   1. 멸균 조건에서 종양 세포가 있거나없는 CAM 표면에 감광제 (하이퍼 리신, 하이퍼 리신로드 고분자 나노 입자 또는 지단백질 담체가있는 하이퍼 리신)를 적용하십시오 (ED 7-9).
   2. 보라색 여기 광 (405nm 파장의 맞춤형 원형 LED 조명)을 사용하여 CAM을 조명하고 하이퍼 리신 투여 후 0, 1, 3, 5, 24 및 48 시간의 시간 간격으로 디지털 카메라로 CAM 조직 및 종양 세포에서 하이퍼 리신의 형광을 기록합니다.
   3. 연구에 백색광에서 CAM의 이미지가 필요한 경우 빛이 hypericin의 광 활성화에 영향을 미치므로 하이퍼 리신 투여 전과 실험 종료 직전에 조직 고정 직전에 CAM을 기록하십시오.
   4. 이미지 처리 및 분석 프로그램(예를 들어, ImageJ²²)을 사용하여 형광 강도를 평가한다.
      1. RGB 이미지 채널을 별도의 빨강, 녹색 및 파랑 이미지로 분할합니다. 적색 강도 이미지를 8비트 형식으로 분석합니다. 링 내부 영역에서 빨간색 강도를 평가하고 하이퍼 리신 형광으로 근사합니다. 하이퍼리신 투여 후 다른 시간 간격(즉, 0시간부터, 투여 직후, 최대 48시간)으로 전체 이미지 프로파일 플롯(ImageJ의 프로필 플롯 플러그인 사용)을 얻습니다.
2. PDT 실시
   1. 하이퍼리신 도포 후 최소 3시간 후에 PDT를 수행한다.
   2. 레이저 광선이 실리콘 링 내의 전체 영역을 덮을 수 있도록 CAM 표면 위에 광섬유를 놓습니다.
   3. 285mW/^cm2의 플루언스 속도로 405nm 레이저 광으로 생체 내 조사(1-2분)를 수행합니다.
   4. 광역학 치료 전후(24시간 및 48시간) 백색광과 405nm 형광등을 사용하여 CAM을 기록합니다.
   5. 백색광에서 촬영한 이미지에서 PDT 후 24시간 및 48시간 후에 광 손상을 감지합니다. 반정량적 점수¹⁶:1 - 파괴 없음에 의한 혈관 손상 평가; 2 - 중간 크기 (직경 ≥50 μm) 및 작은 용기 (직경 10-50 μm)의 파괴없이 모세 혈관 (직경 ≤10 μm)의 부분 폐쇄; 3 - 모세 혈관이 사라지는 작은 혈관의 부분 폐쇄; 4 - 더 작은 혈관과 모세 혈관이 사라지는 더 큰 혈관의 부분 폐쇄; 및 5 - 대부분의 혈관이 사라지는 총 광 혈전증.

그림 4: 레이저 광을 사용한 CAM 처리. 이 사진은 설명을 위해 찍은 것입니다. PDD 또는 PDT의 경우 방이 어두워 야합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

6. 추가 평가를 위한 CAM 준비

1. 파라핀 임베딩
   1. CAM 조직을 PBS의 4% 파라포름알데히드(PFA)로 배양 플레이트에 최소 2시간, 최대 밤새 고정합니다.
   2. PFA를 제거하고 CAM에서 실리콘 링 내의 조직 일부를 조심스럽게 잘라냅니다.
   3. 다음과 같이 CAM 조직을 오름차순 알코올 계열에서 즉시 탈수합니다. CAM 조직을 70 % 에탄올에 3 분, 에오신 용액에 2 분 동안 (파라핀 블록에서 조직을 쉽게 배치 할 수 있도록), 96 % 에탄올을 3 x 5 분 동안 (항상 새로운 페트리 접시에 담음), 100 % 에탄올에 5 분, 크실렌을 2 x 10 분 동안 놓습니다.
   4. 주걱이나 얇은 브러시를 사용하여 가능한 한 빨리 샘플을 페트리 접시 (59 ° C)에 용해 된 파라핀으로 옮깁니다. 24시간 후, 조직을 조직학적 몰형에 넣고 파라핀 매립 배지로 채우고 냉장고에서 응고되도록 합니다. 임베딩 매체에서 응고된 CAM을 자르고 트레이에서 90° 돌린 다음 임베딩 매체로 다시 채우고 응고시킵니다.
   5. PDT 유발 손상을 결정하기 위해 조직 병리학 적 분석을 위해 마이크로 톰에 5-10 μm 섹션을 준비하십시오.
2. 조직학을위한 냉동 CAM 섹션의 준비
   참고: 조직학을 포함한 일부 방법론의 경우 저온 유지 마이크로톰으로 준비된 냉동 섹션이 더 적합합니다. 고정 된 CAM 섹션을 준비하려면 아래 단계를 따르십시오.
   1. 유리 슬라이드에 네이티브 또는 4% 파라포름알데히드 고정 CAM을 조심스럽게 장착합니다.
   2. 최적의 절단 온도 화합물 (OCT)로 매립 금형을 절반으로 채우고 액체 질소 또는 드라이 아이스와 에탄올의 혼합물에서 동결시킵니다.
   3. 동결 후 유리 슬라이드에서 CAM을 조심스럽게 기울여 동결된 OCT 매체의 상단으로 밉니다. 금형에 다시 넣고 OCT 매체로 덮고 6.2.2단계와 같이 얼립니다.
3. 메추라기 CAM의 프랙탈 분석
   참고: PDT로 인한 혈관 변화는 프랙탈 차원 계수¹⁹를 계산하여 평가할 수 있습니다.
   1. 층류 캐비닛에서 PBS에서 4% 파라포름알데히드와 2% 글루타르알데히드의 예열된(37°C) 고정 용액을 사용하여 배양 플레이트에 CAM을 오버플로합니다.
   2. 48 시간 후에 고정 용액을 제거하십시오. 마이크로 가위와 미세한 솔로 CAM을 배아에서 조심스럽게 분리하고 PBS로 씻으십시오.
   3. 세척 된 CAM을 유리 슬라이드에 장착하고 천천히 건조시킵니다.
   4. 디지털 카메라와 트랜스 일루미네이터를 균일 한 백색광의 소스로 사용하여 슬라이드를 촬영합니다.
   5. ImageJ 소프트웨어를 사용하여 디지털 이미지 처리²². 분석을 위해 원위 동맥 가지가있는 영역에서 정사각형 영역 (512 × 512 픽셀)을 선택하십시오. 이미지를 이진화 및 골격화하고 참조³¹에 설명된 절차에 따라 프랙탈 차원 계수(Df)를 계산합니다.
4. CAM 조직의 분자 분석
   1. 분자 분석을 위해 네이티브 CAM을 조심스럽게 분리하고 액체 질소에서 동결한 다음 -80°C에서 보관하십시오.
   2. RNA 단리²³, cDNA로의 역전사 및 정량적 PCR(²⁴)에 대한 표준 프로토콜에 따라 유전자 발현을 결정한다.

