JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Анализы транскрипции in vitro могут расшифровать механизмы регуляции транскрипции у Borreliella burgdorferi. Этот протокол описывает этапы очистки РНК-полимеразы B. burgdorferi и проведения реакций транскрипции in vitro. Экспериментальные подходы с использованием анализов транскрипции in vitro требуют надежной очистки и хранения активной РНК-полимеразы.

Аннотация

Borreliella burgdorferi — бактериальный патоген с ограниченным метаболическим и геномным репертуаром. B. burgdorferi проходит внеклеточно между позвоночными и клещами и резко реконструирует свой транскрипционный профиль, чтобы выжить в разрозненных средах во время инфекции. Основное внимание в исследованиях B. burgdorferi уделяется четкому пониманию того, как бактерии реагируют на окружающую среду посредством транскрипционных изменений. Анализы транскрипции in vitro позволяют биохимически препарировать основные механизмы регуляции транскрипции. Здесь мы представляем подробный протокол, описывающий очистку и хранение РНК-полимеразы B. burgdorferi , очистку сигма-фактора, генерацию матрицы ДНК и анализы транскрипции in vitro . В протоколе описано использование РНК-полимеразы, очищенной от B. burgdorferi 5A4 RpoC-His (5A4-RpoC). 5A4-RpoC представляет собой ранее опубликованный штамм, содержащий 10XHis-метку на гене rpoC , кодирующую самую большую субъединицу РНК-полимеразы. Анализы транскрипции in vitro состоят из РНК-полимеразы, очищенной от штамма 5A4-RpoC, рекомбинантной версии домашнего сигма-фактора RpoD и двухцепочечной матрицы ДНК, сгенерированной ПЦР. В то время как методы очистки белка и подходы к сборке анализов транскрипции in vitro концептуально хорошо изучены и относительно распространены, соображения обработки РНК-полимераз часто различаются от организма к организму. Представленный здесь протокол предназначен для ферментативных исследований РНК-полимеразы B. burgdorferi. Метод может быть адаптирован для проверки роли транскрипционных факторов, промоторов и посттрансляционных модификаций на активность РНК-полимеразы.

Введение

Болезнь Лайма и возвратный тиф вызываются возбудителями спирохет родов Borrelia и Borreliella 1,2,3. Болезнь Лайма является известным трансмиссивным заболеванием в Северной Америке, и, следовательно, Borreliella burgdorferi является выдающимся модельным организмом для изучения биологии спирохеты 4,5. Исследования механизмов регуляции транскрипции B. burgdorferi направлены на то, чтобы лучше понять его адаптацию к изменениям в окружающей среде, когда он циклически переключается между своим клещом-переносчиком и хозяевами млекопитающих 6,7. Изменения рН, температуры, осмолярности, доступности питательных веществ, короткоцепочечных жирных кислот, органических кислот и уровней растворенного кислорода и углекислого газа модулируют экспрессию генов, которые важны для выживания B. burgdorferi в его членистоногом векторе и заражения животных 8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18. Связь этих реакций на стимулы с регуляторными механизмами была важным аспектом исследования B. burgdorferi 19.

Транскрипционные факторы и сигма-факторы контролируют транскрипцию генов, осуществляющих клеточные процессы. Спирохеты болезни Лайма и возвратного тифа содержат относительно редкий набор транскрипционных факторов и альтернативных сигма-факторов. Несмотря на это, существуют сложные транскрипционные изменения, направляющие реакцию B. burgdorferi на окружающую среду20,21,22. Конкретные механизмы, приводящие к транскрипционным изменениям у B. burgdorferi в ответ на изменения окружающей среды, остаются неясными. Транскрипционные анализы in vitro являются мощными инструментами для использования биохимического подхода к анализу функции и регуляторных механизмов транскрипционных факторов и сигма-факторов23,24,25,26.

