干式大孔海藻酸盐支架的制备和使用用于T细胞的病毒转导

摘要

本文是用于创建干燥的大孔藻酸盐支架的方案，该支架介导有效的病毒基因转移，用于T细胞的基因工程，包括用于CAR-T细胞治疗的T细胞。支架被证明以>85%的转导转导活化的原代T细胞。

摘要

在过去几年中，用于CAR-T细胞治疗的T细胞基因工程已成为癌症治疗的最前沿。CAR-T细胞是通过病毒基因转移到T细胞中产生的。目前病毒基因转移的黄金标准涉及再连蛋白包被板的棘刺，这既昂贵又耗时。非常需要高效且具有成本效益的方法来生成CAR-T细胞。这里描述的是一种制造廉价、干燥的大孔海藻酸盐支架的方法，称为 Drydux 支架，可有效促进活化 T 细胞的病毒转导。支架设计用于代替接种病毒的再连蛋白包被板的金标准棘刺，并简化转导细胞的过程。海藻酸盐与钙-D-葡萄糖酸盐交联并冷冻过夜以产生支架。将冷冻支架在冻干机中冷冻干燥72小时，以完成干燥的大孔支架的形成。当病毒和活化的T细胞一起接种在支架顶部以产生转基因细胞时，支架介导病毒基因转移。支架产生>85%的原代T细胞转导，这与棘皮膜在Retronectin包被的板上的转导效率相当。这些结果表明，干式大孔海藻酸盐支架是传统转导方法的更便宜、更方便的替代方案。

引言

免疫疗法已成为一种革命性的癌症治疗范例，因为它能够特异性靶向肿瘤、限制脱靶细胞毒性和预防复发。特别是嵌合抗原受体T（CAR-T）细胞疗法因其在治疗淋巴瘤和白血病方面的成功而广受欢迎。FDA于2017年批准了第一种CAR-T细胞疗法，此后又批准了四种CAR-T细胞疗法¹，²，³，^4，5。CAR 具有抗原识别结构域，通常由单克隆抗体的单链可变片段组成，该片段对肿瘤相关抗原^3，4 具有特异性。当CAR与其肿瘤相关抗原相互作用时，CAR-T细胞被激活，导致涉及细胞因子释放，细胞溶解脱颗粒，转录因子表达和T细胞增殖的抗肿瘤反应。为了产生CAR-T细胞，从患者身上收集血液以获得他们的T细胞。CAR是使用病毒遗传添加到患者的T细胞中的。CAR-T细胞在体外生长并输回患者^体内2，³，^4，

研究方案

所有涉及人类原代细胞和逆转录病毒载体的程序均符合北卡罗来纳州立大学的生物安全指南，并得到环境健康与安全办公室的批准。人外周血单核细胞是从商业来源购买的血沉棕黄层。原代人类细胞必须从人血沉棕黄层部分中分离出来，并需要生物安全2级许可和详细的标准操作程序以及工作所在机构的批准。病毒载体，包括用于如前所述制备的转导的逆转录病毒载体上清液¹⁹，可根据编码的蛋白质分为生物安全1级或生物安全2级，并需要相关机构生物安全委员会的批准。

1.制作大孔海藻酸盐支架

1. 通过在烧杯中向D葡萄糖酸钙中加入无菌过滤的去离子水，制备0.4%（每体积重量）葡萄糖酸钙的储备溶液。中速搅拌直至葡萄糖酸钙溶解（~1.5小时），无菌过滤，并在室温下储存。
   注意：没有必要检查溶液的pH值。
2. 在螺旋盖小瓶或烧杯中制备2%（每体积重量）藻酸盐的溶液。小心地将超纯海藻酸盐添加到容器中，并向海藻酸盐中加入无菌过滤的去离子水。选择不会妨碍混合的最大搅拌棒并将其添加到容器中。
   注意：有关用于此协议的超纯藻酸盐类型的信息可以在材料表和Novamatrix网站²⁰上找到。没有为这些支架探索不同的藻酸盐，因为它们可能导致支架9，¹⁰

结果

这些大孔藻酸盐支架易于制作，应以多孔、蓬松和白色圆盘的形式从冻干机中出来。虽然没有在这个实验中研究，但海藻酸钙溶液可以铸造到不同的模具中，以创建不同形状的支架，具体取决于用户的需要^9，10。支架是静电的，可能会粘在孔板的盖子上或戴手套的手指上。 图 2 演示了脚手架完成后的外观。图中还显示了 24 孔和 48.......

讨论

CAR-T细胞疗法继续引起人们对研究和商业应用的兴趣。尽管CAR-T细胞疗法在治疗血癌方面取得了成功，但该程序的高成本限制了其使用。这里介绍的方案介绍了一种用于T细胞病毒基因转移的新方法，而无需对retronectin包被的板进行棘刺。生产干燥的大孔海藻酸盐支架来介导转导相对简单，是传统方法的合适低成本替代品。

有时，支架外观可能与图2所示不.......

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.5 M EDTA	Invitrogen	15575-038	UltraPure, pH 8.0
1x DPBS	Gibco	14190-144	No calcium chloride or magnesium chloride
3% Acetic Acid with Methylene Blue	Stemcell Technologies Inc	07060
Activated Periphreal Blood Mononuclear Cells	-	-	Fresh or frozen
Calcium-D-Gluconate	Alfa Aesar	A11649
CD28.2 Antibody	BD	555725	1 mg/mL
CD3 Antibody	Miltenyi	130-093-387	100 μg/mL
Click's Media	FUJIFILM IRVINE SCIENTIFIC MS	9195
DI Water	-	-
Glutamax	Gibco	35-050-061
HyClone FBS	Cytvia	SH3039603
HyClone RPMI 1640 Media	Cytvia	SH3009601
Penicillin-streptomycin (P/S)	Gibco	15-140-122
Peripheral Blood Mononuclear Cells	-	-	Fresh or frozen
PRONOVA UP MVG	NovaMatrix	4200101	Sodium alginate
Recombinant Human IL-15	Peprotech	200-15	5 ng/mL
Recombinant Human IL-7	Peprotech	200-07	10 ng/mL
Retrovirus	-	-	1 x 106 TU/mL