Quaglia Membrana corioallantoica - uno strumento per la diagnosi fotodinamica e la terapia

Riepilogo

La membrana corioallantoica (CAM) dell'embrione aviario è uno strumento molto utile e applicabile per varie aree di ricerca. Uno speciale modello ex ovo di quaglia giapponese CAM è adatto per l'indagine del trattamento fotodinamico.

Abstract

La membrana corioallantoica (CAM) di un embrione aviario è una sottile membrana extraembrionale che funziona come organo respiratorio primario. Le sue proprietà lo rendono un eccellente modello sperimentale in vivo per studiare l'angiogenesi, la crescita tumorale, i sistemi di somministrazione di farmaci o la diagnosi fotodinamica (PDD) e la terapia fotodinamica (PDT). Allo stesso tempo, questo modello affronta il requisito della sostituzione degli animali da esperimento con un'alternativa adeguata. L'embrione coltivato ex ovo consente una facile applicazione, accesso, monitoraggio e documentazione della sostanza. Il più frequentemente usato è pulcino CAM; tuttavia, questo articolo descrive i vantaggi del CAM di quaglia giapponese come modello a basso costo e ad alta produttività. Un altro vantaggio è lo sviluppo embrionale più breve, che consente un maggiore turnover sperimentale. L'idoneità della CAM di quaglia per PDD e PDT del cancro e delle infezioni microbiche è esplorata qui. Ad esempio, viene descritto l'uso del fotosensibilizzatore ipericina in combinazione con lipoproteine o nanoparticelle come sistema di consegna. È stato determinato il punteggio di danno dalle immagini in luce bianca e le variazioni dell'intensità di fluorescenza del tessuto CAM sotto luce violetta (405 nm), insieme all'analisi delle sezioni istologiche. La CAM di quaglia ha mostrato chiaramente l'effetto della PDT sulla vascolarizzazione e sul tessuto. Inoltre, si potrebbero osservare cambiamenti come emorragia capillare, trombosi, lisi di piccoli vasi e sanguinamento di vasi più grandi. La CAM di quaglia giapponese è un promettente modello in vivo per la diagnosi fotodinamica e la ricerca terapeutica, con applicazioni negli studi sull'angiogenesi tumorale e sulla terapia antivascolare e antimicrobica.

Introduzione

Il modello della membrana corioallantoica (CAM) del pollo è ben noto e ampiamente utilizzato in varie aree di ricerca. È un organo extraembrionale riccamente vascolarizzato che fornisce lo scambio di gas e il trasporto di minerali¹. Grazie alla trasparenza e all'accessibilità di questa membrana, i singoli vasi sanguigni e i loro cambiamenti strutturali possono essere osservati in tempo reale². Nonostante i vantaggi, il pulcino CAM ha anche alcune limitazioni (ad esempio, strutture di allevamento più grandi, produzione di uova e consumo di mangime) che potrebbero essere evitate utilizzando altre specie aviarie. In questo protocollo, viene descritto un modello alternativo di CAM ex ovo utilizzando embrioni di quaglia giapponese (Coturnix japonica). A causa delle sue piccole dimensioni, consente l'uso di un numero molto maggiore di individui sperimentali rispetto al pollo CAM. Inoltre, lo sviluppo embrionale più breve di 16 giorni degli embrioni di quaglia è un altro vantaggio. I primi vasi più grandi su quaglia CAM compaiono il giorno embrionale (ED) 7. Questo può essere direttamente confrontato con lo sviluppo dell'embrione di pulcino (fasi 4-35); Tuttavia, le fasi successive dello sviluppo non sono più comparabili e richiedono meno tempo per l'embrione di quaglia³. Di interesse è la regolare comparsa di ramificazioni microvascolari simili a quelle delle CAM di pollo ^4,5,6. La rapida maturazione sessuale, l'alta produzione di uova e l'allevamento a basso costo sono altri esempi che favoriscono l'uso di questo modello sperimentale⁷.