Недавно была создана система анализа транскрипции in vitro с использованием РНК-полимеразы B. burgdorferi 24. Поскольку бактерии часто имеют уникальную клеточную физиологию, РНК-полимеразы разных видов и родов по-разному реагируют на очистку ферментов, хранение ферментов и условия буфера реакции27. B. burgdorferi также генетически далек от многих видов бактерий, у которых были изучены РНК-полимеразы20. Аспекты ферментной подготовки, такие как условия буфера лизиса, промывки и элюирования, буфер хранения, буфер реакции транскрипции in vitro и метод построения анализа, могут изменять активность РНК-полимеразы. Здесь мы предлагаем протокол очистки РНК-полимеразы и сигма-фактора RpoD, получения линейной двухцепочечной матрицы ДНК и построения анализов транскрипции in vitro для облегчения воспроизводимости между лабораториями, использующими эту систему. Мы подробно описываем пример реакции, чтобы продемонстрировать линейный диапазон для RpoD-зависимой транскрипции, и обсуждаем ограничения и альтернативы этому подходу.

протокол

1. Очистка РНК-полимеразы и получение РНК-полимеразного сырья

  1. Собирают клеточную гранулу из 2-4 л B. burgdorferi RpoC-His10X, культивируемой в среде BSKII в микроаэрофильной среде (34 °C, 5% CO 2, 3% O 2) до плотности2-4 x 107 клеток/мл с использованием ранее описанных протоколов клеточного сбора 28,29. Проведите центрифугирование при 10 000 x g при 4 ° C в течение 30 мин в центробежных бутылках по 500 мл и слейте надосадочную жидкость.
  2. Ресуспендируют клетки в 30 мл ледяного буфера HN (10 мМ HEPES, 10 мМ NaCl, pH 8,0). Повторите этап центрифугирования, как описано выше, используя центрифужную пробирку объемом 50 мл и сцедите надосадочную жидкость.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Остановочный пункт. Заморозьте клеточный гранул при температуре −80 °C, чтобы хранить клетки до 2 недель, или немедленно приступайте к лизису клеток.
  3. Поддерживайте клетки, лизат и очищенные белки при температуре 4 ° C или на льду, если не замораживать. Сохраняйте РНК-полимеразу в восстановительной среде, добавляя свежеприготовленный DTT в концентрации 2 мМ в каждый буфер, используемый в этом протоколе, и поддерживайте pH 8,0.
  4. Приготовьте лизат из гранул клеток B. burgdorferi с помощью коммерческого набора для лизиса бактерий, следуя инструкциям набора. Ресуспендировать гранулу в 10-15 мл раствора B-per комнатной температуры (РТ) без ингибитора протеазы и дать лизису продолжаться в течение 5 мин на льду. Объем лизиса зависит от размера гранул ячейки, как описано в инструкциях к набору.
  5. Добавьте коктейль ингибитора протеазы в раствор для лизиса, а затем три раунда обработки ультразвуком, как описано в разделе репрезентативных результатов.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В качестве альтернативы можно лизировать клетки во французской ячейке давления, как описано ранее24. Пропустите шаг 1.4. и шаг 1.5.
  6. Осветляют лизат клеток с помощью центрифугирования и фильтрации с помощью центрифужной пробирки объемом 50 мл. Заполните объем пробирки не менее чем до 30 мл общего объема, добавив в раствор буфер загрузки кобальтовой колонны (таблица 1). Гранулируйте клеточный мусор центрифугированием при 20 000 x g в течение 30 мин.
  7. Отфильтруйте надосадочную жидкость с помощью шприцевого фильтра 0,45 мкм.
  8. Разбавьте лизат в загрузочном буфере кобальтовой колонны (таблица 1), используя конечное соотношение разбавления 1:10.
  9. Проведите аффинную хроматографию надосадочной жидкости лизата осветленных клеток с помощью колонки из кобальта или никелевой смолы, следуя инструкциям производителя. Пример см. в разделе репрезентативных результатов. Используйте буферы, перечисленные в таблице 1. Соберите проточные, промывочные и элюирующие образцы для анализа.
  10. Немедленно замените РНК-полимеразу в элюирующем буферном растворе на буферный раствор для хранения РНК-полимеразы (таблица 1) с помощью буферной обменной колонки, следуя инструкциям производителя.
  11. Подготовьте запасы в морозильной камере, сконцентрировав РНК-полимеразу с помощью центробежных фильтрующих блоков с отсечкой 10 кДа до концентрации 0,2-0,4 мг/мл, определенной с помощью спектрофотометрии (280 нм без корректировки коэффициента экстинкции [1 абс при 1 см = 1 мг·мл-1]).
  12. Аликвотная РНК-полимераза в морозильной камере хранится в объемах 20-50 мкл в пробирках для ПЦР и хранит РНК-полимеразу при -80 ° C.
  13. Определите качество аффинной хроматографии с помощью SDS-PAGE и измерьте общий выход белка с помощью спектрофотометрии или анализа BCA. Запустите образцы на 7,5% полиакриламидном геле при 120 В в течение 50 минут для хорошего разрешения SDS-PAGE.

