Fabrication et utilisation d’échafaudages d’alginate macroporeux secs pour la transduction virale des lymphocytes T

Résumé

Voici un protocole pour créer des échafaudages d’alginate macroporeux secs qui interviennent dans le transfert efficace de gènes viraux pour une utilisation dans le génie génétique des cellules T, y compris les cellules T pour la thérapie cellulaire CAR-T. Il a été démontré que les échafaudages transduisaient les lymphocytes T primaires activés avec une transduction de >85%.

Résumé

Le génie génétique des lymphocytes T pour la thérapie cellulaire CAR-T est devenu au premier plan du traitement du cancer au cours des dernières années. Les cellules CAR-T sont produites par transfert de gènes viraux dans les cellules T. L’étalon-or actuel du transfert de gènes viraux implique la spinoculation de plaques recouvertes de rétronectine, ce qui est coûteux et prend beaucoup de temps. Il existe un besoin important de méthodes efficaces et rentables pour générer des cellules CAR-T. La méthode décrite ici est une méthode de fabrication d’échafaudages d’alginate macroporeux secs et peu coûteux, connus sous le nom d’échafaudages Drydux, qui favorisent efficacement la transduction virale des cellules T activées. Les échafaudages sont conçus pour être utilisés à la place de la spinoculation de référence des plaques enrobées de rétronectine ensemencées avec des virus et simplifient le processus de transmission des cellules. L’alginate est réticulé avec du gluconate de calcium D et congelé pendant la nuit pour créer les échafaudages. Les échafaudages congelés sont lyophilisés dans un lyophilisateur pendant 72 h pour compléter la formation des échafaudages macroporeux secs. Les échafaudages servent de médiateur au transfert de gènes viraux lorsque le virus et les lymphocytes T activés sont ensemencés ensemble sur le dessus de l’échafaudage pour produire des cellules génétiquement modifiées. Les échafaudages produisent >85% de transduction primaire des lymphocytes T, ce qui est comparable à l’efficacité de transduction de la spinoculation sur des plaques recouvertes de rétronectine. Ces résultats démontrent que les échafaudages d’alginate macroporeux secs constituent une alternative moins coûteuse et plus pratique à la méthode de transduction conventionnelle.

Introduction

L’immunothérapie est devenue un paradigme révolutionnaire de traitement du cancer en raison de sa capacité à cibler spécifiquement les tumeurs, à limiter la cytotoxicité hors cible et à prévenir les rechutes. En particulier, la thérapie cellulaire à récepteur antigénique chimérique T (CAR-T) a gagné en popularité en raison de son succès dans le traitement des lymphomes et des leucémies. La FDA a approuvé la première thérapie cellulaire CAR-T en 2017 et, depuis lors, a approuvé quatre autres thérapies cellulaires CAR-T 1,2,3,4,5.

Protocole

Toutes les procédures impliquant des cellules primitives humaines et des vecteurs rétroviraux ont été effectuées conformément aux directives de sécurité biologique de l’Université d’État de Caroline du Nord et approuvées par le Bureau de la santé et de la sécurité environnementales. Des cellules mononucléées du sang périphérique humain ont été achetées sous forme de couches leucocytaires auprès de sources commerciales. Les cellules humaines primaires doivent être isolées des fractions d’enveloppe leucocytaire humaine et nécessitent une autorisation de niveau de biosécurité 2 ainsi que des procédures opérationnelles normalisées détaillées et l’approbation de l’établiss....

Résultats

Ces échafaudages d’alginate macroporeux sont faciles à fabriquer et devraient sortir du lyophilisateur sous forme de disques poreux, duveteux et blancs. Bien que non étudiée dans cette expérience, la solution d’alginate de calcium peut être coulée dans différents moules pour créer des échafaudages de formes variables, en fonction des besoins de l’utilisateur ^9,10. Les échafaudages sont électrostatiques et peuvent coller au couvercle de la plaque.......

Discussion

La thérapie cellulaire CAR-T continue de susciter de l’intérêt pour la recherche et les applications commerciales. Malgré le succès de la thérapie cellulaire CAR-T dans le traitement des cancers du sang, le coût élevé de la procédure limite son utilisation. Le protocole présenté ici introduit une nouvelle méthode pour le transfert de gènes viraux de lymphocytes T sans avoir besoin de spinoculation de plaques recouvertes de rétronectine. La production d’échafaudages d’alginate macroporeux secs pour f.......

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.5 M EDTA	Invitrogen	15575-038	UltraPure, pH 8.0
1x DPBS	Gibco	14190-144	No calcium chloride or magnesium chloride
3% Acetic Acid with Methylene Blue	Stemcell Technologies Inc	07060
Activated Periphreal Blood Mononuclear Cells	-	-	Fresh or frozen
Calcium-D-Gluconate	Alfa Aesar	A11649
CD28.2 Antibody	BD	555725	1 mg/mL
CD3 Antibody	Miltenyi	130-093-387	100 μg/mL
Click's Media	FUJIFILM IRVINE SCIENTIFIC MS	9195
DI Water	-	-
Glutamax	Gibco	35-050-061
HyClone FBS	Cytvia	SH3039603
HyClone RPMI 1640 Media	Cytvia	SH3009601
Penicillin-streptomycin (P/S)	Gibco	15-140-122
Peripheral Blood Mononuclear Cells	-	-	Fresh or frozen
PRONOVA UP MVG	NovaMatrix	4200101	Sodium alginate
Recombinant Human IL-15	Peprotech	200-15	5 ng/mL
Recombinant Human IL-7	Peprotech	200-07	10 ng/mL
Retrovirus	-	-	1 x 106 TU/mL