Un modello CAM aviario è spesso utilizzato negli studi di terapia fotodinamica (PDT)⁸. PDT è usato per trattare diverse forme di cancro (piccoli tumori localizzati) e altre malattie non oncologiche. Il suo principio è nella consegna di un farmaco fluorescente, un fotosensibilizzatore (PS), al tessuto danneggiato e la sua attivazione con la luce della lunghezza d'onda appropriata. Una PS prospettica utilizzata nella ricerca è l'ipericina, originariamente isolata dalla pianta medicinale erba di San Giovanni (Hypericum perforatum)⁹. I forti effetti fotosensibilizzanti di questo composto si basano sulle sue proprietà fotochimiche e fotofisiche. Questi sono caratterizzati da picchi di eccitazione di fluorescenza multipli nell'intervallo 400-600 nm, che inducono l'emissione di fluorescenza a circa 600 nm. I massimi di assorbimento dell'ipericina all'interno della banda spettrale sono nell'intervallo 540-590 nm e i massimi di fluorescenza sono nell'intervallo 590-640 nm⁹. Per ottenere questi effetti fotosensibilizzanti, l'ipericina viene eccitata dalla luce laser ad una lunghezza d'onda di 405 nm dopo somministrazione locale¹⁰. In presenza di luce, l'ipericina può mostrare effetti virucidi, antiproliferativi e citotossici¹¹, mentre non vi è tossicità sistemica e viene rapidamente rilasciata dall'organismo. L'ipericina è una sostanza lipofila che forma aggregati non fluorescenti insolubili in acqua, motivo per cui diversi tipi di nanocarrier, come le nanoparticelle polimeriche 12,13 o le lipoproteine ad alta e bassa densità (HDL, LDL)^14,15, vengono utilizzati per aiutare la sua consegna e penetrazione nelle cellule. Poiché la CAM è un sistema naturalmente immunodeficiente, le cellule tumorali possono essere impiantate direttamente sulla superficie della membrana. Il modello è anche adatto per registrare l'entità del danno vascolare indotto da PDT secondo un punteggio definito^16,17. La luce di intensità inferiore rispetto alla PDT può essere utilizzata per la diagnosi fotodinamica (PDD). Il monitoraggio del tessuto sotto eccitazione viola La luce LED porta anche alla fotoattivazione dei fotosensibilizzatori^18,19,20 che si traduce in un'emissione di luce fluorescente^, ma non fornisce energia sufficiente per avviare una reazione PDT e danneggiare le cellule. Lo rende un buon strumento per la visualizzazione e la diagnosi del tumore o il monitoraggio della farmacocinetica dei PSs^14,15 usati.

Questo articolo descrive la preparazione del test CAM di quaglia ex ovo con tassi di sopravvivenza superiori all'80%. Questa coltura ex ovo è stata applicata con successo in un gran numero di esperimenti.

Protocollo

La ricerca è stata condotta nel rispetto delle linee guida istituzionali. Tutte le apparecchiature e i reagenti devono essere sterilizzati in autoclave o sterilizzati con etanolo al 70% o luce UV.

1. Incubazione delle uova

1. Conservare le uova di quaglia fecondate a 10-15 °C per un massimo di 4-5 giorni prima di iniziare l'incubazione. Utilizzare solo uova pulite e non danneggiate.
2. Incubare le uova in un'incubatrice a tiraggio forzato per ~ 53-54 h. Deporre le uova orizzontalmente con la rotazione delle uova disattivata, al 50%-60% di umidità e alla temperatura di incubazione di 37,5 °C.

2. Preparazione della coltura ex ovo

NOTA: Dopo l'incubazione iniziale, le uova sono adatte per iniziare la coltivazione ex ovo .