2. Очистка рекомбинантного RpoD и подготовка сырья RpoD

  1. Культивируйте и индуцируйте экспрессию рекомбинантного B. burgdorferi RpoD (MBP-RpoD), меченного белкомбинантным белком, меченным мальтозой, в BL21::MBP-RpoDBb, как описано в руководстве по эксплуатации системы слияния и очистки белка, приведенном в таблице материалов, и собирайте клетки центрифугированием.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Остановочный пункт. Заморозьте гранулы клеток при температуре -80 °C, чтобы хранить клетки до 2 недель, или немедленно приступайте к лизису клеток.
  2. Выполните лизис, используя коммерческий набор для лизиса бактериальных клеток или французский датчик давления. Пример буфера лизиса приведен в таблице 1.
  3. Осветляют лизат клеток с помощью центрифугирования и фильтрации. Гранулируйте клеточный мусор центрифугированием при 20 000 x g в течение 30 мин. Отфильтруйте надосадочную жидкость с помощью фильтра 0,45 мкм.
  4. Экстракция MBP-RpoD с использованием протокола экстракции белка для системы экспрессии. В разделе «Репрезентативные результаты» см., например, сведения о реализации и результаты.
  5. Определите качество процесса аффинной хроматографии и элюирования с помощью SDS-PAGE и измерьте выход белка с помощью спектрофотометрии (280 нм без корректировки коэффициента экстинкции [1 абс при 1 см = 1 мг · мл − 1]). Используйте 10% полиакриламидный гель при 200 В в течение 30 мин для разделения в SDS-PAGE.
  6. Концентратируют MBP-RpoD с помощью центробежного фильтра с отсечкой 10 кДа до концентрации >2 мг/мл, определяемой с помощью спектрофотометрии.
  7. Отщепите MBP от RpoD на сайте расщепления фактора Xa. Добавьте CaCl 2 к фракциям элюирования аффинной хроматографии, содержащим MBP-RpoD в концентрации2 мМ. Добавьте 200 мкг протеазы фактора Ха на каждые 30 мг очищенного белка. Инкубация в течение ночи при RT.
  8. Подтвердите полное отщепление MBP от RpoD с помощью SDS-PAGE. Используйте 10% полиакриламидный гель при 200 В в течение 30 мин для разделения в SDS-PAGE.
  9. Разбавляют MBP и RpoD-содержащий раствор в соотношении 1:10 гепарин-связывающим буфером.
  10. Разделите MBP и RpoD на гепариновой колонке с помощью FPLC. Настройки FPLC см. в таблице 2 .
  11. Определите качество продуктов аффинной хроматографии с помощью SDS-PAGE и измерьте выход белка с помощью спектрофотометрии. Используйте 10% полиакриламидный гель при 200 В в течение 30 мин для разделения в SDS-PAGE.
  12. Концентратируют элюирующие фракции, содержащие RpoD, с помощью центробежного фильтра с отсечкой 10 кДа до конечного объема 2-3 мл.
  13. Буфер обменивает концентрированные фракции элюирования RpoD на буфер хранения с помощью колонны для фильтрации геля.
  14. Сконцентрируйте сырье RpoD с помощью центробежного фильтра с отсечкой 10 кДа до концентрации 0,2-0,8 мг/мл, определенной с помощью спектрофотометрии.
  15. Aliquot RpoD хранится в объемах 20-50 мкл в ПЦР-пробирках и хранится при -80 °C.

3. Подготовка материала шаблона ДНК

  1. ПЦР амплифицирует область 500.н., окружающую промоторный сайт, управляемый RpoD, из геномной ДНК B. burgdorferi , используя реакцию 200 мкл (таблица 3).
  2. Очистите продукты ПЦР с помощью коммерческого набора для очистки ПЦР. Элюте ДНК в молекулярной биологии класс H2O.
  3. Отрегулируйте молярную концентрацию матриц ДНК, сгенерированных ПЦР, до 100 нМ путем разбавления в молекулярной биологии класса H2O.

4. Выполнить транскрипцию in vitro с включением радиоактивно меченных нуклеотидов

  1. Подготовьте экспериментальный план транскрипции in vitro . Определите концентрацию РНК-полимеразы, RpoD и матрицы ДНК. Определите аликвотные объемы и заказы на пипетирование для реакционных пробирок. Пример см. в таблице 4 и на рисунке 1 .
    ПРИМЕЧАНИЕ: Включите контрольные элементы в план эксперимента, такие как реакции, не содержащие РНК-полимеразы, альтернативной полимеразы, без шаблона или альтернативные шаблоны.
  2. Рассчитайте объем α-32-АТФ, необходимый для эксперимента. Включите это в план эксперимента. Как правило, включают 2 мкКи активности на реакцию транскрипции in vitro для обнаружения люминофорного экрана.
  3. Подготовьте рабочие поверхности, включая радиационный стенд, чтобы снизить риск радиационного загрязнения.
  4. Размораживание свежих аликвот РНК-полимеразы, Rpo, 5-кратного буфера NTP и шаблонных исходных растворов на льду. Перед пипеткой тщательно перемешайте все размороженные замороженные бульоны.
  5. Приготовьте мастер-реакционную смесь и отдельную смесь NTP для радиоактивно меченных нуклеотидов в соответствии с планом эксперимента.
  6. Распределите контрольные реакции и экспериментальные наборы в ПЦР-пробирки для подготовки к добавлению радиоактивной метки в реакцию. Аккуратно распределите H2O, основную реакционную смесь, РНК-полимеразу и RpoD в специальные пробирки для ПЦР и перемешайте пипеткой.
  7. Перенесите подготовленные материалы на радиационный стенд.
  8. Добавьте α-32P-АТФ в NTP и перемешайте легким пипетированием.
    ВНИМАНИЕ: При работе с радиоактивными материалами используйте соответствующее защитное снаряжение и процедуры обращения с радиоактивными изотопами.
  9. Добавляют NTP в пробирки, содержащие реакционные смеси транскрипции in vitro , начиная с шага 4.6.
  10. Начните реакцию транскрипции in vitro с добавлением матрицы ДНК. Перемешайте реакционный объем, аккуратно пипетируя.
  11. Инкубируйте пробирки при 37 °C в течение 5 мин в термоциклере или тепловом блоке.
  12. Удалите реакции из термоциклера или теплового блока и добавьте 2x краситель, загружающий РНК, содержащий 50% формамида, к равному объему реакции, чтобы остановить реакции транскрипции in vitro .
  13. Денатурируют ферменты путем инкубации реакций при 65 ° C в течение 5 мин в термоциклере или тепловом блоке.
  14. Отделите РНК в смеси реакции транскрипции in vitro с помощью гель-электрофореза с использованием 10%-15% полиакриламидных гелей мочевины TBE при 180 В в течение 30-45 мин.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В зависимости от условий гель-электрофореза буферный раствор может быть загрязнен радиоактивно меченными нуклеотидами, или гель может содержать большую часть или все радиоактивно меченные нуклеотиды. Планирование надлежащего хранения или утилизации радиоактивных веществ.
  15. Визуализируйте РНК с радиоактивной меткой с помощью фосфоэкрана после удаления любой части геля, содержащей неинкорпорированную АТФ с радиоактивной меткой. Подвергните гель воздействию фосфоэкрана на ночь (16 ч) и получите изображение с помощью тепловизора phosphoscreen (разрешение 100 мкм, напряжение трубки ФЭУ 700 В).
  16. Анализ данных методами денситометрии24.

Результаты

В реакции транскрипции in vitro , в которой ограничивающим этапом реакции является инициация транскрипции, опосредованная сигма-фактором, активность транскрипции должна линейно увеличиваться с количеством сигма-фактора. Мы представляем подготовку экспериментов по транскрипции in...