그림 5: 프랙탈 분석을 위한 CAM 조직. PDT 후, CAM은 고정되고, 슬라이드에 장착되고, 프랙탈 분석을 위해 건조된다. 사진은 트랜스 일루미네이터를 사용하여 백색광에서 촬영되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

결과

CAM 표면에서 종양의 국소화는 백색광에서 어렵습니다. PDD에 사용되는 광감작제(여기서, 하이퍼리신)는 종양에 의해 선택적으로 흡수될 것으로 예상되며, 종양을 시각화하는 것을 돕는다. 하이페리신의 첨가 및 형광광(예를 들어, 405 nm)의 사용은 종양(편평 세포 TE1) 위치를 매우 잘 나타내었다(도 6A). 조직 학적 분석은 중요한 종양 세포가 건강한 조직을 침범하는 것으로 나타...

토론

성공적인 exovo 재배를 위해서는 위의 프로토콜을 따르는 것이 중요합니다. 또한, 계란이 충분히 조심스럽게 열리지 않거나 재배 중에 습도가 충분하지 않으면 노른자 자루가 껍질에 달라 붙어 종종 파열됩니다. 약 60 시간의 난자 배양시 ex ovo 재배의 시작은 이미 취급에서 생존 할 수있을만큼 충분히 크기 때문에 배아의 높은 생존율을 보장합니다. 후기 발달 단계에서 CAM은 더 얇아지?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
6-Well Cell Culture Plate	Sarstedt	83.392	Transparent polystyrene, sterile
CO2 Incubator ESCO CCL-0508	ESCO, Singapore	CCL-050B-8	CO2 cell culture incubator
cryocut Leica CM 1800	Reichert-Jung, USA
digital camera Canon EOS 6D II	Canon, Japan
diode laser 405 nm	Ocean Optics, USA
DMSO	Sigma-Aldrich	67-68-5	dimethyl sulfoxid
eosin	Sigma-Aldrich	15086-94-9
ethanol	Sigma-Aldrich	64-17-5
fine brush size 2	Faber-Castell	281802	brush for CAM separation and manipulation
glutaraldehyde	Sigma-Aldrich	111-30-8
hematoxylin	Sigma-Aldrich	517-28-2
hypericin	Sigma-Aldrich	84082-80-4
incubator Bios Midi	Bios Sedlany, Czech Republic		Forced draught incubator for initial incubation
incubator Memmert IF160	Memmert, Germany		Forced air circulation incubator for CAM incubation
Kaiser slimlite plano, LED light box	Kaiser, Germany	2453	Transilluminator
LED light 405 nm			custom made circular LED light
macro lens Canon MP- E 65 mm f/2.8	Canon, Japan
microscope Kapa 2000	Kvant, Slovakia		optical microscope
microtome Auxilab 508	Auxilab, Spain		manual rotary microtome
paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	30525-89-4
Paraplast Plus	Sigma-Aldrich	P3683	parafin medium for tissue embedding
PBS	Sigma-Aldrich	P4417	Phosphate saline buffer
scissors Castroviejo	Orimed	OR66-108	micro scissors for CAM separation
software ImageJ 1.53	public domain		image processing and analysis program
stock solution HDL	Sigma-Aldrich	437641-10MG	high density lipoproteins
stock solution LDL	Sigma-Aldrich	437644-10MG	low density lipoproteins
Tissue-Tek O.C.T. Compound	Sakura Finetek	4583	Optimal Cutting Temperature Compound 118 mL squeeze bottles