伯氏疏螺旋体（Borrelia）伯氏疏螺旋体外转录测定的基本成分

摘要

体外转录测定可以破译伯氏疏螺旋体的转录调控机制。该协议描述了纯化伯氏疏螺旋体RNA聚合酶并进行体外转录反应的步骤。使用体外转录测定的实验方法需要对活性RNA聚合酶进行可靠的纯化和储存。

摘要

伯氏疏螺旋体 是一种细菌病原体，代谢和基因组库有限。 伯氏双歧杆菌 在脊椎动物和蜱虫之间细胞外传播，并显着重塑其转录谱，以便在感染期间在不同的环境中存活。 伯氏疏螺旋体 研究的一个重点是清楚地了解细菌如何通过转录变化对其环境做出反应。 体外 转录测定允许对转录调节的基本机制进行生化解剖。在这里，我们提出了一个详细的方案，描述了 伯氏疏螺旋 体RNA聚合酶纯化和储存，西格玛因子纯化，DNA模板生成和 体外 转录测定。该协议描述了使用从 伯氏疏螺旋体 5A4 RpoC-HIS（5A4-RpoC）纯化的RNA聚合酶。5A4-RpoC是一种先前发表的菌株，在编码RNA聚合酶最大亚基的 rpoC 基因上携带10XHis标签。 体外 转录测定包括从菌株 5A4-RpoC 纯化的 RNA 聚合酶、管家西格玛因子 RpoD 的重组版本和 PCR 生成的双链 DNA 模板。虽然蛋白质纯化技术和组装体外转录测定的方法在概念上很好理解且相对常见，但RNA聚合酶的处理注意事项通常因生物 体 而异。此处介绍的方案设计用于伯 氏疏螺旋体 RNA聚合酶的酶学研究。该方法可用于测试转录因子、启动子和翻译后修饰对RNA聚合酶活性的作用。

引言

莱姆病和回归热是由疏螺旋体和疏螺旋体¹，^2，3 属的螺旋体病原体引起的。莱姆病是北美一种突出的媒介传播疾病，因此，伯氏疏螺旋体是研究螺旋体生物学的重要模式生物4^，5。对B. burgdorferi转录调控机制的研究旨在更好地了解它在蜱载体和哺乳动物宿主之间循环时对环境变化的适应^6，7。pH、温度、渗透压、营养可用性、短链脂肪酸、有机酸以及溶解氧和二氧化碳水平的变化调节了伯氏疏螺旋体在其节肢动物载体中存活和^{感染动物很重要}的基因的表达8，⁹，^10，11，^12，13，¹⁴，^15，16，^17，18.将这些对刺激的反应与调节机制联系起来一直是伯氏疏螺旋体研究的一个重要方面¹⁹。

转录因子和西格玛因子控制执行细胞过程的基因的转录。莱姆病和回归热螺旋体含有一组相对稀疏的转录因子和替代西格玛因子。尽管如此，仍有复杂的转录变化指导伯氏双歧杆菌对环境的反应²⁰，^21，22。驱动伯氏双歧杆菌响应环境变化的转录变化的具体机制尚不清楚。体外转录测定是采用生化方法测定转录因子和西格玛因子的功能和调节机制的有力工具²³，²⁴，^25，26。

最近建立了使用伯氏疏螺旋体RNA聚合酶的体外转录测定系统²⁴。由于细菌通常具有独特的细胞生理学，不同物种和属的RNA聚合酶对酶纯化，酶储存和反应缓冲条件的反应不同²⁷。B. burgdorferi在遗传上也与许多细菌物种相距甚远，其中RNA聚合酶已被研究²⁰。酶制备的各个方面，如裂解、洗涤和洗脱缓冲液条件、储存缓冲液、体外转录反应缓冲液以及测定构建方法都会改变RNA聚合酶活性。在此，我们提供了一种用于纯化RNA聚合酶和sigma因子RpoD，生产线性双链DNA模板以及构建体外转录测定的方案，以促进使用该系统的实验室之间的可重复性。我们详细介绍了一个示例反应，以证明RpoD依赖性转录的线性范围，并讨论了该方法的局限性和替代方案。

