АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Здесь представлен протокол для создания сухих макропористых альгинатных каркасов, которые опосредуют эффективный перенос вирусных генов для использования в генной инженерии Т-клеток, включая Т-клетки для терапии CAR-T-клетками. Было показано, что каркасы трансдуцируют активированные первичные Т-клетки с трансдукцией >85%.

Аннотация

Генная инженерия Т-клеток для терапии CAR-T-клетками вышла на передний план лечения рака за последние несколько лет. CAR-T-клетки продуцируются путем переноса вирусных генов в Т-клетки. Нынешний золотой стандарт переноса вирусных генов включает в себя спинокуляцию пластин с ретронектиновым покрытием, что является дорогостоящим и трудоемким. Существует значительная потребность в эффективных и экономичных методах получения CAR-T-клеток. Здесь описан метод изготовления недорогих, сухих макропористых альгинатных каркасов, известных как каркасы Drydux, которые эффективно способствуют вирусной трансдукции активированных Т-клеток. Каркасы предназначены для использования вместо золотого стандарта спинокуляции пластин с ретронектиновым покрытием, засеянных вирусом, и упрощают процесс преобразования клеток. Альгинат сшивается с кальцием-D-глюконатом и замораживается на ночь для создания каркасов. Замороженные каркасы лиофилизируют в лиофилизаторе в течение 72 ч, чтобы завершить формирование сухих макропористых каркасов. Каркасы опосредуют перенос вирусных генов, когда вирусные и активированные Т-клетки сеются вместе поверх каркаса для производства генетически модифицированных клеток. Каркасы производят >85% первичной трансдукции Т-клеток, что сопоставимо с эффективностью трансдукции спинокуляции на пластинах, покрытых ретронектином. Эти результаты демонстрируют, что сухие макропористые альгинатные каркасы служат более дешевой и удобной альтернативой традиционному методу трансдукции.

Введение

Иммунотерапия стала революционной парадигмой лечения рака из-за ее способности специфически нацеливаться на опухоли, ограничивать нецелевую цитотоксичность и предотвращать рецидив. В частности, клеточная терапия химерным антигенным рецептором Т (CAR-T) приобрела популярность благодаря ее успеху в лечении лимфом и лейкемий. FDA одобрило первую терапию CAR-T-клетками в 2017 году, и с тех пор одобрило еще четыре CAR-T клеточныетерапии 1,2,3,4,5. CARs имеют домен распознавания антигена, обычно состоящий из одного цепного переменного фрагмента моноклонального антитела, который является специфическим для опухолевого ассоциированного антигена 3,4. Когда CAR взаимодействует со своим опухолеассоциированным антигеном, CAR-T-клетки активируются, что приводит к противоопухолевому ответу, включающему высвобождение цитокинов, цитолитическую дегрануляцию, экспрессию фактора транскрипции и пролиферацию Т-клеток. Для производства CAR-T-клеток кровь собирается у пациента для получения их Т-клеток. CARs генетически добавляются к Т-клеткам пациента с помощью вируса. CAR-T-клетки выращивают in vitro и вводят обратно пациенту 2,3,4,6. Успешная генерация CAR-T-клеток определяется эффективностью трансдукции, которая описывает количество Т-клеток, которые генетически модифицированы в CAR-T-клетки.

В настоящее время золотым стандартом генерации CAR-T-клеток является спинокуляция активированных Т-клеток и вируса на пластинахс ретронектиновым покрытием 7,8. Трансдукция начинается, когда вирусные частицы взаимодействуют с поверхностью Т-клеток. Ретронектин способствует колокализации вируса и клеток за счет повышения эффективности связывания между вирусными частицами и клетками, усиливая трансдукцию 7,8. Ретронектин плохо работает сам по себе и должен сопровождаться спинокуляцией, которая усиливает перенос генов путем концентрации вирусных частиц и увеличения поверхностной проницаемости Т-клеток, что облегчает вирусную инфекцию8. Несмотря на успех спинокуляции на пластинах с ретронектиновым покрытием, это сложный процесс, который требует нескольких циклов вращения и дорогостоящих реагентов. Поэтому альтернативные методы переноса вирусных генов, которые являются более быстрыми и дешевыми, очень желательны.

