Membrana corioalantoidea de codorniz: una herramienta para el diagnóstico fotodinámico y la terapia

Resumen

La membrana corioalantoidea (CAM) del embrión aviar es una herramienta muy útil y aplicable para diversas áreas de investigación. Un modelo especial ex ovo de codorniz japonesa CAM es adecuado para la investigación de tratamientos fotodinámicos.

Resumen

La membrana corioalantoidea (CAM) de un embrión aviar es una membrana delgada y extraembrionaria que funciona como un órgano respiratorio primario. Sus propiedades lo convierten en un excelente modelo experimental in vivo para estudiar angiogénesis, crecimiento tumoral, sistemas de administración de fármacos o diagnóstico fotodinámico (PDD) y terapia fotodinámica (PDT). Al mismo tiempo, este modelo aborda el requisito de reemplazar animales de experimentación con una alternativa adecuada. El embrión cultivado ex ovo permite una fácil aplicación, acceso, monitoreo y documentación de sustancias. El más utilizado es el chick CAM; sin embargo, este artículo describe las ventajas de la CAM de codorniz japonesa como un modelo de bajo costo y alto rendimiento. Otra ventaja es el desarrollo embrionario más corto, que permite una mayor rotación experimental. Aquí se explora la idoneidad de la CAM de codorniz para PDD y PDT de cáncer e infecciones microbianas. Como ejemplo, se describe el uso del fotosensibilizador hipericina en combinación con lipoproteínas o nanopartículas como sistema de administración. Se determinó la puntuación de daño de las imágenes en luz blanca y los cambios en la intensidad de fluorescencia del tejido CAM bajo luz violeta (405 nm), junto con el análisis de las secciones histológicas. La CAM de codorniz mostró claramente el efecto de la TFD en la vasculatura y el tejido. Además, se pueden observar cambios como hemorragia capilar, trombosis, lisis de vasos pequeños y sangrado de vasos más grandes. La CAM de codorniz japonesa es un modelo in vivo prometedor para el diagnóstico fotodinámico y la investigación terapéutica, con aplicaciones en estudios de angiogénesis tumoral, así como terapia antivascular y antimicrobiana.

Introducción

El modelo de membrana corioalantoidea (CAM) de pollo es bien conocido y ampliamente utilizado en diversas áreas de investigación. Es un órgano extraembrionario ricamente vascularizado que proporciona intercambio gaseoso y transporte mineral¹. Debido a la transparencia y accesibilidad de esta membrana, los vasos sanguíneos individuales y sus cambios estructurales se pueden observar en tiempo real². A pesar de las ventajas, la CAM de los pollitos también tiene algunas limitaciones (por ejemplo, instalaciones de cría más grandes, producción de huevos y consumo de alimento) que podrían evitarse mediante el uso de otras especies de aves. En este protocolo, se describe un modelo alternativo ex ovo CAM utilizando embrión de codorniz japonesa (Coturnix japonica). Debido a su pequeño tamaño, permite el uso de un número mucho mayor de individuos experimentales que el pollo CAM. Además, el desarrollo embrionario más corto de 16 días de los embriones de codorniz es otra ventaja. Los primeros vasos más grandes en la CAM de codorniz aparecen en el día embrionario (DE) 7. Esto se puede comparar directamente con el desarrollo del embrión de pollo (etapas 4-35); Sin embargo, las etapas posteriores de desarrollo ya no son comparables y requieren menos tiempo para el embrión de codorniz³. De interés es la ocurrencia regular de ramificación microvascular similar a la de las CAM de pollo ^4,5,6. La rápida maduración sexual, la alta producción de huevos y la reproducción de bajo costo son otros ejemplos que favorecen el uso de este modelo experimental⁷.

Un modelo CAM aviar se utiliza a menudo en estudios de terapia fotodinámica (TFD)⁸. La TFD se utiliza para tratar varias formas de cáncer (tumores pequeños localizados) y otras enfermedades no oncológicas. Su principio está en la administración de un fármaco fluorescente, un fotosensibilizador (PS), al tejido dañado y su activación con luz de la longitud de onda adecuada. Una PS prospectiva utilizada en la investigación es la hipericina, originalmente aislada de la planta medicinal hierba de San Juan (Hypericum perforatum)⁹. Los fuertes efectos fotosensibilizantes de este compuesto se basan en sus propiedades fotoquímicas y fotofísicas. Estos se caracterizan por múltiples picos de excitación de fluorescencia en el rango de 400-600 nm, que inducen la emisión de fluorescencia a aproximadamente 600 nm. Los máximos de absorción de hipericina dentro de la banda espectral están en el rango de 540-590 nm, y los máximos de fluorescencia están en el rango de 590-640 nm⁹. Para lograr estos efectos fotosensibilizantes, la hipericina es excitada por la luz láser a una longitud de onda de 405 nm después de la administración local¹⁰. En presencia de luz, la hipericina puede exhibir efectos virucidas, antiproliferativos y citotóxicos¹¹, mientras que no hay toxicidad sistémica y es liberada rápidamente del organismo. La hipericina es una sustancia lipofílica que forma agregados no fluorescentes insolubles en agua, por lo que se utilizan varios tipos de nanoportadores, como las nanopartículas poliméricas 12,13 o las lipoproteínas de alta y baja densidad (HDL, LDL)^14,15, para ayudar a su entrega y penetración en las células. Dado que CAM es un sistema naturalmente inmunodeficiente, las células tumorales se pueden implantar directamente en la superficie de la membrana. El modelo también es adecuado para registrar la extensión del daño vascular inducido por TFD de acuerdo con una puntuación definida^16,17. La luz de menor intensidad en comparación con la TFD se puede utilizar para el diagnóstico fotodinámico (PDD). El monitoreo del tejido bajo la luz LED de excitación violeta también conduce a la fotoactivación de fotosensibilizadores^18,19,20 que resulta en una emisión de luz fluorescente^, pero no proporciona suficiente energía para iniciar una reacción PDT y dañar las células. Lo convierte en una buena herramienta para la visualización y diagnóstico de tumores o para el monitoreo de la farmacocinética de las PSs utilizadas^14,15.

Este artículo describe la preparación del ensayo de codorniz ex ovo CAM con tasas de supervivencia superiores al 80%. Este cultivo ex ovo se aplicó con éxito en un gran número de experimentos.

Protocolo

La investigación se realizó de acuerdo con las directrices institucionales. Todos los equipos y reactivos deben ser esterilizados en autoclave o esterilizados con etanol al 70% o luz UV.

1. Incubación de huevos

1. Almacene los huevos de codorniz fertilizados a 10-15 °C durante un máximo de 4-5 días antes de comenzar la incubación. Use solo huevos limpios y sin daños.
2. Incubar los huevos en una incubadora de tiro forzado durante ~ 53-54 h. Ponga los huevos horizontalmente con la rotación de huevos desactivada, al 50% -60% de humedad y a 37,5 °C de temperatura de incubación.

2. Preparación ex ovo del cultivo

NOTA: Después de la incubación inicial, los huevos son adecuados para comenzar el cultivo ex ovo .

1. Desinfecte la superficie del huevo con etanol al 70%, sin rotar el huevo.
2. En un gabinete estéril de flujo laminar, abra la cáscara del huevo con pequeñas tijeras quirúrgicas estériles y transfiera el contenido a una placa de cultivo de 6 pocillos. Si se hace correctamente, el embrión se colocará sobre una yema intacta. Después de cada huevo, desinfecte las tijeras con etanol al 70%.
3. Agregue aproximadamente 5 ml de agua estéril a los huecos en la placa de 6 pocillos, ya que la humedad es esencial para evitar que el CAM se seque.
4. Coloque los embriones en una incubadora hasta nuevos experimentos, manteniendo una temperatura de 37 ° C y 80% -90% de humedad.
5. Cuando el CAM esté completamente desarrollado (a partir de ED7), coloque un anillo de silicona esterilizado (6 mm de diámetro y aproximadamente 1,5 mm de espesor) en la superficie del CAM, a lo largo de los pequeños capilares. Evite los vasos sanguíneos principales al colocar el anillo.
   NOTA: El anillo define el espacio de trabajo, ayuda a marcar el lugar de aplicación de la sustancia y evita que el contenido líquido se escape.
6. Terminar el cultivo de los embriones de acuerdo con la legislación del país.
7. Es importante destacar que use guantes o mantenga las manos desinfectadas con etanol al 70% durante el trabajo. Aspire embriones con punta incorrecta u óvulos no fertilizados con un aspirador al vacío.

Figura 1: Preparación del cultivo ex ovo . (A) Huevos de codorniz japonesa tal como se almacenan e incuban. (B) Desinfección de la superficie del huevo con etanol. (C) La cáscara de huevo se corta con tijeras. (D) El contenido del huevo se vacía en el pozo. (E) Embrión de 3 días debidamente preparado, con vasculatura CAM en desarrollo. (F) Placas de cultivo almacenadas en una incubadora. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Placa de cultivo de 6 pocillos con embriones y anillos de silicona colocados en la parte superior. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

3. Inoculación de células tumorales

NOTA: Todos los procedimientos requieren el uso de un gabinete de flujo laminar estéril.

1. Cultivar diferentes tipos de células adherentes en matraces de acuerdo con los respectivos protocolos de cultivo.
   1. Retire el medio viejo de los matraces y enjuague la capa celular con solución salina estéril tamponada con fosfato (PBS) para eliminar los restos del medio.
   2. Después de la tripsinización, inhiba la tripsina agregando el medio de cultivo y cosecha las células en tubos de centrífuga. Centrifugar las células y resuspender el pellet celular en un medio de cultivo fresco. Contar las células y resuspenderlas en un medio de cultivo celular a la concentración deseada.
      NOTA: También es posible producir cultivos celulares 3D, es decir, esferoides utilizando, por ejemplo, el método de gota colgante²¹.
2. Implante 1 x 10 5-1 x 10⁶ células tumorales o^5-15 esferoides (por CAM) en 30 μL de solución de medio celular en el anillo de silicona en la parte superior de la CAM.
   NOTA: El volumen depende del tamaño del anillo de silicona utilizado. Si se utiliza un anillo de silicona con un diámetro mayor, se necesita un volumen mayor para cubrir toda el área. Dependiendo del tipo de célula, o para diferentes tipos de experimentos, se pueden utilizar varias concentraciones celulares. A veces, el raspado fino de CAM se utiliza para mejorar la adhesión de las células incrustadas.
3. Devolver las CAM con células inoculadas a la incubadora (37 °C y 80%-90% de humedad).

Figura 3: Inoculación de CAM con tumores . (A) Aspiración de esferoides con una pipeta, y (B) implantación en la superficie de CAM. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

4. Aplicación del fotosensibilizador

1. Aplicación de hipericina
   1. Con poca luz, prepare una solución madre de hipericina de 2 mM disolviéndola en dimetilsulfóxido (DMSO) al 100%. Prepare una solución de trabajo de 79 μM de hipericina poco antes del experimento con PBS estéril o solución salina. Asegúrese de que la concentración final de DMSO en todas las soluciones sea siempre inferior al 0,2%, lo que no afecta el desarrollo del embrión.
   2. En condiciones estériles, aplique un volumen apropiado de solución de hipericina al anillo de silicona. Un volumen de 30 μL es suficiente para llenar un anillo con un diámetro de 6 mm.
   3. Mantener los embriones en una incubadora a 37 °C y 80%-90% de humedad. La hipericina en una solución acuosa es fotoactiva después de su monomerización en el tejido, aproximadamente 3 h después de su aplicación en el CAM.
2. Aplicación de hipericina con LDL, HDL o nanopartículas como sistemas de transporte
   NOTA: Estos sistemas de transporte se utilizan para mejorar la penetración de la hipericina en las células y estructuras celulares.
   1. Debido a la fotosensibilidad, realice todos los pasos, incluida la preparación de soluciones, con poca luz y almacene las soluciones en la oscuridad.
   2. Preparar las formulaciones de hipericina-LDL e hipericina-HDL mezclando volúmenes apropiados de lipoproteínas y soluciones madre de hipericina en PBS de acuerdo con la referencia¹⁵. La concentración de LDL o HDL a hipericina es 20:1¹⁵.
   3. Sintetizar nanopartículas poliméricas por polimerización de apertura de anillo catiónico vivo según las referencias^12,13. Ajustar la concentración de hipericina en nanopartículas poliméricas con PBS a 10 μM^12,13.

5. PDD y PDT

1. Realizar PDD
   1. En condiciones estériles, aplique fotosensibilizador (hipericina, nanopartículas poliméricas cargadas de hipericina o hipericina con portador de lipoproteínas) en la superficie CAM, con o sin células tumorales (ED 7-9).
   2. Ilumine el CAM usando luz de excitación violeta (luz LED circular hecha a medida de longitud de onda de 405 nm) y registre la fluorescencia de hipericina en el tejido CAM y las células tumorales con una cámara digital a intervalos de tiempo de 0, 1, 3, 5, 24 y 48 h después de la administración de hipericina.
   3. Si la investigación requiere una imagen de la CAM en luz blanca, registre la CAM antes de la administración de hipericina y al final del experimento, poco antes de la fijación del tejido, ya que la luz afecta la fotoactivación de la hipericina.
   4. Evalúe la intensidad de fluorescencia utilizando un programa de procesamiento y análisis de imágenes (por ejemplo, ImageJ²²).
      1. Divida los canales de imagen RGB en imágenes rojas, verdes y azules separadas. Analice la imagen de intensidad roja en forma de 8 bits. Evalúe la intensidad roja del área dentro del anillo y aproxime a ella como la fluorescencia de hipericina. Obtenga gráficos de perfil de imagen completa (utilizando el complemento Profile Plot de ImageJ) en diferentes intervalos de tiempo después de la administración de hipericina (es decir, desde 0 h, justo después de la administración, hasta 48 h).
2. Realizar PDT
   1. Realizar la TFD al menos 3 h después de la aplicación de hipericina.
   2. Coloque la fibra óptica sobre la superficie del CAM para que el rayo láser cubra toda el área dentro del anillo de silicona.
   3. Realizar irradiación in vivo (1-2 min) con una luz láser de 405 nm a una velocidad de fluencia de 285 mW/^cm2.
   4. Grabar CAM con luz blanca y luz fluorescente de 405 nm antes y después del tratamiento fotodinámico (24 h y 48 h).
   5. Detecte fotodaños 24 h y 48 h después de la TFD a partir de las imágenes tomadas con luz blanca. Evaluar el daño vascular por una puntuación semicuantitativa¹⁶: 1 - sin destrucción; 2 - cierre parcial de los capilares (diámetro ≤10 μm) sin destrucción de vasos medianos o grandes (diámetro ≥50 μm) y más pequeños (diámetro 10-50 μm); 3 - cierre parcial de vasos más pequeños con capilares que desaparecen; 4 - cierre parcial de vasos más grandes con vasos más pequeños y capilares que desaparecen; y 5 - fototrombosis total con la mayoría de los vasos desapareciendo.

Figura 4: Tratamiento de CAM con luz láser. Esta foto fue tomada con fines ilustrativos. Para PDD o PDT, la habitación debe estar oscura. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

6. Preparación de CAM para una evaluación adicional

1. Incrustación de parafina
   1. Fijar el tejido CAM en una placa de cultivo con paraformaldehído (PFA) al 4% en PBS durante un mínimo de 2 h y un máximo de durante la noche.
   2. Retire el PFA y corte cuidadosamente de la CAM una parte del tejido dentro del anillo de silicona.
   3. Deshidratar inmediatamente el tejido CAM en series ascendentes de alcohol de la siguiente manera. Coloque el tejido CAM en etanol al 70% durante 3 min, solución de eosina durante 2 min (para facilitar la ubicación del tejido en el bloque de parafina), etanol al 96% durante 3 x 5 min (siempre en una nueva placa de Petri) y etanol al 100% durante 5 min y xileno durante 2 x 10 min.
   4. Con una espátula o un cepillo fino, transferir las muestras lo más rápidamente posible a la parafina disuelta en placas de Petri (59 °C). Después de 24 h, coloque el tejido en molde histológico, llénelo con un medio de inserción de parafina y deje que se solidifique en el refrigerador. Corte la CAM solidificada del medio de incrustación, gírela en la bandeja 90°, llénela nuevamente con el medio de incrustación y deje que se solidifique.
   5. Preparar secciones de 5-10 μm en un micrótomo para el análisis histopatológico para determinar el daño inducido por PDT.
2. Preparación de secciones CAM congeladas para histología
   NOTA: Para algunas metodologías, incluida la histología, las secciones congeladas preparadas en el microtomo criostato son más adecuadas. Siga los pasos a continuación para preparar las secciones CAM congeladas.
   1. Monte cuidadosamente CAM nativa o fijada con paraformaldehído al 4% en el portaobjetos de vidrio.
   2. Llene el molde de incrustación a la mitad con un compuesto de temperatura de corte óptimo (OCT) y congele en nitrógeno líquido o una mezcla de hielo seco y etanol.
   3. Después de la congelación, incline y deslice con cuidado la CAM desde el portaobjetos de vidrio hasta la parte superior del medio OCT congelado. Colocar de nuevo en el molde, cubrir con medio OCT y congelar como en el paso 6.2.2.
3. Análisis fractal de codornices CAM
   NOTA: Los cambios en la vasculatura causados por la TFD pueden evaluarse calculando el coeficiente de dimensión fractal¹⁹.
   1. En la cabina de flujo laminar, desbordar CAM en una placa de cultivo con una solución de fijación precalentada (37 °C) de paraformaldehído al 4% y glutaraldehído al 2% en PBS.
   2. Retirar la solución de fijación después de 48 h. Separe cuidadosamente la CAM del embrión con microtijeras y un cepillo fino y lávela en PBS.
   3. Monte la CAM lavada en un portaobjetos de vidrio y déjela secar lentamente.
   4. Fotografíe la diapositiva utilizando una cámara digital y un transiluminador como fuente de luz blanca homogénea.
   5. Procesar imágenes digitales con el software ImageJ²². Para el análisis, seleccione una región cuadrada (512 × 512 píxeles) del área con ramas arteriales distales. Binariza y esqueletizar las imágenes y calcular el coeficiente de dimensión fractal (Df) siguiendo los procedimientos descritos en la referencia³¹.
4. Análisis molecular del tejido CAM
   1. Para el análisis molecular, separe cuidadosamente la CAM nativa, congele en nitrógeno líquido y guárdela a -80 °C.
   2. Determinar la expresión génica de acuerdo con los protocolos estándar para el aislamiento de ARN²³, la transcripción inversa en ADNc y la PCR cuantitativa²⁴.

Figura 5: Tejido CAM para análisis fractal. Después de PDT, CAM se fija, se monta en un portaobjetos y se seca para el análisis fractal. La foto fue tomada con luz blanca usando un transiluminador. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Resultados

La localización del tumor en la superficie CAM es difícil con luz blanca. Se espera que el fotosensibilizador (aquí, hipericina) utilizado en el PDD sea absorbido selectivamente por el tumor y ayude a visualizar el tumor. La adición de hipericina y el uso de luz fluorescente (p. ej., 405 nm) mostraron muy bien la posición del tumor (carcinoma de células escamosas TE1) (Figura 6A). El análisis histológico mostró células tumorales vitales invadiendo tejidos sanos. Las estructuras con...

Discusión

Para un cultivo ex ovo exitoso, es importante seguir el protocolo anterior. Además, si los huevos no se abren con suficiente cuidado o no hay humedad suficiente durante el cultivo, el saco vitelino se adhiere a la cáscara y, a menudo, se rompe. El inicio de un cultivo ex ovo en el momento de aproximadamente 60 h de incubación de huevos asegura la alta tasa de supervivencia de los embriones, ya que ya son lo suficientemente grandes como para sobrevivir a la manipulación. En las etapas posteriores del...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
6-Well Cell Culture Plate	Sarstedt	83.392	Transparent polystyrene, sterile
CO2 Incubator ESCO CCL-0508	ESCO, Singapore	CCL-050B-8	CO2 cell culture incubator
cryocut Leica CM 1800	Reichert-Jung, USA
digital camera Canon EOS 6D II	Canon, Japan
diode laser 405 nm	Ocean Optics, USA
DMSO	Sigma-Aldrich	67-68-5	dimethyl sulfoxid
eosin	Sigma-Aldrich	15086-94-9
ethanol	Sigma-Aldrich	64-17-5
fine brush size 2	Faber-Castell	281802	brush for CAM separation and manipulation
glutaraldehyde	Sigma-Aldrich	111-30-8
hematoxylin	Sigma-Aldrich	517-28-2
hypericin	Sigma-Aldrich	84082-80-4
incubator Bios Midi	Bios Sedlany, Czech Republic		Forced draught incubator for initial incubation
incubator Memmert IF160	Memmert, Germany		Forced air circulation incubator for CAM incubation
Kaiser slimlite plano, LED light box	Kaiser, Germany	2453	Transilluminator
LED light 405 nm			custom made circular LED light
macro lens Canon MP- E 65 mm f/2.8	Canon, Japan
microscope Kapa 2000	Kvant, Slovakia		optical microscope
microtome Auxilab 508	Auxilab, Spain		manual rotary microtome
paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	30525-89-4
Paraplast Plus	Sigma-Aldrich	P3683	parafin medium for tissue embedding
PBS	Sigma-Aldrich	P4417	Phosphate saline buffer
scissors Castroviejo	Orimed	OR66-108	micro scissors for CAM separation
software ImageJ 1.53	public domain		image processing and analysis program
stock solution HDL	Sigma-Aldrich	437641-10MG	high density lipoproteins
stock solution LDL	Sigma-Aldrich	437644-10MG	low density lipoproteins
Tissue-Tek O.C.T. Compound	Sakura Finetek	4583	Optimal Cutting Temperature Compound 118 mL squeeze bottles