1. Disinfettare la superficie dell'uovo con etanolo al 70%, senza ruotare l'uovo.
2. In un armadio a flusso laminare sterile, aprire il guscio d'uovo usando piccole forbici chirurgiche sterili e trasferire il contenuto in una piastra di coltura a 6 pozzetti. Se fatto correttamente, l'embrione giacerà sopra un tuorlo non danneggiato. Dopo ogni uovo, disinfettare le forbici con etanolo al 70%.
3. Aggiungere circa 5 ml di acqua sterile agli spazi vuoti nella piastra a 6 pozzetti, poiché l'umidità è essenziale per evitare che il CAM si secchi.
4. Mettere gli embrioni in un'incubatrice fino a ulteriori esperimenti, mantenendo una temperatura di 37 ° C e 80% -90% di umidità.
5. Quando il CAM è completamente sviluppato (da ED7), posizionare un anello di silicone sterilizzato (6 mm di diametro e circa 1,5 mm di spessore) sulla superficie CAM, lungo i piccoli capillari. Evitare i principali vasi sanguigni quando si posiziona l'anello.
   NOTA: L'anello definisce lo spazio di lavoro, aiuta a contrassegnare il luogo di applicazione della sostanza e impedisce la fuoriuscita del contenuto liquido.
6. Terminare la coltivazione degli embrioni secondo la legislazione del paese.
7. È importante sottolineare che indossare guanti o tenere le mani disinfettate con etanolo al 70% durante il lavoro. Aspirare embrioni inclinati in modo improprio o uova non fecondate con un aspiratore a vuoto.

Figura 1: Preparazione della coltura ex ovo . A) uova di quaglia giapponesi immagazzinate e incubate. (B) Disinfezione della superficie delle uova con etanolo. (C) Il guscio d'uovo viene tagliato con le forbici. (D) Il contenuto dell'uovo viene svuotato nel pozzetto. (E) Embrione di 3 giorni di 3 giorni adeguatamente preparato, con vascolarizzazione CAM in via di sviluppo. (F) Piastre di coltura conservate in un'incubatrice. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figura 2: Piastra di coltura a 6 pozzetti con embrioni e anelli di silicone posizionati sulla parte superiore. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

3. Inoculazione di cellule tumorali

NOTA: Tutte le procedure richiedono l'uso di un armadio a flusso laminare sterile.

1. Coltura di diversi tipi di cellule aderenti in palloni secondo i rispettivi protocolli di coltura.
   1. Rimuovere il vecchio mezzo dai palloni e sciacquare lo strato cellulare con soluzione salina tamponata con fosfato sterile (PBS) per rimuovere le tracce del mezzo.
   2. Dopo la tripsinizzazione, inibire la tripsina aggiungendo il terreno di coltura e raccogliere le cellule in provette da centrifuga. Centrifugare le cellule e risospendere il pellet cellulare in un terreno di coltura fresco. Contare le cellule e risospenderle in un terreno di coltura cellulare alla concentrazione desiderata.
      NOTA: È anche possibile produrre colture cellulari 3D, cioè sferoidi utilizzando, ad esempio, il metodo della goccia sospesa²¹.
2. Impiantare 1 x 10 5-1 x 10⁶ cellule tumorali o^5-15 sferoidi (per CAM) in 30 μL di soluzione di mezzo cellulare nell'anello di silicone sulla parte superiore del CAM.
   NOTA: Il volume dipende dalle dimensioni dell'anello in silicone utilizzato. Se si utilizza un anello in silicone con un diametro maggiore, è necessario un volume maggiore per coprire l'intera area. A seconda del tipo di cellula, o per diversi tipi di esperimenti, possono essere utilizzate varie concentrazioni cellulari. A volte, la raschiatura fine della CAM viene utilizzata per migliorare l'adesione delle cellule incorporate.
3. Riportare le CAM con cellule inoculate nell'incubatore (37 °C e 80%-90% di umidità).