Альгинат является природным анионным полисахаридом, широко используемым в биомедицинской промышленности из-за его низкой стоимости, хорошего профиля безопасности и способности образовывать гидрогели при смешивании с двухвалентными катионами 9,10,11,12. Альгинат является GMP-совместимым полимером и в целом признан безопасным (GRAS) FDA13. Сшивание альгината с катионами создает стабильные гидрогели, часто используемые для заживления ран, доставки небольших химических препаратов и белков и транспортировки клеток 9,10,11,12,14,15,16. Благодаря своим превосходным гелеобразующим свойствам, альгинат является предпочтительным материалом для создания пористых каркасов путем сублимационной сушки10,17. Эти характеристики альгината делают его привлекательным кандидатом для производства каркаса, который может опосредуть перенос вирусных генов активированных клеток.

Здесь описан протокол для создания сухих макропористых альгинатных каркасов, известных как каркасы Drydux, которые статически трансдуцируют Т-клетки путем переноса вирусных генов17,18. Процесс изготовления этих каркасов показан на рисунке 1. Эти каркасы устраняют необходимость в спинокуляции пластин с ретронектиновым покрытием. Макропористые альгинатные каркасы стимулируют взаимодействие вирусных частиц и Т-клеток, чтобы обеспечить эффективный перенос генов за один этап, не влияя на функциональность и жизнеспособность инженерных Т-клеток17. При правильном следовании эти макропористые альгинатные каркасы имеют эффективность трансдукции не менее 80%, упрощая и укорачивая процесс вирусной трансдукции.

figure-introduction-5021
Рисунок 1: Схема и временная шкала протокола. (A) Временная шкала для создания сухих макропористых альгинатных каркасов. Альгинат сшивается с кальцием-D-глюконатом и замораживается на ночь. Замороженные каркасы лиофилизируются в течение 72 ч, чтобы создать каркасы Drydux. (B) Временная шкала для вирусной трансдукции активированных клеток. Активированные клетки и вирус (MOI 2) высеивают поверх каркаса и инкубируют в полной среде, дополненной IL-7 и IL-15. Каркасы поглощают смесь и способствуют переносу вирусных генов. ЭДТА используется для растворения каркасов и изоляции трансдуцированных клеток. После двойной промывки PBS гранулу ячейки можно использовать для анализа. Сокращения: PBS = фосфатно-буферный физиологический раствор; PBMCs = мононуклеарные клетки периферической крови. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

протокол

Все процедуры с участием клеток первенства человека и ретровирусных векторов были выполнены в соответствии с руководящими принципами биологической безопасности Университета штата Северная Каролина и одобрены Управлением по охране окружающей среды и технике безопасности. Мононуклеарные клетки периферической крови человека были приобретены в качестве пухлых пальто из коммерческих источников. Первичные клетки человека должны быть выделены из фракций человеческой шерсти и требуют разрешения уровня биобезопасности 2 и подробных стандартных операционных процедур и одобрения со стороны учреждения, в котором должна проводиться работа. Вирусные векторы, включая ретровирусные векторные супернатанты, используемые для трансдукции, приготовленные, какописано ранее 19, могут быть классифицированы либо как уровень биобезопасности 1, либо как уровень биобезопасности 2 в зависимости от кодированного белка и требуют одобрения соответствующего институционального комитета по биобезопасности.