Обсуждение

Анализы транскрипции in vitro, построенные с использованием представленного протокола, недавно были использованы для изучения роли транскрипционного фактора у B. burgdorferi и могут быть применены для построения аналогичных экспериментов с использованием других транскрипционных фа...

Раскрытие информации

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Благодарности

Эта работа была поддержана грантом Фонда стратегических инвестиций в области здравоохранения Крейтонского университета. Штамм B. burgdorferi RpoC-His10X был любезно предоставлен доктором Д. Скоттом Сэмюэлсом из Университета Монтаны. Штамм E. coli , содержащий плазмиду pMAL-C5X, кодирующую аллель rpoD , меченный мальтозосвязывающим белком, был любезно предоставлен доктором Фрэнком Герардини из Rocky Mountain Laboratories, NIAID, NIH.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
0.45 micron syringe filterThermo Scientific726-2545Step 1.7 and 2.3
50 mL conical tubesMidSciC50BStep 1.3, and subsequent steps
50 mL high-speed centrifuge tubesThermo Scientific3119-0050PKStep 1.2
500 mL Centrifuge bottlesThermo Scientific3120-9500PKStep 1.1
B-PER and instruction manualThermo Scientific78248Step 1.4 and 2.2
Calcium chlorideFisher Scientific10035-04-8Step 2.6
Centrifugal filters 10 Kd cutoffMillipore SigmaUFC8010Step 1.11 and 2.11
Cobalt resin and instruction manualThermo Scientific89969Step 1.9
DithiothreitolAcros Organics426380500Step 1.4 and subsequent steps
Dnase (Nuclease)Millipore Sigma70746Step 1.4 and 2.2
Factor Xa Protease Haematologic TechnologiesHCXA-0060Step 2.6
GE Typhoon 5 PhosphoimagerGE lifesciencesMultipleStep 4.15
Gel ImagerBio-RadMutipleStep 1.13 and subsequent protien quality check steps
H2O for in vitro transcriptionFisher Scientific7732-18-5Step 3.2 and 3.3
high fidelity PCR kitNew England BiolabsM0530SStep 3.1
High-speed centrifugeEppendorfStep 1.1, and subsequent steps
HiTrap Heparin HP 5 x 1 mLCytiva Life Sciences17040601Step 2.8
ImidazoleSigma-Aldrich56750-100GStep 1.9
LysozymeThermo Scientific90082Step 1.4 and 2.2
Magnesium chloride Fisher ScientificS25401Step 4.1
Manganese chlorideFisher ScientificS25418Step 4.1
Mini protean tetra cellBio-RadMutipleStep 1.13 and subsequent protien quality check steps
NP-40Thermo Scientific85124Step 4.1
NTP mixtureThermo ScientificR0481Step 4.1
PCR purification kitQiagen28506Step 3.2
PCR tubesMidSciPR-PCR28ACFStep 1.12
PD-10 Sephadex buffer exchange column and instruction manualCytiva17085101Step 1.10 and 2.10 (gel filtration column)
pMAL Protein Fusion
and Purification System Instruction manual		New England BiolabsE8200SStep 2.1
Polyacrylamide gels AnyKDBio-Rad456-8125Step 1.13 and subsequent protien quality check steps
Potassium glutamateSigma-AldrichG1251Step 4.1
Protease inhibitorThermo Scientific78425Step 1.4 and 2.2
Radiolabeled ATPPerkin ElmerBLU503HStep 4.2
RNA Loading Dye, (2x)New England BiolabsB0363SStep 4.13
Rnase inhibitorThermo ScientificEO0381Step 4.1
SpectrophotometerBiotekMutipleStep 1.13 and subsequent protien quality check steps
TBE-Urea gels 10 percentBio-Rad4566033Step 4.14