Figura 3: Inoculazione di CAM con tumori. (A) Aspirazione di sferoidi con una pipetta e (B) impianto sulla superficie CAM. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

4. Applicazione di fotosensibilizzatore

1. Applicazione di ipericina
   1. Sotto luci soffuse, preparare una soluzione madre di 2 mM di ipericina sciogliendola in 100% dimetil solfossido (DMSO). Preparare una soluzione di lavoro 79 μM di ipericina poco prima dell'esperimento con PBS sterile o soluzione salina. Assicurarsi che la concentrazione finale di DMSO in tutte le soluzioni sia sempre inferiore allo 0,2%, il che non influisce sullo sviluppo dell'embrione.
   2. In condizioni sterili, applicare un volume appropriato di soluzione di ipericina all'anello di silicone. Un volume di 30 μL è sufficiente per riempire un anello con un diametro di 6 mm.
   3. Conservare gli embrioni in un'incubatrice a 37 °C e 80%-90% di umidità. L'ipericina in una soluzione acquosa è fotoattiva dopo la sua monomerizzazione nel tessuto, circa 3 ore dopo la sua applicazione sulla CAM.
2. Applicazione di ipericina con LDL, HDL o nanoparticelle come sistemi di trasporto
   NOTA: Questi sistemi di trasporto sono utilizzati per migliorare la penetrazione dell'ipericina nelle cellule e nelle strutture cellulari.
   1. A causa della fotosensibilità, eseguire tutti i passaggi, compresa la preparazione delle soluzioni, in condizioni di scarsa illuminazione e conservare le soluzioni al buio.
   2. Preparare le formulazioni di ipericina-LDL e ipericina-HDL miscelando volumi appropriati di lipoproteine e soluzioni madre di ipericina in PBS secondo il riferimento¹⁵. La concentrazione di LDL o HDL in ipericina è 20:1¹⁵.
   3. Sintetizzare nanoparticelle polimeriche mediante polimerizzazione cationica vivente ad apertura di anello secondo i riferimenti^12,13. Regolare la concentrazione di ipericina nelle nanoparticelle polimeriche con PBS a 10 μM^12,13.

5. PDD e PDT

1. Condotta PDD
   1. In condizioni sterili, applicare fotosensibilizzatore (ipericina, nanoparticelle polimeriche caricate con ipericina o ipericina con vettore lipoproteico) sulla superficie CAM, con o senza cellule tumorali (ED 7-9).
   2. Illuminare la CAM utilizzando la luce di eccitazione viola (luce LED circolare personalizzata di lunghezza d'onda di 405 nm) e registrare la fluorescenza dell'ipericina nel tessuto CAM e nelle cellule tumorali con una fotocamera digitale a intervalli di tempo di 0, 1, 3, 5, 24 e 48 ore dopo la somministrazione di ipericina.
   3. Se la ricerca richiede un'immagine della CAM in luce bianca, registrare la CAM prima della somministrazione di ipericina e alla fine dell'esperimento, poco prima della fissazione tissutale, poiché la luce influenza la fotoattivazione dell'ipericina.
   4. Valutare l'intensità della fluorescenza utilizzando un programma di elaborazione e analisi delle immagini (ad esempio, ImageJ²²).
      1. Suddividete i canali immagine RGB in immagini rosse, verdi e blu separate. Analizza l'immagine di intensità rossa in forma a 8 bit. Valutare l'intensità del rosso dall'area all'interno dell'anello e approssimarla come fluorescenza dell'ipericina. Ottenere grafici di profili immagine interi (utilizzando il plugin Profile Plot di ImageJ) a diversi intervalli di tempo dopo la somministrazione di ipericina (cioè da 0 h, subito dopo la somministrazione, fino a 48 h).
2. Condotta PDT
   1. Eseguire la PDT almeno 3 ore dopo l'applicazione dell'ipericina.
   2. Posizionare la fibra ottica sopra la superficie del CAM affinché il raggio laser copra l'intera area all'interno dell'anello in silicone.
   3. Eseguire l'irradiazione in vivo (1-2 min) con una luce laser a 405 nm ad una velocità di fluenza di 285 mW/cm².
   4. Registrare CAM utilizzando luce bianca e luce fluorescente a 405 nm prima e dopo il trattamento fotodinamico (24 h e 48 h).
   5. Rileva i danni fotografici 24 ore e 48 ore dopo PDT dalle immagini scattate in luce bianca. Valutare il danno vascolare con un punteggio semiquantitativo¹⁶: 1 - nessuna distruzione; 2 - chiusura parziale dei capillari (diametro ≤10 μm) senza distruzione di vasi medi o più grandi (diametro ≥50 μm) e più piccoli (diametro 10-50 μm); 3 - chiusura parziale dei vasi più piccoli con la scomparsa dei capillari; 4 - chiusura parziale di vasi più grandi con vasi più piccoli e capillari che scompaiono; e 5 - trombosi fotografica totale con la maggior parte dei vasi che svaniscono.

Figura 4: Trattamento della CAM con luce laser. Questa foto è stata scattata a scopo illustrativo. Per PDD o PDT, la stanza deve essere buia. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

6. Preparazione della CAM per un'ulteriore valutazione

1. Incorporazione di paraffina
   1. Fissare il tessuto CAM in una piastra di coltivazione con paraformaldeide (PFA) al 4% in PBS per un minimo di 2 ore e un massimo di notte.
   2. Rimuovere il PFA e ritagliare con cura dal CAM una parte del tessuto all'interno dell'anello di silicone.
   3. Disidratare immediatamente il tessuto CAM in serie alcolica ascendente come segue. Posizionare il tessuto CAM in etanolo al 70% per 3 minuti, soluzione di eosina per 2 minuti (per una più facile localizzazione del tessuto nel blocco di paraffina), etanolo al 96% per 3 x 5 minuti (sempre in una nuova capsula di Petri) e etanolo al 100% per 5 minuti e xilene per 2 x 10 minuti.
   4. Utilizzando una spatola o una spazzola sottile, trasferire i campioni il più rapidamente possibile nella paraffina disciolta in piastre di Petri (59 °C). Dopo 24 ore, posizionare il tessuto in uno stampo istologico, riempirlo con mezzo di incorporamento della paraffina e lasciarlo solidificare in frigorifero. Tagliare il CAM solidificato dal mezzo di incorporamento, girarlo nel vassoio di 90°, riempirlo nuovamente con il mezzo di incorporamento e lasciarlo solidificare.
   5. Preparare sezioni da 5-10 μm su un microtomo per l'analisi istopatologica per determinare il danno indotto da PDT.
2. Preparazione di sezioni CAM congelate per istologia
   NOTA: Per alcune metodologie, tra cui l'istologia, le sezioni congelate preparate su microtomo criostato sono più adatte. Seguire i passaggi seguenti per preparare le sezioni CAM congelate.
   1. Montare con cura CAM nativo o fissato con paraformaldeide al 4% sul vetrino.
   2. Riempire lo stampo incorporato a metà con un composto a temperatura di taglio ottimale (OCT) e congelare in azoto liquido o una miscela di ghiaccio secco ed etanolo.
   3. Dopo il congelamento, inclinare e far scorrere con attenzione il CAM dal vetrino sulla parte superiore del mezzo OCT congelato. Introdurre nuovamente nello stampo, coprire con il mezzo OCT e congelare come al punto 6.2.2.
3. Analisi frattale della CAM di quaglia
   NOTA: Le variazioni vascolari causate dalla PDT possono essere valutate calcolando il coefficiente di dimensione frattale¹⁹.
   1. Nell'armadio a flusso laminare, trabocco CAM in una piastra di coltivazione con una soluzione di fissazione preriscaldata (37 °C) di paraformaldeide al 4% e glutaraldeide al 2% in PBS.
   2. Rimuovere la soluzione di fissazione dopo 48 ore. Separare accuratamente la CAM dall'embrione con micro-forbici e una spazzola fine e lavarla in PBS.
   3. Montare il CAM lavato su un vetrino e lasciarlo asciugare lentamente.
   4. Fotografa la diapositiva utilizzando una fotocamera digitale e un transilluminatore come fonte di luce bianca omogenea.
   5. Elaborazione di immagini digitali mediante il software ImageJ²². Per l'analisi, selezionare una regione quadrata (512 × 512 pixel) dall'area con rami arteriosi distali. Binarizzare e scheletrizzare le immagini e calcolare il coefficiente di dimensione frattale (Df) seguendo le procedure descritte nel riferimento³¹.
4. Analisi molecolare del tessuto CAM
   1. Per l'analisi molecolare, separare accuratamente il CAM nativo, congelare in azoto liquido e conservare a -80 °C.
   2. Determinare l'espressione genica secondo i protocolli standard per l'isolamento dell'RNA²³, la trascrizione inversa in cDNA e la PCR quantitativa²⁴.

Figura 5: Tessuto CAM per l'analisi frattale. Dopo PDT, CAM viene fissato, montato su un vetrino e asciugato per l'analisi frattale. La foto è stata scattata in luce bianca utilizzando un transilluminatore. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Risultati

La localizzazione del tumore sulla superficie CAM è difficile in luce bianca. Il fotosensibilizzatore (qui, l'ipericina) utilizzato nella PDD dovrebbe essere assorbito selettivamente dal tumore e aiuta a visualizzare il tumore. L'aggiunta di ipericina e l'uso di luce fluorescente (ad esempio, 405 nm) hanno mostrato molto bene la posizione del tumore (carcinoma a cellule squamose TE1) (Figura 6A). L'analisi istologica ha mostrato cellule tumorali vitali che invadono i tessuti sani. Strutture...

Discussione

Per una coltivazione ex ovo di successo, è importante seguire il protocollo di cui sopra. Inoltre, se le uova non vengono aperte con sufficiente attenzione o c'è umidità insufficiente durante la coltivazione, il sacco del tuorlo si attacca al guscio e spesso si rompe. L'inizio di una coltivazione ex ovo al momento di circa 60 ore di incubazione dell'uovo garantisce l'alto tasso di sopravvivenza degli embrioni, poiché sono già abbastanza grandi da sopravvivere alla manipolazione. Nelle fasi successi...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
6-Well Cell Culture Plate	Sarstedt	83.392	Transparent polystyrene, sterile
CO2 Incubator ESCO CCL-0508	ESCO, Singapore	CCL-050B-8	CO2 cell culture incubator
cryocut Leica CM 1800	Reichert-Jung, USA
digital camera Canon EOS 6D II	Canon, Japan
diode laser 405 nm	Ocean Optics, USA
DMSO	Sigma-Aldrich	67-68-5	dimethyl sulfoxid
eosin	Sigma-Aldrich	15086-94-9
ethanol	Sigma-Aldrich	64-17-5
fine brush size 2	Faber-Castell	281802	brush for CAM separation and manipulation
glutaraldehyde	Sigma-Aldrich	111-30-8
hematoxylin	Sigma-Aldrich	517-28-2
hypericin	Sigma-Aldrich	84082-80-4
incubator Bios Midi	Bios Sedlany, Czech Republic		Forced draught incubator for initial incubation
incubator Memmert IF160	Memmert, Germany		Forced air circulation incubator for CAM incubation
Kaiser slimlite plano, LED light box	Kaiser, Germany	2453	Transilluminator
LED light 405 nm			custom made circular LED light
macro lens Canon MP- E 65 mm f/2.8	Canon, Japan
microscope Kapa 2000	Kvant, Slovakia		optical microscope
microtome Auxilab 508	Auxilab, Spain		manual rotary microtome
paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	30525-89-4
Paraplast Plus	Sigma-Aldrich	P3683	parafin medium for tissue embedding
PBS	Sigma-Aldrich	P4417	Phosphate saline buffer
scissors Castroviejo	Orimed	OR66-108	micro scissors for CAM separation
software ImageJ 1.53	public domain		image processing and analysis program
stock solution HDL	Sigma-Aldrich	437641-10MG	high density lipoproteins
stock solution LDL	Sigma-Aldrich	437644-10MG	low density lipoproteins
Tissue-Tek O.C.T. Compound	Sakura Finetek	4583	Optimal Cutting Temperature Compound 118 mL squeeze bottles