Хориоаллантоическая мембрана перепела - инструмент для фотодинамической диагностики и терапии

Резюме

Хориоаллантоическая мембрана (CAM) птичьего эмбриона является очень полезным и применимым инструментом для различных областей исследований. Специальная ex ovo модель японского перепела CAM подходит для фотодинамического исследования лечения.

Аннотация

Хориоаллантоическая мембрана (CAM) птичьего эмбриона представляет собой тонкую, экстраэмбриональную мембрану, которая функционирует как первичный орган дыхания. Его свойства делают его отличной экспериментальной моделью in vivo для изучения ангиогенеза, роста опухоли, систем доставки лекарств или фотодинамической диагностики (PDD) и фотодинамической терапии (PDT). В то же время эта модель отвечает требованию о замене экспериментальных животных подходящей альтернативой. Ex ovo культивируемый эмбрион обеспечивает легкое нанесение вещества, доступ, мониторинг и документирование. Наиболее часто используемым является цыпленок CAM; Однако в данной статье описываются преимущества японской перепелиной CAM как недорогой и высокопроизводительной модели. Еще одним преимуществом является более короткое эмбриональное развитие, что позволяет увеличить экспериментальную текучесть кадров. Здесь исследуется пригодность перепелиного CAM для PDD и PDT рака и микробных инфекций. В качестве примера описано применение фотосенсибилизатора гиперицина в комбинации с липопротеинами или наночастицами в качестве системы доставки. Определена оценка повреждений от изображений в белом свете и изменения интенсивности флуоресценции ткани CAM при фиолетовом свете (405 нм) совместно с анализом гистологических срезов. Перепелиный CAM четко показал влияние ФДТ на сосудистую систему и ткани. Кроме того, могут наблюдаться такие изменения, как капиллярное кровоизлияние, тромбоз, лизис мелких сосудов и кровотечение из более крупных сосудов. Японский перепел CAM является перспективной моделью in vivo для фотодинамической диагностики и исследований терапии, с применением в исследованиях опухолевого ангиогенеза, а также антиваскулярной и антимикробной терапии.

Введение

Модель куриной хориоаллантоической мембраны (CAM) хорошо известна и широко используется в различных областях исследований. Это богато васкуляризованный экстраэмбриональный орган, обеспечивающий газообмен и транспорт минералов¹. Благодаря прозрачности и доступности этой мембраны отдельные кровеносные сосуды и их структурные изменения можно наблюдать в режиме реального времени². Несмотря на преимущества, цыпленок CAM также имеет некоторые ограничения (например, более крупные селекционные мощности, производство яиц и потребление кормов), которых можно избежать, используя другие виды птиц. В этом протоколе описана альтернати....

протокол

Исследование проводилось в соответствии с институциональными руководящими принципами. Все оборудование и реагенты должны быть автоклавированы или стерилизованы 70% этанолом или ультрафиолетовым светом.

1. Инкубация яиц

1. Храните оплодотворенные перепелиные яйца при 10-15 °C максимум за 4-5 дней до начала инкубации. Используйте только чистые и неповрежденные яйца.
2. Высиживать яйца в инкубаторе принудительной тяги ~ 53-54 ч. Откладывайте яйца горизонтально с выключенным вращением яиц при влажности 50-60% и температуре инкубации 37,5 °C.

2. Ex ovo культура подго....

Результаты

Локализация опухоли на поверхности CAM затруднена при белом свете. Фотосенсибилизатор (здесь, гиперицин), используемый при PDD, как ожидается, будет избирательно поглощаться опухолью и помогает визуализировать опухоль. Добавление гиперицина и использование флуоресцентного света (наприм.......

Обсуждение

Для успешного выращивания ex ovo важно следовать протоколу выше. Более того, если яйца не открыты достаточно тщательно или во время выращивания недостаточно влажности, желточный мешок прилипает к скорлупе и часто разрывается. Начало культивирования ex ovo во время около 60 ч инкуба.......

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
6-Well Cell Culture Plate	Sarstedt	83.392	Transparent polystyrene, sterile
CO2 Incubator ESCO CCL-0508	ESCO, Singapore	CCL-050B-8	CO2 cell culture incubator
cryocut Leica CM 1800	Reichert-Jung, USA
digital camera Canon EOS 6D II	Canon, Japan
diode laser 405 nm	Ocean Optics, USA
DMSO	Sigma-Aldrich	67-68-5	dimethyl sulfoxid
eosin	Sigma-Aldrich	15086-94-9
ethanol	Sigma-Aldrich	64-17-5
fine brush size 2	Faber-Castell	281802	brush for CAM separation and manipulation
glutaraldehyde	Sigma-Aldrich	111-30-8
hematoxylin	Sigma-Aldrich	517-28-2
hypericin	Sigma-Aldrich	84082-80-4
incubator Bios Midi	Bios Sedlany, Czech Republic		Forced draught incubator for initial incubation
incubator Memmert IF160	Memmert, Germany		Forced air circulation incubator for CAM incubation
Kaiser slimlite plano, LED light box	Kaiser, Germany	2453	Transilluminator
LED light 405 nm			custom made circular LED light
macro lens Canon MP- E 65 mm f/2.8	Canon, Japan
microscope Kapa 2000	Kvant, Slovakia		optical microscope
microtome Auxilab 508	Auxilab, Spain		manual rotary microtome
paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	30525-89-4
Paraplast Plus	Sigma-Aldrich	P3683	parafin medium for tissue embedding
PBS	Sigma-Aldrich	P4417	Phosphate saline buffer
scissors Castroviejo	Orimed	OR66-108	micro scissors for CAM separation
software ImageJ 1.53	public domain		image processing and analysis program
stock solution HDL	Sigma-Aldrich	437641-10MG	high density lipoproteins
stock solution LDL	Sigma-Aldrich	437644-10MG	low density lipoproteins
Tissue-Tek O.C.T. Compound	Sakura Finetek	4583	Optimal Cutting Temperature Compound 118 mL squeeze bottles