研究方案

1. RNA聚合酶的纯化和RNA聚合酶原液的制备

1. 使用先前描述的细胞收集方案 28，²⁹ 从 2-4 L 伯氏疏螺旋体 RpoC-His10X 中培养的 BSKII 培养基中培养的细胞沉淀 28^，29。在500mL离心瓶中以10，000×g在4°C下离心30分钟，倒出上清液。
2. 将细胞重悬于30 mL冰冷的HN缓冲液（10 mM HEPES，10 mM NaCl，pH 8.0）中。使用50 mL离心管重复上述离心步骤，并倒出上清液。
   注:停止点。将细胞沉淀在-80°C冷冻以储存细胞长达2周或立即进行细胞裂解。
3. 将细胞，裂解物和纯化的蛋白质保持在4°C或冰上，除非冷冻。通过将浓度为2 mM的新鲜制备的DTT添加到本协议中使用的每种缓冲液中，将RNA聚合酶保持在还原环境中，并保持pH值为8.0。
4. 按照试剂盒说明，使用商业细菌裂解试剂盒制备来自 伯氏疏螺旋体 细胞沉淀的裂解物。将沉淀重悬于10-15mL室温（RT）B-PER溶液中，不含蛋白酶抑制剂，并在冰上进行裂解5分钟。裂解体积取决于细胞沉淀大小，如试剂盒说明中所述。
5. 将蛋白酶抑制剂混合物添加到裂解溶液中，然后进行三轮超声处理，如代表性结果部分所述。
   注意:或者，如前所述在法国压力池中裂解细胞²⁴.跳过步骤 1.4。和步骤 1.5。
6. 使用离心澄清细胞裂解物，并使用 50 mL 离心管过滤。通过在溶液中加入钴柱上样缓冲液（表1），将试管的体积填充至至少30 mL的总体积。通过以20，000× g 离心30分钟来沉淀细胞碎片。
7. 使用0.45μm注射器过滤器过滤上清液。
8. 使用1:10的最终稀释比例在钴柱上样缓冲液（表1）中稀释裂解物。
9. 按照制造商的说明，使用钴或镍树脂柱对澄清的细胞裂解物上清液进行亲和色谱。有关示例，请参阅代表性结果部分。使用 表 1 中列出的缓冲液。收集流通、洗涤和洗脱样品进行分析。
10. 按照制造商的说明，使用缓冲液交换柱立即将洗脱缓冲液中的RNA聚合酶交换到RNA聚合酶储存缓冲液（表1）中。
11. 通过使用 10 kDa-截止离心过滤装置将 RNA 聚合酶浓缩至通过分光光度法测定的 0.2-0.4 mg/mL 浓度来制备冷冻储备液（不调整消光系数的_280nm [1 cm = 1 mg·mL⁻¹ 处的 1 绝对值]）。
12. 将 20-50 μL 体积的 RNA 聚合酶冷冻储备液等分到PCR管中，并将RNA聚合酶储存在−80°C。
13. 通过SDS-PAGE确定亲和色谱的质量，并通过分光光度法或BCA测定法测量总蛋白质产量。在 7.5% 聚丙烯酰胺凝胶上以 120 V 运行样品 50 分钟，以获得 SDS-PAGE 的良好分辨率。

2. 重组RpoD的纯化及RpoD储备液的制备

1. 培养并诱导麦芽糖结合蛋白标记的重组B . burgdorferi RpoD（MBP-RpoD）在BL21::MBP-RpoD_Bb中的表达，如 材料表中列出的蛋白质融合和纯化系统说明手册所述，并通过离心收集细胞。
   注:停止点。将细胞沉淀在-80°C冷冻以储存细胞长达2周或立即进行细胞裂解。
2. 使用商业细菌细胞裂解试剂盒或法国压力池进行裂解。参见 表1中的裂解缓冲液示例。
3. 使用离心和过滤澄清细胞裂解物。通过以20，000× g 离心30分钟来沉淀细胞碎片。使用0.45μm过滤器过滤上清液。
4. 使用表达系统的蛋白质提取方案提取 MBP-RpoD。有关示例实现详细信息和结果，请参阅代表性结果部分。
5. 通过SDS-PAGE确定亲和色谱过程和洗脱的质量，并通过分光光度法测量蛋白质产量（未调整消光系数的_280nm [1 cm = 1 mg·mL⁻¹]处的绝对值）。在200V下使用10%聚丙烯酰胺凝胶30分钟在SDS-PAGE中分离。
6. 使用 10 kDa截止离心过滤器浓缩 MBP-RpoD，浓度为 >2 mg/mL，通过分光光度法测定。
7. 在因子Xa裂解位点从RpoD中切割MBP。将CaCl₂ 添加到含有浓度为2mM的MBP-RpoD的亲和色谱洗脱级分中。每 30 毫克纯化蛋白添加 200 μg 因子 Xa 蛋白酶。在室温下孵育过夜。
8. 通过SDS-PAGE确认来自RpoD的MBP完全裂解。在200V下使用10%聚丙烯酰胺凝胶30分钟在SDS-PAGE中分离。
9. 用肝素结合缓冲液以1:10的比例稀释含MBP和RpoD的溶液。
10. 通过FPLC在肝素柱上分离MBP和RpoD。有关 FPLC 设置，请参阅 表 2 。
11. 通过SDS-PAGE测定亲和色谱产品的质量，并通过分光光度法测量蛋白质产量。在200V下使用10%聚丙烯酰胺凝胶30分钟在SDS-PAGE中分离。
12. 使用截止的 10 kDa离心过滤器将含有 RpoD 的洗脱级分浓缩至 2-3 mL 的最终体积。
13. 缓冲液使用凝胶过滤柱将浓缩的RpoD洗脱级分置换到储存缓冲液中。
14. 使用10 kDa截止离心过滤器将RpoD储备液浓缩至分光光度法测定的0.2-0.8mg / mL浓度。
15. 将 20-50 μL 体积的 RpoD 储备液分装在 PCR 管中，并储存在 −80 °C。

3. DNA模板原液的制备

1. PCR使用200μL反应扩增来自 伯氏疏螺旋体 基因组DNA的RpoD驱动启动子位点周围的500 bp区域（表3）。
2. 使用商业PCR纯化试剂盒纯化PCR产物。洗脱分子生物学等级 H₂O 的 DNA。
3. 通过在分子生物学等级 H₂O 中稀释，将 PCR 生成的 DNA 模板的摩尔浓度调节至 100 nM。

4. 掺入放射性标记的核苷酸进行 体外 转录

1. 准备体 外 转录实验计划。确定 RNA 聚合酶、RpoD 和 DNA 模板浓度。确定反应管的等分试样体积和移液顺序。有关示例，请参阅 表 4 和 图 1 。
   注意:在实验计划中包括对照，例如不含RNA聚合酶，替代聚合酶，无模板或替代模板的反应。
2. 计算实验所需的^α-32P-ATP的体积。将其纳入实验计划。通常，每次 体外 转录反应包括2μCi活性，用于荧光屏检测。
3. 准备工作表面，包括辐射工作台，以降低辐射污染风险。
4. 在冰上解冻RNA聚合酶，Rpo，5x缓冲液NTP和模板储备溶液的新鲜等分试样。移液前彻底混合所有解冻的冷冻原液。
5. 根据实验计划制备用于放射性标记核苷酸的主反应混合物和单独的NTP混合物。
6. 将对照反应和实验装置分配到PCR管中，以准备在反应中添加放射性标记物。轻轻分配 H₂O、反应预混液、RNA 聚合酶和 RpoD 到指定的 PCR 管中，并通过移液混合。
7. 将准备好的材料转移到辐射工作台上。
8. 将 ^{α-32 P-ATP}加入 NTP 中，并通过轻柔移液混合。
   注意:在处理放射性物质时，请使用适当的放射性同位素防护设备和处理程序。
9. 将NTP添加到含有步骤4.6中的 体外 转录反应混合物的管中。
10. 通过添加DNA模板开始 体外 转录反应。通过轻轻移液混合反应体积。
11. 在37°C下在热循环仪或加热块中孵育管5分钟。
12. 从热循环仪或加热块中取出反应，并将含有50%甲酰胺的2x RNA上样染料加入等的反应体积以停止 体外 转录反应。
13. 通过在65°C下在热循环仪或加热块中孵育反应5分钟来变性酶。
14. 使用10%-15%TBE尿素聚丙烯酰胺凝胶在180V下通过凝胶电泳分离体 外 转录反应混合物中的RNA，持续30-45分钟。
    注意:根据凝胶电泳条件，缓冲溶液可能被放射性标记的核苷酸污染，或者凝胶可能含有大部分或全部放射性标记的核苷酸。计划适当的放射性储存或处置。
15. 在去除含有未掺入放射性标记的ATP的凝胶的任何部分后，使用磷酸筛选对放射性标记的RNA进行成像。将凝胶暴露在磷酸化筛下过夜（16小时），并使用磷酸化筛成像仪（100μm分辨率，700V PMT管电压）成像。
16. 使用密度测定法分析数据²⁴.

结果

在 体外 转录反应中，反应的限制步骤是西格玛因子介导的转录起始，转录活性应随西格玛因子的量线性增加。我们介绍了 体外 转录实验的制备，测试一系列RpoD浓度以及两种浓度的RNA聚合酶，以观察放射性标记的核苷酸掺入RNA产物所产生的变化信号。显示了制备RNA聚合酶、RpoD和双链DNA模板储备液的代表性结果。代表性的 体外 转录反应可作为可接受的RNA聚合酶活性水平的一?...

讨论

使用所提出的方案构建的体外转录测定最近用于研究转录因子在伯氏疏螺旋体中的作用，并可用于使用其他转录因子，sigma因子和分子²³构建类似的实验。一旦获得来自伯氏疏螺旋体的活性RNA聚合酶并检测到其活性，就可以修改体外转录测定中的组分和条件。该测定具有高度的灵活性和可修改性。反应是模块化的，由冷冻原料制成，一旦选择了实验参数...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.45 micron syringe filter	Thermo Scientific	726-2545	Step 1.7 and 2.3
50 mL conical tubes	MidSci	C50B	Step 1.3, and subsequent steps
50 mL high-speed centrifuge tubes	Thermo Scientific	3119-0050PK	Step 1.2
500 mL Centrifuge bottles	Thermo Scientific	3120-9500PK	Step 1.1
B-PER and instruction manual	Thermo Scientific	78248	Step 1.4 and 2.2
Calcium chloride	Fisher Scientific	10035-04-8	Step 2.6
Centrifugal filters 10 Kd cutoff	Millipore Sigma	UFC8010	Step 1.11 and 2.11
Cobalt resin and instruction manual	Thermo Scientific	89969	Step 1.9
Dithiothreitol	Acros Organics	426380500	Step 1.4 and subsequent steps
Dnase (Nuclease)	Millipore Sigma	70746	Step 1.4 and 2.2
Factor Xa Protease	Haematologic Technologies	HCXA-0060	Step 2.6
GE Typhoon 5 Phosphoimager	GE lifesciences	Multiple	Step 4.15
Gel Imager	Bio-Rad	Mutiple	Step 1.13 and subsequent protien quality check steps
H2O for in vitro transcription	Fisher Scientific	7732-18-5	Step 3.2 and 3.3
high fidelity PCR kit	New England Biolabs	M0530S	Step 3.1
High-speed centrifuge	Eppendorf		Step 1.1, and subsequent steps
HiTrap Heparin HP 5 x 1 mL	Cytiva Life Sciences	17040601	Step 2.8
Imidazole	Sigma-Aldrich	56750-100G	Step 1.9
Lysozyme	Thermo Scientific	90082	Step 1.4 and 2.2
Magnesium chloride	Fisher Scientific	S25401	Step 4.1
Manganese chloride	Fisher Scientific	S25418	Step 4.1
Mini protean tetra cell	Bio-Rad	Mutiple	Step 1.13 and subsequent protien quality check steps
NP-40	Thermo Scientific	85124	Step 4.1
NTP mixture	Thermo Scientific	R0481	Step 4.1
PCR purification kit	Qiagen	28506	Step 3.2
PCR tubes	MidSci	PR-PCR28ACF	Step 1.12
PD-10 Sephadex buffer exchange column and instruction manual	Cytiva	17085101	Step 1.10 and 2.10 (gel filtration column)
pMAL Protein Fusion and Purification System Instruction manual	New England Biolabs	E8200S	Step 2.1
Polyacrylamide gels AnyKD	Bio-Rad	456-8125	Step 1.13 and subsequent protien quality check steps
Potassium glutamate	Sigma-Aldrich	G1251	Step 4.1
Protease inhibitor	Thermo Scientific	78425	Step 1.4 and 2.2
Radiolabeled ATP	Perkin Elmer	BLU503H	Step 4.2
RNA Loading Dye, (2x)	New England Biolabs	B0363S	Step 4.13
Rnase inhibitor	Thermo Scientific	EO0381	Step 4.1
Spectrophotometer	Biotek	Mutiple	Step 1.13 and subsequent protien quality check steps
TBE-Urea gels 10 percent	Bio-Rad	4566033	Step 4.14