Ссылки

  1. Brisson, D., Drecktrah, D., Eggers, C. H., Samuels, D. S. Genetics of Borrelia burgdorferi. Annual Review of Genetics. 46, 515-536 (2012).
  2. Kingry, L. C., et al. Surveillance for and discovery of Borrelia Species in US patients suspected of tickborne illness. Clinical Infectious Diseases. 66 (12), 1864-1871 (2018).
  3. Cutler, S. J. Relapsing fever Borreliae: A global review. Clinics in Laboratory Medicine. 35 (4), 847-865 (2015).
  4. Barbour, A. G., Hayes, S. F. Biology of Borrelia species. Microbiological Reviews. 50 (4), 381-400 (1986).
  5. Tilly, K., Rosa, P. A., Stewart, P. E. Biology of infection with Borrelia burgdorferi. Infectious Disease Clinics of North America. 22 (2), 217-234 (2008).
  6. Radolf, J. D., Caimano, M. J., Stevenson, B., Hu, L. T. Of ticks, mice and men: understanding the dual-host lifestyle of Lyme disease spirochaetes. Nature Reviews Microbiology. 10 (2), 87-99 (2012).
  7. Caimano, M. J., Drecktrah, D., Kung, F., Samuels, D. S. Interaction of the Lyme disease spirochete with its tick vector. Cellular Microbiology. 18 (7), 919-927 (2016).
  8. Dulebohn, D. P., Richards, C. L., Su, H., Lawrence, K. A., Gherardini, F. C. Weak organic acids decrease Borrelia burgdorferi cytoplasmic pH, eliciting an acid stress response and impacting RpoN- and RpoS-dependent gene expression. Frontiers in Microbiology. 8, 1734 (2017).
  9. Bontemps-Gallo, S., Lawrence, K., Gherardini, F. C. Two different virulence-related regulatory pathways in Borrelia burgdorferi are directly affected by osmotic fluxes in the blood meal of feeding ixodes ticks. PLoS Pathogens. 12 (8), 1005791 (2016).
  10. Bugrysheva, J. V., et al. Characterization of the RelBbu Regulon in Borrelia burgdorferi reveals modulation of glycerol metabolism by (p)ppGpp. PLoS One. 10 (2), 0118063 (2015).
  11. Carroll, J. A., Garon, C. F., Schwan, T. G. Effects of environmental pH on membrane proteins in Borrelia burgdorferi. Infection and Immunity. 67 (7), 3181-3187 (1999).
  12. Drecktrah, D., et al. The Borrelia burgdorferi RelA/SpoT homolog and stringent response regulate survival in the tick vector and global gene expression during starvation. PLoS Pathogens. 11 (9), 1005160 (2015).
  13. Hyde, J. A., Trzeciakowski, J. P., Skare, J. T. Borrelia burgdorferi alters its gene expression and antigenic profile in response to CO2 levels. Journal of Bacteriology. 189 (2), 437-445 (2007).
  14. Lin, Y. H., Chen, Y., Smith, T. C., Karna, S. L. R., Seshu, J. Short-chain fatty acids alter metabolic and virulence attributes of Borrelia burgdorferi. Infection and Immunity. 86 (9), 00217-00218 (2018).
  15. Seshu, J., Boylan, J. A., Gherardini, F. C., Skare, J. T. Dissolved oxygen levels alter gene expression and antigen profiles in Borrelia burgdorferi. Infection and Immunity. 72 (3), 1580-1586 (2004).
  16. Stevenson, B., Schwan, T. G., Rosa, P. A. Temperature-related differential expression of antigens in the Lyme disease spirochete, Borrelia burgdorferi. Infection and Immunity. 63 (11), 4535-4539 (1995).
  17. Troxell, B., et al. Manganese and zinc regulate virulence determinants in Borrelia burgdorferi. Infection and Immunity. 81 (8), 2743-2752 (2013).
  18. Yang, X., et al. Interdependence of environmental factors influencing reciprocal patterns of gene expression in virulent Borrelia burgdorferi. Molecular Microbiology. 37 (6), 1470-1479 (2000).
  19. Samuels, D. S., et al. Gene regulation and transcriptomics. Current Issues in Molecular Biology. 42, 223-266 (2021).
  20. Fraser, C. M., et al. Genomic sequence of a Lyme disease spirochaete, Borrelia burgdorferi. Nature. 390 (6660), 580-586 (1997).