1. Изготовление макропористых альгинатных каркасов

  1. Приготовьте запасной раствор 0,4% (вес на объем) глюконата кальция D путем добавления стерильно-фильтрованной деионизированной воды к глюконату кальция D в стакане. Перемешайте на средней скорости до растворения глюконата кальция (~1,5 ч), стерильный фильтр и храните при комнатной температуре.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Нет необходимости проверять рН раствора.
  2. Приготовьте раствор 2% (массы на объем) альгината в завинчивающемся колпачке флакона или стакана. Осторожно добавьте ультрачистый альгинат в сосуд и добавьте стерильно-фильтрованную деионизированную воду в альгинат. Выберите самый большой перемешивание, который не будет препятствовать смешиванию, и добавьте его в сосуд.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Информацию о типе ультрачистого альгината, используемого для этого протокола, можно найти в Таблице материалов и на веб-сайте Novamatrix20. Различные альгинаты не были исследованы для этих каркасов, так как они могут привести к нежелательным изменениям пористости и биосовместимости каркасов 9,10,11.
  3. Перемешивайте раствор на высокой скорости до тех пор, пока альгинат не растворится (~1 ч). Если на бортах судна имеются большие скопления, наклоните судно, чтобы выбить их. Небольшие количества альгината на боках будут растворяться при перемешивании и не являются поводом для беспокойства.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Нет необходимости проверять рН раствора.
  4. Когда альгинат растворится, уменьшите скорость перемешивания, медленно добавьте равный объем 0,4% глюконата кальция D в раствор альгината, чтобы предотвратить образование сшивающихся сгустков, и энергично перемешайте в течение 15 минут.
  5. Наклоните стакан или флакон в сторону, чтобы удалить любые комочки, которые могли образоваться.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется использовать гомогенизатор. Окончательное решение должно быть оптически прозрачным.
  6. Пипетка нужного объема раствора в каждую скважину из 48-луночной плиты или 24-луночной плиты. Используйте 300 мкл/лунку для плиты с 48 лунками и 1 мл/лунку для плиты с 24 скважинами. Отливайте медленно и часто меняйте наконечники, так как раствор будет вязким и будет прилипать к кончику.
  7. Накройте пластины крышками и заморозьте на ночь при -20 °C.
  8. Подготовьте тарелку для лиофилизатора, сняв крышку и закрепив верхнюю часть салфетками и резинками. Поместите пластины в колбы лиофилайзера объемом от 750 мл до 2000 мл и поместите на лиофилизатор на 72 ч.
  9. Через 72 ч снимите пластину с лиофилизатора и замените крышку. Запечатайте пластину и храните при температуре 4 °C. Для длительного хранения вакуумная герметизация пластины перед хранением при температуре 4 °C. Держите сухим до тех пор, пока это не понадобится.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Сделайте дополнительный раствор кальция-альгината из-за погрешности объема (некоторые прилипают к стенкам флакона, кончики пипетки). Например, для изготовления четырех каркасов в 24-луночной плите требуется 4 мл комбинированного раствора (2 мл альгината + 2 мл глюконата кальция D), но рекомендуется приготовить 2,5 мл 2% раствора альгината и 2,5 мл 0,4% раствора глюконата кальция D.

2. Трансдукция

  1. Концентрация вирусного супернатанта с помощью фильтров 100 кДа
    1. Гидратируйте центробежный фильтр в течение 2 мин с 1 мл 1x фосфатно-буферного физиологического раствора (PBS). Отбросьте PBS.
    2. Концентрируют вирусную суспензию, добавляя 2 мл вирусной суспензии (1 × 106 TU/мл) и центрифугируя ее через центробежный фильтр при 1 500 × г в течение 10 мин в качающемся роторе ведра.
      ПРИМЕЧАНИЕ: На каркас необходимо от одного до двухсот микролитров концентрированного вируса.
    3. Вращайтесь в течение нескольких дополнительных минут, если объем концентрированной суспензии вируса превышает 200 мкл.
    4. Повторите шаги 2.1.1-2.1.3 для каждого каркаса.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Также допустимо концентрировать большой запас вируса и брать 100-200 мкл аликвот из концентрированного запаса.
  2. Семена активированных клеток и вируса вместе.
    1. Для каждого каркаса готовят аликвоту, суспендируя 1 × 106 активированных мононуклеарных клеток периферической крови (PBMCs) в 50 мкл полной клеточной культуральной среды (250 мл среды Click + 250 мл RPMI 1640 среды + 50 мл фетальной бычьей сыворотки + 5 мл заменителя глутамина + 5 мл пенициллина/стрептомицина).
      ПРИМЕЧАНИЕ: См. Дополнительный файл 1 для протокола о том, как активировать BBMC.
    2. Добавьте концентрированный вирусный супернатант (~2 × 106 TU, MOI 2) в клеточную суспензию. Общий объем клеточно-вирусной суспензии не должен превышать 200 мкл для 48-луночного каркаса или 350 мкл для 24-луночного каркаса.
    3. Добавьте клеточно-вирусную смесь по каплям в верхнюю часть сухого каркаса. Для экспериментов с отрицательным контролем используйте полную клеточную культуральную среду вместо концентрированного вируса. Добавьте клеточную суспензию в верхнюю часть сухого каркаса.
    4. Повторите шаги 2.2.1-2.2.3 для каждого каркаса.
    5. Инкубируют каркасы в инкубаторе клеточной культуры при 37 °C в течение 45-60 мин. Снимите каркасы из инкубатора; каркасы будут полностью впитывать раствор в течение этого времени.
    6. Чтобы индуцировать пролиферацию, добавляйте полную среду клеточного культивирования, дополненную IL-15 (5 нг/мл) и IL-7 (10 нг/мл) в каждую лунку; Также может использоваться Ил-2. Добавьте 500 мкл к каждому 48-луночному каркасу или 1 мл к каждому 24-луночному каркасу.
    7. Высиживать строительные леса при температуре 37 °C в течение 72 ч. По мере пролиферации клеток среда становится оранжевой.
  3. Изолируйте клетки из каркасов для анализа.
    1. Разбавить от 0,5 М ЭДТА до 0,25 М ЭДТА в 1x PBS.
    2. Удалите лишнюю среду из каждой лунки и соберите в отдельные трубки центрифуги объемом 15 мл.
    3. Чтобы изолировать ячейки от каркаса, добавьте 0,25 М ЭДТА к каждому каркасу. Добавьте 300 мкл к 48-луночным лесам или 1 мл к 24-луночным лесам. Дайте тарелке постоять или осторожно перемешайте в течение 3-4 мин.
    4. Как только каркас в основном растворен, пипетка осторожно входит и выходит внутрь колодца. Для полного растворения каркаса может потребоваться несколько этапов пипетки. Если он не растворяется в течение 10 мин, добавляют еще 200 мкл 0,25 М ЭДТА.
    5. Как только каркас полностью растворится, перенесите раствор в центрифужную трубку объемом 15 мл.
    6. Повторите шаги 2.3.4 и 2.3.5 для каждого каркаса.
    7. Промыть ячейки дважды, добавив 12 мл PBS в каждую трубку центрифуги и центрифугируя при 400 × г в течение 5 мин. Ячейка гранулы будет формироваться в нижней части каждой трубки. Аспирировать надосадочную утварь и повторить стирку. Будьте осторожны, чтобы полностью аспирировать супернатант с каждой стиркой, так как крайне важно удалить все ЭДТА.
    8. После второй промывки PBS гранула ячейки теперь готова к анализу. Следуйте соответствующему протоколу, необходимому для анализа.

Результаты

Эти макропористые альгинатные каркасы легко сделать и должны выходить из лиофилизатора в виде пористых, пушистых и белых дисков. Хотя раствор кальция-альгината не изучен в этом эксперименте, он может быть отлит в различные формы для создания каркасов различной формы, в зависимости от п...

Обсуждение

CAR-T-клеточная терапия продолжает вызывать интерес как для исследований, так и для коммерческих применений. Несмотря на успех CAR-T-клеточной терапии в лечении рака крови, высокая стоимость процедуры ограничивает ее использование. Представленный здесь протокол вводит новый метод перенос...

Раскрытие информации

P.A. и Y.B. являются изобретателями патентов, связанных с использованием биоматериалов для генерации CAR-T-клеточной терапии. Y.B. получает спонсируемый промышленностью исследовательский грант, связанный с терапевтической технологией CAR-T-клеток (не связанной с этой работой). Все остальные авторы заявляют, что у них нет конкурирующих интересов.

Благодарности

Эта работа была поддержана Национальными институтами здравоохранения через номера грантов R37-CA260223, R21CA246414. Мы благодарим ядро проточной цитометрии NCSU за обучение и руководство по анализу проточной цитометрии. Схемы были созданы с помощью Biorender.com

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
0.5 M EDTAInvitrogen15575-038UltraPure, pH 8.0
1x DPBSGibco14190-144No calcium chloride or magnesium chloride
3% Acetic Acid with Methylene BlueStemcell Technologies Inc07060
Activated Periphreal Blood Mononuclear Cells--Fresh or frozen
Calcium-D-GluconateAlfa AesarA11649
CD28.2 AntibodyBD5557251 mg/mL
CD3 AntibodyMiltenyi130-093-387100 μg/mL
Click's MediaFUJIFILM IRVINE SCIENTIFIC MS9195
DI Water--
GlutamaxGibco35-050-061
HyClone FBSCytviaSH3039603
HyClone RPMI 1640 MediaCytviaSH3009601
Penicillin-streptomycin (P/S)Gibco15-140-122
Peripheral Blood Mononuclear Cells--Fresh or frozen
PRONOVA UP MVGNovaMatrix4200101Sodium alginate
Recombinant Human IL-15Peprotech200-155 ng/mL
Recombinant Human IL-7Peprotech200-0710 ng/mL
Retrovirus--1 x 106 TU/mL

Ссылки

  1. Prinzing, B. L., Gottschalk, S. M., Krenciute, G. C. A. R. T-cell therapy for glioblastoma: ready for the next round of clinical testing. Expert Review of Anticancer Therapy. 18 (5), 451-461 (2018).
  2. Bagley, S. J., Desai, A. S., Linette, G. P., June, C. H., O'Rourke, D. M. CAR T-cell therapy for glioblastoma: recent clinical advances and future challenges. Neuro-oncology. 20 (11), 1429-1438 (2018).
  3. Nair, R., Westin, J. CAR T cells. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1342, 297-317 (2021).
  4. Jackson, H. J., Rafiq, S., Brentjens, R. J. Driving CAR T-cells forward. Nature Reviews. Clinical Oncology. 13 (6), 370-383 (2016).
  5. Sterner, R. C., Sterner, R. M. CAR-T cell therapy: current limitations and potential strategies. Blood Cancer Journal. 11 (4), 69 (2021).
  6. Miliotou, A. N., Papadopoulou, L. C. CAR T-cell therapy: A new era in cancer immunotherapy. Current Pharmaceutical Biotechnology. 19 (1), 5-18 (2018).
  7. Lee, H. -. J., et al. Retronectin enhances lentivirus-mediated gene delivery into hematopoietic progenitor cells. Biologicals: Journal of the International Association of Biological Standardization. 37 (4), 203-209 (2009).
  8. Rajabzadeh, A., Hamidieh, A. A., Rahbarizadeh, F. Spinoculation and retronectin highly enhance the gene transduction efficiency of Mucin-1-specific chimeric antigen receptor (CAR) in human primary T cells. BMC Molecular and Cell Biology. 22 (1), 57 (2021).
  9. Sun, J., Tan, H. Alginate-based biomaterials for regenerative medicine applications. Materials. 6 (4), 1285-1309 (2013).
  10. Nayak, A. K., Mohanta, B. C., Hasnain, M. S., Hoda, M. N., Tripathi, G. Chapter 14 - Alginate-based scaffolds for drug delivery in tissue engineering. Alginates in Drug Delivery. , 359-386 (2020).
  11. Lee, K. Y., Mooney, D. J. Alginate: properties and biomedical applications. Progress in Polymer Science. 37 (1), 106-126 (2012).
  12. Kuo, C. K., Ma, P. X. Ionically crosslinked alginate hydrogels as scaffolds for tissue engineering: part 1. Structure, gelation rate and mechanical properties. Biomaterials. 22 (6), 511-521 (2001).
  13. Soccol, C., et al. Probiotic nondairy beverages. Handbook of Plant-Based Fermented Food and Beverage Technology, Second Edition. , 707-728 (2012).
  14. Moody, C. T., et al. Restoring carboxylates on highly modified alginates improves gelation, tissue retention and systemic capture. Acta Biomaterialia. 138, 208-217 (2022).
  15. Brudno, Y., et al. Replenishable drug depot to combat post-resection cancer recurrence. Biomaterials. 178, 373-382 (2018).
  16. Moody, C. T., Palvai, S., Brudno, Y. Click cross-linking improves retention and targeting of refillable alginate depots. Acta Biomaterialia. 112, 112-121 (2020).
  17. Agarwalla, P., et al. Scaffold-mediated static transduction of T Cells for CAR-T Cell therapy. Advanced Healthcare Materials. 9 (14), 2000275 (2020).
  18. Agarwalla, P., et al. Bioinstructive implantable scaffolds for rapid in vivo manufacture and release of CAR-T cells. Nature Biotechnology. 40 (8), 1250-1258 (2022).
  19. Vera, J., et al. T lymphocytes redirected against the kappa light chain of human immunoglobulin efficiently kill mature B lymphocyte-derived malignant cells. Blood. 108 (12), 3890-3897 (2006).
  20. . PRONOVA UP MVG. IFF Nutrition Norge AS Available from: https://novamatrix.biz/store/pronova-up-mvg/ (2022)
  21. Zappasodi, R., Budhu, S., Abu-Akeel, M., Merghoub, T. In vitro assays for effector T cell functions and activity of immunomodulatory antibodies. Methods in Enzymology. 631, 43-59 (2020).
  22. Kong, B. S., Lee, C., Cho, Y. M. Protocol for the assessment of human T cell activation by real-time metabolic flux analysis. STAR Protocols. 3 (1), 101084 (2022).
  23. Bio-Rad cell activation protocols. Bio-Rad Available from: https://www.bio-rad-antibodies.com/cell-activation.html?JSESSIONID_STERLING=D6E538F76818E53C29884D6CC7334F24 (2022)
  24. Lin, H. -. R., Yeh, Y. -. J. Porous alginate/hydroxyapatite composite scaffolds for bone tissue engineering: Preparation, characterization, andin vitro studies. Journal of Biomedical Materials Research. 71 (1), 52-65 (2004).
  25. Wu, J., Zhao, Q., Sun, J., Zhou, Q. Preparation of poly(ethylene glycol) aligned porous cryogels using a unidirectional freezing technique. Soft Matter. 8 (13), 3620 (2012).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

187CAR T

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены