A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.
Method Article
הממברנה הכוריאלנטואית (CAM) של עובר העופות היא כלי שימושי מאוד וישים לתחומי מחקר שונים. דגם אקס אובו מיוחד של שליו יפני CAM מתאים לחקירת טיפול פוטודינמי.
הממברנה הכוריאלנטואית (CAM) של עובר עופות היא קרום דק, חוץ-עובריוני, המתפקד כאיבר נשימה ראשוני. תכונותיו הופכות אותו למודל ניסויי מצוין של in vivo לחקר אנגיוגנזה, גידול גידולים, מערכות אספקת תרופות או אבחון פוטודינמי (PDD) וטיפול פוטודינמי (PDT). יחד עם זאת, מודל זה נותן מענה לדרישה להחלפת חיות הניסוי בחלופה מתאימה. עובר מעובד לשעבר מאפשר יישום חומרים קלים, גישה, ניטור ותיעוד. הנפוץ ביותר הוא צ'יק CAM; עם זאת, מאמר זה מתאר את היתרונות של CAM שליו יפני כמודל בעלות נמוכה ותפוקה גבוהה. יתרון נוסף הוא ההתפתחות העוברית הקצרה יותר, המאפשרת תחלופה ניסיונית גבוהה יותר. ההתאמה של CAM שליו עבור PDD ו- PDT של סרטן וזיהומים מיקרוביאליים נחקרת כאן. כדוגמה, מתואר השימוש בהיפריצין פוטוסנסיטייזר בשילוב עם ליפופרוטאינים או ננו-חלקיקים כמערכת משלוח. נקבע ציון הנזק מתמונות באור לבן ושינויים בעוצמת הפלואורסצנטיות של רקמת CAM תחת אור סגול (405 ננומטר), יחד עם ניתוח של קטעים היסטולוגיים. CAM שליו הראה בבירור את ההשפעה של PDT על כלי הדם והרקמות. יתר על כן, ניתן היה לראות שינויים כמו דימום נימי, פקקת, תזה של כלי דם קטנים ודימום של כלי דם גדולים יותר. שליו יפני CAM הוא מודל מבטיח in vivo לאבחון פוטודינמי ומחקר טיפול, עם יישומים במחקרים של אנגיוגנזה של גידול, כמו גם טיפול אנטי-וסקולרי ואנטי-מיקרוביאלי.
מודל קרום העוף הכוריאלנטואי (CAM) ידוע ונמצא בשימוש נרחב בתחומי מחקר שונים. זהו איבר אקסטרה-אמבריוני עשיר בכלי הדם המספק חילופי גזים והובלת מינרלים1. בשל השקיפות והנגישות של קרום זה, כלי דם בודדים ושינויים מבניים שלהם ניתן לראות בזמן אמת2. למרות היתרונות, ל-Chick CAM יש גם כמה מגבלות (למשל, מתקני רבייה גדולים יותר, ייצור ביצים וצריכת מזון) שניתן להימנע מהן על ידי שימוש במיני עופות אחרים. בפרוטוקול זה מתואר מודל ex ovo CAM חלופי המשתמש בעובר שליו יפני (Coturnix japonica). בשל גודלו הקטן, הוא מאפשר שימוש במספר גדול בהרבה של אנשים ניסיוניים מאשר עוף CAM. יתר על כן, ההתפתחות העוברית הקצרה יותר של 16 יום של עוברי שליו היא יתרון נוסף. הכלים הגדולים הראשונים על שליו CAM מופיעים ביום עוברי (ED) 7. ניתן להשוות זאת ישירות להתפתחות עובר אפרוח (שלבים 4-35); עם זאת, השלבים המאוחרים יותר של ההתפתחות כבר אינם ברי השוואה ודורשים פחות זמן עבור עובר שליו3. מעניין הוא המופע הרגיל של הסתעפות כלי דם דומה לזה של עוף CAMs 4,5,6. התבגרות מינית מהירה, ייצור ביצים גבוה וגידול בעלות נמוכה הן דוגמאות אחרות המעדיפות את השימוש במודל ניסיוניזה 7.
מודל CAM של עופות משמש לעתים קרובות במחקרי טיפול פוטודינמי (PDT)8. PDT משמש לטיפול במספר צורות של סרטן (גידולים מקומיים קטנים) ומחלות לא אונקולוגיות אחרות. העיקרון שלה הוא בהעברת תרופה פלואורסצנטית, פוטוסנסיטייזר (PS), לרקמה הפגועה והפעלתה עם אור באורך הגל המתאים. PS פרוספקטיבי אחד המשמש במחקר הוא היפריצין, שבודד במקור מצמח המרפא וורט סנט ג'ון (Hypericum perforatum)9. ההשפעות החזקות של רגישות לאור של תרכובת זו מבוססות על תכונותיה הפוטוכימיות והפוטופיזיקליות. אלה מאופיינים במספר פסגות עירור פלואורסצנטיות בטווח של 400-600 ננומטר, הגורמות לפליטת פלואורסצנציה בכ-600 ננומטר. מקסימום הקליטה של היפריצין בתוך הפס הספקטרלי נמצא בתחום 540-590 ננומטר, ומקסימה פלואורסצנטית נמצאת בטווח 590-640 ננומטר9. כדי להשיג את ההשפעות האלה של רגישות לאור, היפריצין מתרגש מאור לייזר באורך גל של 405 ננומטר לאחר מתןמקומי 10. בנוכחות אור, hypericin יכול להפגין השפעות וירוסידליות, antiproliferative, ו cytotoxic11, בעוד אין רעילות מערכתית, והוא משתחרר במהירות מן האורגניזם. היפריצין הוא חומר ליפופילי היוצר אגרגטים בלתי מסיסים במים, שאינם פלואורסצנטיים, ולכן מספר סוגים של ננו-נשארים, כגון ננו-חלקיקים פולימריים 12,13 או ליפופרוטאינים בצפיפות גבוהה ונמוכה (HDL, LDL)14,15, משמשים כדי לסייע בהעברתו ובחדירתו לתאים. מכיוון ש-CAM היא מערכת חיסונית טבעית, ניתן להשתיל תאי גידול ישירות על פני הממברנה. המודל מתאים גם לרישום היקף הנזק הנגרם לכלי דם כתוצאה מ-PDT על פי ציוןמוגדר 16,17. אור בעוצמה נמוכה יותר בהשוואה ל-PDT יכול לשמש לאבחון פוטודינמי (PDD). ניטור הרקמה תחת עירור סגול נורית LED מוביל גם לפוטואקטיבציה של פוטו-סנסיטייזרים18,19,20 שמביאה לפליטת אור פלואורסצנטי, אך היא אינה מספקת מספיק אנרגיה כדי להתחיל תגובת PDT ולפגוע בתאים. זה עושה את זה כלי טוב עבור הדמיה של הגידול ואבחון או ניטור הפרמקוקינטיקה של PSsמשומש 14,15.
מאמר זה מתאר את ההכנה של שליו ex ovo CAM מבחן עם שיעורי הישרדות מעל 80%. תרבות אובו לשעבר זו יושמה בהצלחה במספר רב של ניסויים.
המחקר בוצע בהתאם להנחיות המוסדיות. כל הציוד והריאגנטים חייבים להיות אוטומטיים או מעוקרים עם 70% אתנול או אור UV.
1. דגירה של ביצים
2. הכנת תרבות אובו לשעבר
הערה: לאחר הדגירה הראשונית, הביצים מתאימות להתחלת טיפוח האקס-אובו .
איור 1: הכנה לתרבית אובו לשעבר . (A) ביצי שליו יפניות כפי שהן מאוחסנות ודוגרות. (B) חיטוי פני הביצה באתנול. (C) קליפת הביצה נחתכת במספריים. (D) תכולת הביצית מתרוקנת לתוך הבאר. (E) עובר בן 3 ימים מוכן כראוי, עם התפתחות כלי דם CAM. (F) לוחות תרבית המאוחסנים באינקובטור. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 2: צלחת תרבית בת 6 בארות עם עוברים וטבעות סיליקון מונחים מעל. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
3. חיסון תאי הגידול
הערה: כל ההליכים דורשים שימוש בארון זרימה למינרית סטרילי.
איור 3: חיסון CAM עם גידולים . (A) שאיפה של ספרואידים עם פיפטה, ו-(B) השתלה על משטח ה-CAM. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
4. יישום של פוטוסנסיטייזר
5. PDD ו-PDT
איור 4: טיפול ב-CAM באמצעות אור לייזר. תמונה זו צולמה לצורך המחשה. עבור PDD או PDT, החדר חייב להיות חשוך. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
6. הכנת CAM להערכה נוספת
איור 5: רקמת CAM לניתוח פרקטלי. לאחר PDT, CAM קבוע, מותקן על מגלשה, מיובש לניתוח פרקטלי. התמונה צולמה באור לבן באמצעות טרנס-אילומינטור. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
לוקליזציה של הגידול על פני השטח CAM קשה באור לבן. פוטוסנסיטייזר (כאן, היפריצין) המשמש ב- PDD צפוי להיקלט באופן סלקטיבי על ידי הגידול ומסייע לדמיין את הגידול. תוספת של היפריצין והשימוש באור פלואורסצנטי (למשל, 405 ננומטר) הראו את מיקום הגידול (קרצינומה של תאי קשקש TE1) בצורה טובה מאוד (איו?...
לטיפוח מוצלח של ex ovo , חשוב לעקוב אחר הפרוטוקול לעיל. יתר על כן, אם הביצים לא נפתחות בזהירות מספקת או שאין לחות מספקת במהלך הטיפוח, שק החלמון נדבק לקליפה ולעתים קרובות נקרע. תחילתו של גידול אובו לשעבר בזמן של כ -60 שעות של דגירה ביצה מבטיחה את שיעור ההישרדות הגבוה של העוברים, שכן הם כב?...
למחברים אין ניגודי עניינים.
העבודה נתמכה על ידי VEGA 2/0042/21 ו- APVV 20-0129. תרומתו של V. Huntošová היא תוצאה של יישום הפרויקט: קהילה מדעית פתוחה למחקר בינתחומי מודרני ברפואה (ראשי תיבות: OPENMED), ITMS2014+: 313011V455 הנתמכת על ידי התשתית המשולבת של התוכנית התפעולית, במימון ERDF.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
6-Well Cell Culture Plate | Sarstedt | 83.392 | Transparent polystyrene, sterile |
CO2 Incubator ESCO CCL-0508 | ESCO, Singapore | CCL-050B-8 | CO2 cell culture incubator |
cryocut Leica CM 1800 | Reichert-Jung, USA | ||
digital camera Canon EOS 6D II | Canon, Japan | ||
diode laser 405 nm | Ocean Optics, USA | ||
DMSO | Sigma-Aldrich | 67-68-5 | dimethyl sulfoxid |
eosin | Sigma-Aldrich | 15086-94-9 | |
ethanol | Sigma-Aldrich | 64-17-5 | |
fine brush size 2 | Faber-Castell | 281802 | brush for CAM separation and manipulation |
glutaraldehyde | Sigma-Aldrich | 111-30-8 | |
hematoxylin | Sigma-Aldrich | 517-28-2 | |
hypericin | Sigma-Aldrich | 84082-80-4 | |
incubator Bios Midi | Bios Sedl![]() | Forced draught incubator for initial incubation | |
incubator Memmert IF160 | Memmert, Germany | Forced air circulation incubator for CAM incubation | |
Kaiser slimlite plano, LED light box | Kaiser, Germany | 2453 | Transilluminator |
LED light 405 nm | custom made circular LED light | ||
macro lens Canon MP- E 65 mm f/2.8 | Canon, Japan | ||
microscope Kapa 2000 | Kvant, Slovakia | optical microscope | |
microtome Auxilab 508 | Auxilab, Spain | manual rotary microtome | |
paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 30525-89-4 | |
Paraplast Plus | Sigma-Aldrich | P3683 | parafin medium for tissue embedding |
PBS | Sigma-Aldrich | P4417 | Phosphate saline buffer |
scissors Castroviejo | Orimed | OR66-108 | micro scissors for CAM separation |
software ImageJ 1.53 | public domain | image processing and analysis program | |
stock solution HDL | Sigma-Aldrich | 437641-10MG | high density lipoproteins |
stock solution LDL | Sigma-Aldrich | 437644-10MG | low density lipoproteins |
Tissue-Tek O.C.T. Compound | Sakura Finetek | 4583 | Optimal Cutting Temperature Compound 118 mL squeeze bottles |
Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article
Request PermissionThis article has been published
Video Coming Soon
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved