Membrana corioalantóica de codorna - Uma ferramenta para diagnóstico fotodinâmico e terapia

Resumo

A membrana corioalantóica (CAM) do embrião aviário é uma ferramenta muito útil e aplicável para várias áreas de pesquisa. Um modelo ex ovo especial de CAM de codorna japonesa é adequado para investigação de tratamento fotodinâmico.

Resumo

A membrana corioalantóica (CAM) de um embrião aviário é uma membrana fina e extraembrionária que funciona como um órgão respiratório primário. Suas propriedades o tornam um excelente modelo experimental in vivo para estudar angiogênese, crescimento tumoral, sistemas de liberação de drogas ou diagnóstico fotodinâmico (PDD) e terapia fotodinâmica (TFD). Ao mesmo tempo, este modelo aborda a exigência de substituição de animais experimentais por uma alternativa adequada. O embrião cultivado Ex ovo permite fácil aplicação, acesso, monitoramento e documentação de substâncias. O mais utilizado é o CAM de pintinhos; no entanto, este artigo descreve as vantagens da codorna japonesa CAM como um modelo de baixo custo e alto rendimento. Outra vantagem é o menor desenvolvimento embrionário, que permite maior rotatividade experimental. A adequação da CAM de codorna para PDD e PDT de câncer e infecções microbianas é explorada aqui. Como exemplo, descreve-se o uso do fotossensibilizador hipericina em combinação com lipoproteínas ou nanopartículas como sistema de entrega. O escore de dano das imagens em luz branca e as alterações na intensidade de fluorescência do tecido CAM sob luz violeta (405 nm) foram determinados, juntamente com a análise dos cortes histológicos. A CAM de codorna mostrou claramente o efeito da TFD sobre a vasculatura e o tecido. Além disso, alterações como hemorragia capilar, trombose, lise de pequenos vasos e sangramento de vasos maiores puderam ser observadas. A CAM de codorna japonesa é um modelo in vivo promissor para diagnóstico fotodinâmico e pesquisa terapêutica, com aplicações em estudos de angiogênese tumoral, bem como terapia antivascular e antimicrobiana.

Introdução

O modelo de membrana corioalantóica de frango (CAM) é bem conhecido e amplamente utilizado em várias áreas de pesquisa. É um órgão extraembrionário ricamente vascularizado que proporciona troca gasosa e transporte mineral¹. Devido à transparência e acessibilidade dessa membrana, vasos sanguíneos individuais e suas alterações estruturais podem ser observados em tempo real². Apesar das vantagens, o CAM de pintos também tem algumas limitações (por exemplo, instalações de reprodução maiores, produção de ovos e consumo de ração) que poderiam ser evitadas usando outras espécies aviárias. Neste protocolo, um modelo alternativo ex ovo CAM usando embrião de codorna japonesa (Coturnix japonica) é descrito. Devido ao seu pequeno tamanho, permite o uso de um número muito maior de indivíduos experimentais do que o CAM de frango. Além disso, o desenvolvimento embrionário mais curto de 16 dias dos embriões de codornas é outra vantagem. Os primeiros vasos maiores na CAM das codornas aparecem no dia embrionário (DE) 7. Isso pode ser diretamente comparado com o desenvolvimento do embrião de pintinho (estágios 4-35); no entanto, os estágios posteriores de desenvolvimento não são mais comparáveis e requerem menos tempo para o embrião de codorna³. De interesse é a ocorrência regular de ramificação microvascular semelhante à dos CAMs de frango ^4,5,6. A rápida maturação sexual, a alta produção de ovos e a reprodução de baixo custo são outros exemplos que favorecem o uso desse modelo experimental⁷.