  21. Iyer, R., Schwartz, I. Microarray-based comparative genomic and transcriptome analysis of Borrelia burgdorferi. Microarrays. 5 (2), 9 (2016).
  22. Iyer, R., et al. Stage-specific global alterations in the transcriptomes of Lyme disease spirochetes during tick feeding and following mammalian host adaptation. Molecular Microbiology. 95 (3), 509-538 (2015).
  23. Boyle, W. K., et al. DksA-dependent regulation of RpoS contributes to Borrelia burgdorferi tick-borne transmission and mammalian infectivity. PLoS Pathogen. 17 (2), 1009072 (2021).
  24. Boyle, W. K., et al. Establishment of an in vitro RNA polymerase transcription system: a new tool to study transcriptional activation in Borrelia burgdorferi. Scientific Reports. 10 (1), 8246 (2020).
  25. Silar, R., et al. Use of in vitro transcription system for analysis of Corynebacterium glutamicum promoters recognized by two sigma factors. Current Microbiology. 73 (3), 401-408 (2016).
  26. Maciag, A., et al. In vitro transcription profiling of the sigmaS subunit of bacterial RNA polymerase: re-definition of the sigmaS regulon and identification of sigmaS-specific promoter sequence elements. Nucleic Acids Research. 39 (13), 5338-5355 (2011).
  27. Chang, A., et al. BRENDA, the ELIXIR core data resource in 2021: New developments and updates. Nucleic Acids Research. 49, 498-508 (2021).
  28. Samuels, D. S., Drecktrah, D., Hall, L. S. Genetic transformation and complementation. Methods in Molecular Biology. 1690, 183-200 (2018).
  29. Hyde, J. A., Weening, E. H., Skare, J. T. Genetic transformation of Borrelia burgdorferi. Current Protocols in Microbiology. 20, 1-17 (2011).
  30. Ge, Y., Old, I. G., Saint Girons, I., Charon, N. W. Molecular characterization of a large Borrelia burgdorferi motility operon which is initiated by a consensus sigma70 promoter. Journal of Bacteriology. 179 (7), 2289-2299 (1997).
  31. Ozaki, M., Wada, A., Fujita, N., Ishihama, A. Growth phase-dependent modification of RNA polymerase in Escherichia coli. Molecular Genetics and Genomics. 230 (1-2), 17-23 (1991).
  32. Jasinski, D. L., Schwartz, C. T., Haque, F., Guo, P. Large scale purification of RNA nanoparticles by preparative ultracentrifugation. Methods in Molecular Biology. 1297, 67-82 (2015).
  33. Gierl, A., Zillig, W., Stetter, K. O. The role of the components sigma and y of the DNA-dependent RNA polymerase of Lactobacillus curvatus in promotor selection. European Journal of Biochemistry. 125 (1), 41-47 (1982).
  34. Stetter, K. O., Zillig, W. Transcription in lactobacillaceae. DNA-dependent RNA polymerase from Lactobacillus curvatus. European Journal of Biochemistry. 48 (2), 527-540 (1974).
  35. Borbley, G., Schneider, G. Cyanobacteria. Methods in Enzymology. 167, 3 (1988).
  36. Svetlov, V., Artsimovitch, I. Purification of bacterial RNA polymerase: Tools and protocols. Methods in Molecular Biology. 1276, 13-29 (2015).
  37. Shimada, T., Yamazaki, Y., Tanaka, K., Ishihama, A. The whole set of constitutive promoters recognized by RNA polymerase RpoD holoenzyme of Escherichia coli. PLoS One. 9 (3), 90447 (2014).
  38. Daubendiek, S. L., Ryan, K., Kool, E. T. Rolling-circle RNA synthesis: Circular oligonucleotides as efficient substrates for T7 RNA polymerase. Journal of the American Chemical Society. 117 (29), 7818-7819 (1995).
  39. Marras, S. A., Gold, B., Kramer, F. R., Smith, I., Tyagi, S. Real-time measurement of in vitro transcription. Nucleic Acids Research. 32 (9), 72 (2004).
  40. Chamberlin, M. J., Nierman, W. C., Wiggs, J., Neff, N. A quantitative assay for bacterial RNA polymerases. Journal of Biological Chemistry. 254 (20), 10061-10069 (1979).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

JoVE185in vitroRpoDRpoC

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены