Fabricação e Uso de Andaimes Secos de Alginato Macroporoso para Transdução Viral de Células T

Resumo

Aqui está um protocolo para a criação de andaimes de alginato macroporoso secos que medeiam a transferência eficiente de genes virais para uso em engenharia genética de células T, incluindo células T para terapia com células CAR-T. Os andaimes demonstraram transduzir células T primárias ativadas com transdução de >85%.

Resumo

A engenharia genética de células T para terapia com células CAR-T chegou à vanguarda do tratamento do câncer nos últimos anos. As células CAR-T são produzidas pela transferência de genes virais para as células T. O atual padrão-ouro de transferência de genes virais envolve a espinoculação de placas revestidas de retronectina, o que é caro e demorado. Há uma necessidade significativa de métodos eficientes e econômicos para gerar células CAR-T. Descrito aqui é um método para a fabricação de andaimes de alginato macroporosos secos e baratos, conhecidos como andaimes Drydux, que promovem eficientemente a transdução viral de células T ativadas. Os andaimes são projetados para serem usados no lugar da espinoculação padrão-ouro de placas revestidas de retronectina semeadas com vírus e simplificam o processo de transdução de células. O alginato é reticulado com cálcio-D-gluconato e congelado durante a noite para criar os andaimes. Os andaimes congelados são liofilizados em um liofilizador por 72 h para completar a formação dos andaimes macroporosos secos. Os andaimes mediam a transferência de genes virais quando o vírus e as células T ativadas são semeados juntos no topo do andaime para produzir células geneticamente modificadas. Os andaimes produzem >85% de transdução primária de células T, o que é comparável à eficiência de transdução da espinoculação em placas revestidas de retronectina. Estes resultados demonstram que os andaimes de alginato macroporoso secos servem como uma alternativa mais barata e conveniente ao método de transdução convencional.

Introdução

A imunoterapia emergiu como um paradigma revolucionário de tratamento do câncer devido à sua capacidade de atingir especificamente tumores, limitar a citotoxicidade fora do alvo e prevenir a recaída. Particularmente, a terapia celular com receptor de antígeno quimérico T (CAR-T) ganhou popularidade devido ao seu sucesso no tratamento de linfomas e leucemias. A FDA aprovou a primeira terapia com células CAR-T em 2017 e, desde então, aprovou mais quatro terapias com células CAR-T 1,2,3,4,5. Os CARs têm um domínio de reconhecimento de antígeno geralmente consistindo de um fragmento variável de cadeia única de um anticorpo monoclonal que é específico para um antígeno associado ao tumor ^3,4. Quando um CAR interage com seu antígeno associado ao tumor, as células CAR-T são ativadas, levando a uma resposta antitumoral envolvendo liberação de citocinas, degranulação citolítica, expressão do fator de transcrição e proliferação de células T. Para produzir células CAR-T, o sangue é coletado do paciente para obter suas células T. Os CARs são geneticamente adicionados às células T do paciente usando um vírus. As células CAR-T são cultivadas in vitro e infundidas de volta no paciente 2,3,4,6. A geração bem-sucedida de células CAR-T é determinada pela eficiência de transdução, que descreve o número de células T que são geneticamente modificadas em células CAR-T.

Atualmente, o padrão-ouro para a geração de células CAR-T é a espinoculação de células T ativadas e vírus em placas revestidas de retronectina ^7,8. A transdução começa quando as partículas virais se envolvem com a superfície das células T. A retronectina promove a colocalização de vírus e células, aumentando a eficiência de ligação entre as partículas virais e as células, aumentando a transdução ^7,8. A retronectina não funciona bem por si só e precisa ser acompanhada de espinoculação, o que aumenta a transferência gênica, concentrando as partículas virais e aumentando a permeabilidade superficial da célula T, permitindo uma infecção viral mais fácil⁸. Apesar do sucesso da espinoculação em placas revestidas de retronectina, é um processo complexo que requer múltiplos ciclos de rotação e reagentes caros. Portanto, métodos alternativos para a transferência de genes virais que são mais rápidos e mais baratos são altamente desejáveis.

O alginato é um polissacarídeo aniônico natural amplamente utilizado na indústria biomédica devido ao seu baixo custo, bom perfil de segurança e capacidade de formar hidrogéis após a mistura com cátions divalentes 9,10,11,12. O alginato é um polímero compatível com GMP e é geralmente reconhecido como seguro (GRAS) pela FDA¹³. A reticulação do alginato com cátions cria hidrogéis estáveis frequentemente utilizados na cicatrização de feridas, na entrega de pequenas drogas químicas e proteínas e no transporte celular ^{9,10,11,12,14,15,16}. Devido às suas excelentes propriedades gelificantes, o alginato é o material preferido para criar andaimes porosos por liofilização^10,17. Essas características do alginato o tornam um candidato atraente para a produção de um andaime que pode mediar a transferência de genes virais de células ativadas.

Descreve-se aqui um protocolo para a confecção de andaimes de alginato macroporoso secos, conhecidos como andaimes de Drydux, que transduziram estaticamente células T por transferência de genes virais^17,18. O processo de fabricação desses andaimes é mostrado na Figura 1. Esses andaimes eliminam a necessidade de espinoculação de placas revestidas de retronectina. Os andaimes de alginato macroporoso estimulam a interação de partículas virais e células T para permitir a transferência eficiente de genes em uma única etapa, sem afetar a funcionalidade e a viabilidade das células T modificadas¹⁷. Quando seguidos corretamente, esses andaimes de alginato macroporoso têm uma eficiência de transdução de pelo menos 80%, simplificando e encurtando o processo de transdução viral.

Figura 1: Esquema e linha do tempo do protocolo. (A) Linha do tempo para fazer os andaimes secos de alginato macroporoso. O alginato é reticulado com cálcio-D-gluconato e congelado durante a noite. Os andaimes congelados são liofilizados por 72 h para criar os andaimes Drydux. (B) Cronograma para transdução viral de células ativadas. As células ativadas e o vírus (MOI 2) são semeados no topo do andaime e incubados em meio completo suplementado com IL-7 e IL-15. Os andaimes absorvem a mistura e promovem a transferência de genes virais. O EDTA é usado para dissolver os andaimes e isolar as células transduzidas. Após a lavagem duas vezes com PBS, o pellet celular pode ser usado para análise. Abreviaturas: PBS = solução salina tamponada com fosfato; PBMCs = células mononucleares do sangue periférico. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Protocolo

Todos os procedimentos envolvendo células de primazia humana e vetores retrovirais foram realizados em conformidade com as diretrizes de Segurança Biológica da Universidade Estadual da Carolina do Norte e aprovados pelo Escritório de Saúde e Segurança Ambiental. As células mononucleares do sangue periférico humano foram compradas como casacos de buffy de fontes comerciais. As células humanas primárias devem ser isoladas de frações de pelagem humana e requerem autorização de nível 2 de biossegurança e procedimentos operacionais padrão detalhados e aprovação da instituição onde o trabalho deve ocorrer. Os vetores virais, incluindo os sobrenadantes vetoriais retrovirais utilizados para a transdução preparada conforme descrito anteriormente¹⁹, podem ser classificados como Nível de Biossegurança 1 ou Nível de Biossegurança 2, dependendo da proteína codificada e requerem aprovação do comitê de biossegurança institucional relevante.

1. Fazendo os andaimes de alginato macroporoso

1. Preparar uma solução-mãe de gluconato D de cálcio a 0,4% (peso por volume) adicionando água desionizada filtrada estéril ao gluconato de cálcio D num copo. Mexa em velocidade média até que o gluconato de cálcio tenha se dissolvido (~1,5 h), filtro estéril e armazenar à temperatura ambiente.
   NOTA: Não é necessário verificar o pH da solução.
2. Prepare uma solução de alginato a 2% (peso por volume) num frasco para injetáveis ou copo de tampa de rosca. Adicione cuidadosamente o alginato ultrapuro ao recipiente e adicione água deionizada filtrada estéril ao alginato. Escolha a maior barra de agitação possível que não impeça a mistura e adicione-a ao recipiente.
   NOTA: Informações sobre o tipo de alginato ultrapuro utilizado para este protocolo podem ser encontradas na Tabela de Materiais e no site da Novamatrix²⁰. Diferentes alginatos não foram explorados para esses andaimes, pois podem levar a mudanças indesejadas na porosidade e biocompatibilidade dos andaimes 9,10,11.
3. Mexa a solução a alta velocidade até que o alginato se dissolva (~1 h). Se houver grandes aglomerados nas laterais do vaso, incline o vaso para desalojá-los. Pequenas quantidades de alginato nos lados se dissolverão durante a agitação e não são motivo de preocupação.
   NOTA: Não é necessário verificar o pH da solução.
4. Quando o alginato se dissolver, reduza a velocidade de agitação, adicione lentamente um volume igual de gluconato D de cálcio a 0,4% à solução de alginato para evitar a formação de aglomerados de reticulação e mexa vigorosamente por 15 min.
5. Incline o copo ou o frasco para injetáveis para os lados para remover quaisquer aglomerados que possam ter se formado.
   NOTA: Recomenda-se usar um homogeneizador. A solução final deve ser opticamente clara.
6. Pipetar o volume desejado da solução para cada poço de uma placa de 48 poços ou de 24 poços. Use 300 μL/poço para uma placa de 48 poços e 1 mL/poço para uma placa de 24 poços. Lance devagar e mude as pontas com frequência, pois a solução será viscosa e grudará na ponta.
7. Cobrir as placas com tampas e congelar durante a noite a -20 °C.
8. Prepare a placa para o liofilizador, removendo a tampa e prendendo o topo com lenços umedecidos e elásticos. Colocar as placas em frascos de liofilizador de 750 mL a 2.000 mL e colocar no liofilizador por 72 h.
9. Após 72 h, retire a placa do liofilizador e substitua a tampa. Selar a placa e conservar a 4 °C. Para armazenamento a longo prazo, sele a vácuo a placa antes de armazenar a 4 °C. Mantenha seco até que seja necessário.
   NOTA: Faça uma solução extra de cálcio-alginato devido a erro de volume (alguns aderem às paredes do frasco para injetáveis, pontas de pipeta). Por exemplo, para fazer quatro andaimes em uma placa de 24 poços, são necessários 4 mL de solução combinada (2 mL de alginato + 2 mL de gluconato de cálcio D), mas recomenda-se preparar 2,5 mL de solução de alginato a 2% e 2,5 mL de solução de gluconato D de cálcio a 0,4%.

2. Transdução

1. Concentração de sobrenadante viral utilizando filtros de 100 kDa
   1. Hidrate o filtro centrífugo por 2 min com 1 mL de solução salina tamponada com fosfato (PBS) 1x. Descartar o PBS.
   2. Concentrar a suspensão viral adicionando 2 mL de suspensão viral (1 × 10⁶ TU/mL) e centrifugando-a através do filtro centrífugo a 1.500 × g por 10 min em um rotor de caçamba oscilante.
      NOTA: Um a duzentos microlitros de vírus concentrado é necessário por andaime.
   3. Gire por alguns minutos adicionais se o volume concentrado de suspensão do vírus for maior que 200 μL.
   4. Repita as etapas 2.1.1-2.1.3 para cada andaime.
      NOTA: É igualmente aceitável concentrar uma grande unidade populacional de vírus e retirar alíquotas de 100-200 μL da unidade populacional concentrada.
2. Células ativadas por sementes e vírus juntos.
   1. Para cada andaime, preparar uma alíquota suspendendo 1 × 10⁶ células mononucleares ativadas do sangue periférico (PBMCs) em 50 μL de meio de cultura celular completo (250 mL de meio de clique + 250 mL de RPMI 1640 meios + 50 mL de soro fetal bovino + 5 mL de substituto de glutamina + 5 mL de penicilina/estreptomicina).
      Observação : consulte Arquivo suplementar 1 para obter um protocolo sobre como ativar PBMCs.
   2. Adicione o sobrenadante viral concentrado (~2 × 10⁶ TU, MOI 2) à suspensão celular. O volume total da suspensão do vírus celular não deve exceder 200 μL para um andaime de 48 poços ou 350 μL para um andaime de 24 poços.
   3. Adicione a mistura célula-vírus gota a gota na parte superior do andaime seco. Para experimentos de controle negativo, use meios de cultura celular completos no lugar do vírus concentrado. Adicione a suspensão da célula à parte superior do andaime seco.
   4. Repita as etapas 2.2.1-2.2.3 para cada andaime.
   5. Incubar os andaimes numa incubadora de cultura celular a 37 °C durante 45-60 min. Remova os andaimes da incubadora; os andaimes absorverão totalmente a solução durante este tempo.
   6. Para induzir a proliferação, adicionar meios de cultura celular completos suplementados com IL-15 (5 ng/mL) e IL-7 (10 ng/mL) a cada poço; IL-2 também pode ser usado. Adicione 500 μL a cada andaime de 48 poços ou 1 mL a cada andaime de 24 poços.
   7. Incubar os andaimes a 37 °C durante 72 h. À medida que as células proliferam, a mídia se tornará laranja.
3. Isole as células dos andaimes para análise.
   1. Diluir 0,5 M EDTA a 0,25 M EDTA em 1x PBS.
   2. Remova o excesso de meio de cada poço e colete em tubos de centrífuga separados de 15 mL.
   3. Para isolar as células do andaime, adicione 0,25 M EDTA a cada andaime. Adicione 300 μL a andaimes de 48 poços ou 1 mL a andaimes de 24 poços. Deixe a placa descansar ou agitar suavemente por 3-4 min.
   4. Uma vez que o andaime esteja praticamente dissolvido, pipete para dentro e para fora suavemente dentro do poço. Algumas etapas de pipetagem de entrada e saída podem ser necessárias para dissolver completamente o andaime. Se não se dissolver em 10 min, adicione mais 200 μL de 0,25 M EDTA.
   5. Uma vez que o andaime se dissolva completamente, transfira a solução para um tubo de centrífuga de 15 mL.
   6. Repita as etapas 2.3.4 e 2.3.5 para cada andaime.
   7. Lavar as células duas vezes adicionando 12 mL de PBS a cada tubo de centrífuga e centrifugando a 400 × g por 5 min. Um pellet de célula se formará na parte inferior de cada tubo. Aspirar o sobrenadante e repetir a lavagem. Tenha o cuidado de aspirar totalmente o sobrenadante a cada lavagem, pois é crucial remover todo o EDTA.
   8. Após a segunda lavagem com PBS, o pellet celular está agora pronto para análise. Siga o protocolo apropriado necessário para a análise.

Resultados

Esses andaimes de alginato macroporoso são fáceis de fazer e devem sair do liofilizador como discos porosos, macios e brancos. Embora não estudada neste experimento, a solução de alginato de cálcio pode ser fundida em diferentes moldes para criar andaimes de formas variadas, dependendo das necessidades do usuário ^9,10. Os andaimes são eletrostáticos e podem aderir à tampa da placa do poço ou a um dedo enluvado. A Figura 2 ...

Discussão

A terapia celular CAR-T continua a ganhar interesse tanto para pesquisas quanto para aplicações comerciais. Apesar do sucesso que a terapia com células CAR-T teve no tratamento de cânceres no sangue, o alto custo do procedimento limita seu uso. O protocolo aqui apresentado introduz um novo método para a transferência de genes virais de células T sem a necessidade de espinoculação de placas revestidas de retronectina. A produção de andaimes de alginato macroporoso secos para mediar a transdução é relativamen...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.5 M EDTA	Invitrogen	15575-038	UltraPure, pH 8.0
1x DPBS	Gibco	14190-144	No calcium chloride or magnesium chloride
3% Acetic Acid with Methylene Blue	Stemcell Technologies Inc	07060
Activated Periphreal Blood Mononuclear Cells	-	-	Fresh or frozen
Calcium-D-Gluconate	Alfa Aesar	A11649
CD28.2 Antibody	BD	555725	1 mg/mL
CD3 Antibody	Miltenyi	130-093-387	100 μg/mL
Click's Media	FUJIFILM IRVINE SCIENTIFIC MS	9195
DI Water	-	-
Glutamax	Gibco	35-050-061
HyClone FBS	Cytvia	SH3039603
HyClone RPMI 1640 Media	Cytvia	SH3009601
Penicillin-streptomycin (P/S)	Gibco	15-140-122
Peripheral Blood Mononuclear Cells	-	-	Fresh or frozen
PRONOVA UP MVG	NovaMatrix	4200101	Sodium alginate
Recombinant Human IL-15	Peprotech	200-15	5 ng/mL
Recombinant Human IL-7	Peprotech	200-07	10 ng/mL
Retrovirus	-	-	1 x 106 TU/mL