Um modelo de MAC aviário é frequentemente utilizado em estudos de terapia fotodinâmica (TFD)⁸. A TFD é usada para tratar várias formas de câncer (pequenos tumores localizados) e outras doenças não oncológicas. Seu princípio está na entrega de um fármaco fluorescente, um fotossensibilizador (PS), ao tecido danificado e sua ativação com luz do comprimento de onda apropriado. Uma PS prospectiva utilizada em pesquisa é a hipericina, originalmente isolada da erva medicinal de São João (Hypericum perforatum)⁹. Os fortes efeitos fotossensibilizantes deste composto são baseados em suas propriedades fotoquímicas e fotofísicas. Estes são caracterizados por múltiplos picos de excitação por fluorescência na faixa de 400-600 nm, que induzem a emissão de fluorescência a cerca de 600 nm. Os máximos de absorção de hipericina dentro da banda espectral estão na faixa de 540-590 nm, e os máximos de fluorescência estão na faixa de 590-640 nm⁹. Para alcançar esses efeitos fotossensibilizantes, a hipericina é excitada pela luz do laser a um comprimento de onda de 405 nm após a administração local¹⁰. Na presença de luz, a hipericina pode apresentar efeitos virucidados, antiproliferativos e citotóxicos¹¹, enquanto não há toxicidade sistêmica e é rapidamente liberada do organismo. A hipericina é uma substância lipofílica que forma agregados não fluorescentes insolúveis em água, razão pela qual vários tipos de nanocarreadores, como nanopartículas poliméricas^12,13 ou lipoproteínas de alta e baixa densidade (HDL, LDL)^14,15, são utilizados para auxiliar sua entrega e penetração nas células. Como a CAM é um sistema naturalmente imunodeficiente, as células tumorais podem ser implantadas diretamente na superfície da membrana. O modelo também é adequado para registrar a extensão do dano vascular induzido por TFD de acordo com um escore definido^16,17. Luz de menor intensidade em comparação com a TFD pode ser utilizada para o diagnóstico fotodinâmico (TGD). O monitoramento do tecido sob excitação violeta da luz LED também leva à fotoativação de fotossensibilizadores^18,19,20 que resulta em uma emissão de luz fluorescente^, mas não fornece energia suficiente para iniciar uma reação PDT e danificar as células. Torna-se uma boa ferramenta para visualização e diagnóstico de tumores ou monitoramento da farmacocinética dos PSs utilizados^14,15.

Este artigo descreve a preparação do ensaio de codorna ex ovo CAM com taxas de sobrevivência superiores a 80%. Esta cultura ex ovo foi aplicada com sucesso em um grande número de experimentos.

Protocolo

A pesquisa foi realizada em conformidade com as diretrizes institucionais. Todos os equipamentos e reagentes devem ser autoclavados ou esterilizados com etanol a 70% ou luz UV.

1. Incubação de ovos

1. Armazenar ovos de codorna fertilizados a 10-15 °C por um máximo de 4-5 dias antes de iniciar a incubação. Use apenas ovos limpos e não danificados.
2. Incube os ovos em uma incubadora de tração forçada por ~ 53-54 h. Coloque os ovos horizontalmente com a rotação do ovo desligada, a 50%-60% de umidade e temperatura de incubação de 37,5 °C.

2. Preparação ex ovocultura

NOTA: Após a incubação inicial, os ovos são adequados para iniciar o cultivo ex ovo.

1. Desinfete a superfície do ovo com etanol a 70%, sem girar o ovo.
2. Em um armário de fluxo laminar estéril, abra a casca do ovo usando uma pequena tesoura cirúrgica estéril e transfira o conteúdo para uma placa de cultura de 6 poços. Se feito corretamente, o embrião ficará em cima de uma gema não danificada. Após cada ovo, desinfete a tesoura com etanol a 70%.
3. Adicione aproximadamente 5 mL de água estéril às lacunas na placa de 6 poços, pois a umidade é essencial para evitar que o CAM seque.
4. Coloque os embriões em uma incubadora até novos experimentos, mantendo uma temperatura de 37 °C e 80%-90% de umidade.
5. Quando o CAM estiver totalmente desenvolvido (a partir de ED7), coloque um anel de silicone esterilizado (6 mm de diâmetro e aproximadamente 1,5 mm de espessura) na superfície do CAM, ao longo dos pequenos capilares. Evite os principais vasos sanguíneos ao colocar o anel.
   NOTA: O anel define o espaço de trabalho, ajuda a marcar o local de aplicação da substância e impede que o conteúdo do líquido vaze.
6. Encerrar o cultivo dos embriões de acordo com a legislação do país.
7. É importante ressaltar que use luvas ou mantenha as mãos desinfetadas com etanol a 70% durante o trabalho. Aspirar embriões inadequadamente inclinados ou ovos não fertilizados com um aspirador a vácuo.

Figura 1: Preparação ex ovocultura . A) Ovos de codorna japonesa tal como são armazenados e incubados. (B) Desinfecção da superfície do ovo com etanol. (C) A casca do ovo é cortada com uma tesoura. (D) O conteúdo do ovo é esvaziado no poço. (E) Embrião de 3 dias de idade devidamente preparado, com vasculatura CAM em desenvolvimento. (F) Placas de cultura armazenadas em incubadora. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Placa de cultura de 6 poços com embriões e anéis de silicone colocados no topo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

3. Inoculação de células tumorais

NOTA: Todos os procedimentos requerem o uso de um gabinete de fluxo laminar estéril.

1. Cultivar diferentes tipos de células aderentes em frascos de acordo com os respectivos protocolos de cultura.
   1. Retirar o meio velho dos frascos e enxaguar a camada celular com solução salina estéril tamponada com fosfato (PBS) para remover vestígios do meio.
   2. Após a tripsinização, inibir a tripsina adicionando o meio de cultura e colher as células em tubos de centrífuga. Centrifugar as células e ressuspender o pellet celular em um meio de cultura fresco. Conte as células e ressuscite-as em um meio de cultura celular na concentração desejada.
      NOTA: Também é possível produzir culturas de células 3D, ou seja, esferoides utilizando, por exemplo, o método da queda suspensa²¹.
2. Implante 1 x 10 5-1 x 10⁶ células tumorais ou^5-15 esferoides (por CAM) em 30 μL de solução de meio celular no anel de silicone no topo do CAM.
   NOTA: O volume depende do tamanho do anel de silicone utilizado. Se um anel de silicone com um diâmetro maior é usado, um volume maior é necessário para cobrir toda a área. Dependendo do tipo de célula, ou para diferentes tipos de experimentos, várias concentrações celulares podem ser usadas. Às vezes, a raspagem fina de CAM é usada para melhorar a adesão das células incorporadas.
3. Devolver os CAMs com células inoculadas à incubadora (37 °C e 80%-90% de umidade).

Figura 3: Inoculação da MAC com tumores . (A) Aspiração de esferoides com pipeta e (B) implantação na superfície da CAM. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

4. Aplicação do fotossensibilizador

1. Aplicação de hipericina
   1. Sob iluminação fraca, prepare uma solução-mãe de hipericina a 2 mM, dissolvendo-a em 100% de dimetilsulfóxido (DMSO). Preparar uma solução de trabalho de 79 μM de hipericina pouco antes do experimento com PBS estéril ou solução salina. Garantir que a concentração final de DMSO em todas as soluções seja sempre inferior a 0,2%, o que não afeta o desenvolvimento do embrião.
   2. Em condições estéreis, aplique um volume apropriado de solução de hipericina no anel de silicone. Um volume de 30 μL é suficiente para encher um anel com um diâmetro de 6 mm.
   3. Mantenha os embriões em uma incubadora a 37 °C e 80% a 90% de umidade. A hipericina em solução aquosa é fotoativa após sua monomerização no tecido, aproximadamente 3 h após sua aplicação no CAM.
2. Aplicação de hipericina com LDL, HDL ou nanopartículas como sistemas de transporte
   NOTA: Estes sistemas de transporte são utilizados para melhorar a penetração da hipericina nas células e estruturas celulares.
   1. Devido à fotossensibilidade, execute todas as etapas, incluindo a preparação das soluções, sob iluminação fraca e armazene as soluções no escuro.
   2. Preparar as formulações de hipericina-LDL e hipericina-HDL misturando volumes apropriados de lipoproteínas e soluções-estoque de hipericina em PBS de acordo com a referência¹⁵. A concentração de LDL ou HDL em hipericina é de 20:1¹⁵.
   3. Sintetizar nanopartículas poliméricas por polimerização catiônica viva de abertura de anel de acordo com as referências^12,13. Ajustar a concentração de hipericina em nanopartículas poliméricas com PBS para 10 μM^12,13.

5. PDD e PDT

1. Conduta PDD
   1. Em condições estéreis, aplique fotossensibilizador (hipericina, nanopartículas poliméricas carregadas de hipericina ou hipericina com portador de lipoproteínas) na superfície da CAM, com ou sem células tumorais (DE 7-9).
   2. Iluminar o CAM usando luz de excitação violeta (luz LED circular personalizada de comprimento de onda de 405 nm) e registrar a fluorescência da hipericina no tecido CAM e células tumorais com uma câmera digital em intervalos de tempo de 0, 1, 3, 5, 24 e 48 h após a administração de hipericina.
   3. Se a pesquisa exigir uma imagem da CAM em luz branca, registre a CAM antes da administração de hipericina e no final do experimento, pouco antes da fixação tecidual, pois a luz afeta a fotoativação da hipericina.
   4. Avalie a intensidade de fluorescência usando um programa de processamento e análise de imagem (por exemplo, ImageJ²²).
      1. Divida os canais de imagem RGB em imagens vermelhas, verdes e azuis separadas. Analise a imagem de intensidade vermelha em formato de 8 bits. Avalie a intensidade vermelha da área dentro do anel e aproxime-a como a fluorescência da hipericina. Obtenha gráficos de perfil de imagem inteiros (usando o plug-in Profile Plot do ImageJ) em diferentes intervalos de tempo após a administração de hipericina (ou seja, a partir de 0 h, logo após a administração, até 48 h).
2. Realizar PDT
   1. Realizar a TFD pelo menos 3 h após a aplicação de hipericina.
   2. Coloque a fibra óptica acima da superfície do CAM para que o raio laser cubra toda a área dentro do anel de silicone.
   3. Realizar irradiação in vivo (1-2 min) com uma luz laser de 405 nm a uma taxa de fluência de 285 mW/cm².
   4. Registrar CAM usando luz branca e luz fluorescente de 405 nm antes e após o tratamento fotodinâmico (24 h e 48 h).
   5. Detectar fotodanos 24 h e 48 h após PDT a partir das imagens tiradas em luz branca. Avaliar o dano vascular por um escore semiquantitativo¹⁶: 1 - sem destruição; 2 - fechamento parcial dos capilares (diâmetro ≤10 μm) sem destruição de vasos médios ou maiores (diâmetro ≥50 μm) e menores (diâmetro 10-50 μm); 3 - fechamento parcial de vasos menores com desaparecimento capilar; 4 - fechamento parcial de vasos maiores com vasos menores e desaparecimento capilar; e 5 - trombose fotográfica total com a maioria dos vasos desaparecendo.

Figura 4: Tratamento da MAC com luz laser. Esta foto foi tirada para fins ilustrativos. Para PDD ou PDT, a sala deve estar escura. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

6. Preparação do CAM para uma avaliação mais aprofundada

1. Incorporação de parafina
   1. Fixar o tecido CAM em uma placa de cultivo com paraformaldeído (PFA) a 4% em PBS por um período mínimo de 2 h e máximo durante a noite.
   2. Remova o PFA e corte cuidadosamente do CAM uma parte do tecido dentro do anel de silicone.
   3. Desidrate imediatamente o tecido CAM em séries de álcool ascendentes da seguinte forma. Coloque o tecido CAM em etanol a 70% por 3 min, solução de eosina por 2 min (para facilitar a localização do tecido no bloco de parafina), etanol a 96% por 3 x 5 min (sempre em uma nova placa de Petri) e etanol a 100% por 5 min e xileno por 2 x 10 min.
   4. Com uma espátula ou uma escova fina, transferir as amostras o mais rapidamente possível para a parafina dissolvida em placas de Petri (59 °C). Após 24 h, coloque o tecido no molde histológico, preencha-o com meio de incorporação de parafina e deixe-o solidificar na geladeira. Corte o CAM solidificado do meio de incorporação, vire-o na bandeja em 90°, preencha-o novamente com o meio de incorporação e deixe-o solidificar.
   5. Prepare seções de 5-10 μm em um micrótomo para análise histopatológica para determinar o dano induzido por TFD.
2. Preparação de seções CAM congeladas para histologia
   NOTA: Para algumas metodologias, incluindo histologia, as seções congeladas preparadas em micrótomo criostato são mais adequadas. Siga as etapas abaixo para preparar as seções CAM congeladas.
   1. Monte cuidadosamente o CAM nativo ou fixado em paraformaldeído a 4% na lâmina de vidro.
   2. Encha o molde de incorporação até a metade com composto de temperatura de corte ideal (OCT) e congele em nitrogênio líquido ou uma mistura de gelo seco e etanol.
   3. Após o congelamento, incline e deslize cuidadosamente o CAM da lâmina de vidro para a parte superior do meio OCT congelado. Colocar novamente no molde, cobrir com o meio OCT e congelar como na Etapa 6.2.2.
3. Análise fractal da CAM de codornas
   NOTA: As alterações de vasculatura causadas pela TFD podem ser avaliadas pelo cálculo do coeficiente de dimensão fractal¹⁹.
   1. No gabinete de fluxo laminar, transbordar CAM em uma placa de cultivo com uma solução de fixação pré-aquecida (37 °C) de paraformaldeído a 4% e glutaraldeído a 2% em PBS.
   2. Retirar a solução de fixação após 48 h. Separe cuidadosamente o CAM do embrião com microtesouras e uma escova fina e lave-o em PBS.
   3. Monte o CAM lavado em uma lâmina de vidro e deixe secar lentamente.
   4. Fotografe o slide usando uma câmera digital e um transiluminador como fonte de luz branca homogênea.
   5. Processe imagens digitais usando o software ImageJ²². Para a análise, selecione uma região quadrada (512 × 512 pixels) da área com ramos arteriais distais. Binarize e esqueletizar as imagens e calcular o coeficiente de dimensão fractal (Df) seguindo os procedimentos descritos na referência³¹.
4. Análise molecular do tecido CAM
   1. Para análise molecular, separe cuidadosamente o CAM nativo, congele em nitrogênio líquido e armazene a -80 °C.
   2. Determinar a expressão gênica de acordo com protocolos padrão para isolamento de RNA²³, transcrição reversa em cDNA e PCR quantitativa²⁴.

Figura 5: Tecido CAM para análise fractal. Após a TFD, o CAM é fixo, montado em uma lâmina e seco para análise fractal. A foto foi tirada em luz branca usando um transiluminador. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Resultados

A localização do tumor na superfície CAM é difícil na luz branca. Espera-se que o fotossensibilizador (aqui, hipericina) usado no PDD seja absorvido seletivamente pelo tumor e ajude a visualizar o tumor. A adição de hipericina e o uso de luz fluorescente (por exemplo, 405 nm) mostraram a posição muito bem do tumor (carcinoma espinocelular TE1) (Figura 6A). A análise histológica mostrou células tumorais vitais invadindo tecidos saudáveis. Estruturas concêntricas de células esca...

Discussão

Para um cultivo ex ovo bem-sucedido, é importante seguir o protocolo acima. Além disso, se os ovos não forem abertos com cuidado suficiente ou se houver umidade insuficiente durante o cultivo, o saco de gema gruda na casca e muitas vezes se rompe. O início de um cultivo ex ovo no momento de cerca de 60 h de incubação dos ovos garante a alta taxa de sobrevivência dos embriões, pois eles já são grandes o suficiente para sobreviver ao manuseio. Nos estágios posteriores de desenvolvimento, a CAM ...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
6-Well Cell Culture Plate	Sarstedt	83.392	Transparent polystyrene, sterile
CO2 Incubator ESCO CCL-0508	ESCO, Singapore	CCL-050B-8	CO2 cell culture incubator
cryocut Leica CM 1800	Reichert-Jung, USA
digital camera Canon EOS 6D II	Canon, Japan
diode laser 405 nm	Ocean Optics, USA
DMSO	Sigma-Aldrich	67-68-5	dimethyl sulfoxid
eosin	Sigma-Aldrich	15086-94-9
ethanol	Sigma-Aldrich	64-17-5
fine brush size 2	Faber-Castell	281802	brush for CAM separation and manipulation
glutaraldehyde	Sigma-Aldrich	111-30-8
hematoxylin	Sigma-Aldrich	517-28-2
hypericin	Sigma-Aldrich	84082-80-4
incubator Bios Midi	Bios Sedlany, Czech Republic		Forced draught incubator for initial incubation
incubator Memmert IF160	Memmert, Germany		Forced air circulation incubator for CAM incubation
Kaiser slimlite plano, LED light box	Kaiser, Germany	2453	Transilluminator
LED light 405 nm			custom made circular LED light
macro lens Canon MP- E 65 mm f/2.8	Canon, Japan
microscope Kapa 2000	Kvant, Slovakia		optical microscope
microtome Auxilab 508	Auxilab, Spain		manual rotary microtome
paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	30525-89-4
Paraplast Plus	Sigma-Aldrich	P3683	parafin medium for tissue embedding
PBS	Sigma-Aldrich	P4417	Phosphate saline buffer
scissors Castroviejo	Orimed	OR66-108	micro scissors for CAM separation
software ImageJ 1.53	public domain		image processing and analysis program
stock solution HDL	Sigma-Aldrich	437641-10MG	high density lipoproteins
stock solution LDL	Sigma-Aldrich	437644-10MG	low density lipoproteins
Tissue-Tek O.C.T. Compound	Sakura Finetek	4583	Optimal Cutting Temperature Compound 118 mL squeeze bottles