Componenti essenziali di Borreliella (Borrelia) burgdorferi Saggi di trascrizione in vitro

Riepilogo

I saggi di trascrizione in vitro possono decifrare i meccanismi di regolazione trascrizionale in Borreliella burgdorferi. Questo protocollo descrive i passaggi per purificare la RNA polimerasi di B. burgdorferi ed eseguire reazioni di trascrizione in vitro . Gli approcci sperimentali che utilizzano saggi di trascrizione in vitro richiedono una purificazione e una conservazione affidabili della RNA polimerasi attiva.

Abstract

La Borreliella burgdorferi è un patogeno batterico con repertori metabolici e genomici limitati. B. burgdorferi transita extracellulare tra vertebrati e zecche e rimodella drammaticamente il suo profilo trascrizionale per sopravvivere in ambienti disparati durante l'infezione. Un obiettivo degli studi di B. burgdorferi è capire chiaramente come i batteri rispondono al suo ambiente attraverso cambiamenti trascrizionali. I saggi di trascrizione in vitro consentono di sezionare biochimicamente i meccanismi di base della regolazione trascrizionale. Qui, presentiamo un protocollo dettagliato che descrive la purificazione e lo stoccaggio della RNA polimerasi di B. burgdorferi , la purificazione del fattore sigma, la generazione di modelli di DNA e saggi di trascrizione in vitro . Il protocollo descrive l'uso della RNA polimerasi purificata da B. burgdorferi 5A4 RpoC-His (5A4-RpoC). 5A4-RpoC è un ceppo precedentemente pubblicato che ospita un tag 10XHis sul gene rpoC che codifica per la più grande subunità della RNA polimerasi. I saggi di trascrizione in vitro consistono nella RNA polimerasi purificata dal ceppo 5A4-RpoC, una versione ricombinante del fattore sigma RpoD e un modello di DNA a doppio filamento generato dalla PCR. Mentre le tecniche di purificazione delle proteine e gli approcci all'assemblaggio di saggi di trascrizione in vitro sono concettualmente ben compresi e relativamente comuni, le considerazioni sulla gestione delle RNA polimerasi spesso differiscono da organismo a organismo. Il protocollo qui presentato è progettato per studi enzimatici sulla polimerasi RNA di B. burgdorferi. Il metodo può essere adattato per testare il ruolo dei fattori di trascrizione, dei promotori e delle modificazioni post-traduzionali sull'attività della RNA polimerasi.

Introduzione

La malattia di Lyme e la febbre recidivante sono causate da patogeni della spirocheta nei generi Borrelia e Borreliella ^1,2,3. La malattia di Lyme è una malattia trasmessa da vettori in Nord America e, di conseguenza, Borreliella burgdorferi è un organismo modello di spicco per studiare la biologia della spirocheta ^4,5. Le indagini sui meccanismi di regolazione trascrizionale di B. burgdorferi mirano a comprendere meglio i suoi adattamenti ai cambiamenti nell'ambiente mentre ciclicamente tra il suo vettore zecca e gli ospiti dei mammiferi ^6,7. Le variazioni di pH, temperatura, osmolarità, disponibilità di nutrienti, acidi grassi a catena corta, acidi organici e livelli di ossigeno disciolto e anidride carbonica modulano l'espressione di geni che sono importanti per B. burgdorferi per sopravvivere nel suo vettore artropode e infettare gli animali 8,9,10,11,12,13,14,15^,16,17,18. Collegare queste risposte agli stimoli con i meccanismi regolatori è stato un aspetto importante della ricerca di B. burgdorferi ¹⁹.

I fattori di trascrizione e i fattori sigma controllano la trascrizione dei geni che svolgono processi cellulari. Le spirochete di Lyme e della febbre recidivante ospitano un insieme relativamente scarso di fattori di trascrizione e fattori sigma alternativi. Nonostante ciò, ci sono complessi cambiamenti trascrizionali che dirigono le risposte di B. burgdorferi all'ambiente^20,21,22. I meccanismi specifici che guidano i cambiamenti trascrizionali in B. burgdorferi in risposta ai cambiamenti ambientali rimangono poco chiari. I saggi di trascrizione in vitro sono potenti strumenti per impiegare un approccio biochimico per analizzare la funzione e i meccanismi di regolazione dei fattori di trascrizione e dei fattori sigma^23,24,25,26.

Un sistema di saggio di trascrizione in vitro utilizzando la B. burgdorferi RNA polimerasi è stato recentemente stabilito²⁴. Poiché i batteri hanno spesso fisiologie cellulari uniche, le RNA polimerasi di diverse specie e generi rispondono in modo diverso alla purificazione enzimatica, allo stoccaggio enzimatico e alle condizioni del tampone di reazione²⁷. B. burgdorferi è anche geneticamente distante dalle molte specie batteriche in cui sono state studiate le RNA polimerasi²⁰. Aspetti della preparazione enzimatica come la lisi, le condizioni del tampone di lavaggio ed eluizione, il tampone di stoccaggio, il tampone di reazione di trascrizione in vitro e il metodo di costruzione del saggio possono alterare l'attività della RNA polimerasi. Qui, forniamo un protocollo per la purificazione della RNA polimerasi e del fattore sigma RpoD, la produzione di modelli lineari di DNA a doppio filamento e la costruzione di saggi di trascrizione in vitro per facilitare la riproducibilità tra laboratori che utilizzano questo sistema. Descriviamo in dettaglio una reazione di esempio per dimostrare l'intervallo lineare per la trascrizione dipendente da RpoD e discutiamo i limiti e le alternative a questo approccio.

Protocollo

1. Purificazione della RNA polimerasi e preparazione dello stock di RNA polimerasi

1. Raccogliere il pellet cellulare da 2-4 L di B. burgdorferi RpoC-His10X coltivato in mezzo BSKII in ambiente microaerofilo (34 °C, 5% CO 2, 3% O 2) ad una densità di_2-4 x 10⁷ cellule/ml utilizzando i protocolli di raccolta cellulare precedentemente descritti^28,29. Eseguire la centrifugazione a 10.000 x g a 4 °C per 30 minuti in flaconi centrifughi da 500 ml e versare il surnatante.
2. Risospendere le cellule in 30 ml di tampone HN ghiacciato (10 mM HEPES, 10 mM NaCl, pH 8,0). Ripetere la fase di centrifugazione come descritto sopra utilizzando una provetta da centrifuga da 50 ml e decantare il surnatante.
   NOTA: punto di arresto. Congelare il pellet cellulare a -80 °C per conservare le cellule per un massimo di 2 settimane o procedere immediatamente alla lisi cellulare.
3. Mantenere le cellule, il lisato e le proteine purificate a 4 °C o su ghiaccio a meno che non si congeli. Mantenere la RNA polimerasi in un ambiente riducente aggiungendo DTT appena preparato ad una concentrazione di 2 mM a ciascun tampone utilizzato in questo protocollo e mantenere il pH 8,0.
4. Preparare il lisato dal pellet cellulare di B. burgdorferi utilizzando un kit di lisi batterica commerciale seguendo le istruzioni del kit. Risospendere il pellet in 10-15 ml di soluzione B-PER a temperatura ambiente (RT) senza inibitore della proteasi e lasciare che la lisi proceda per 5 minuti su ghiaccio. Il volume di lisi dipende dalla dimensione del pellet cellulare, come descritto nelle istruzioni del kit.
5. Aggiungere cocktail di inibitori della proteasi alla soluzione di lisi, seguiti da tre cicli di sonicazione, come descritto nella sezione dei risultati rappresentativi.
   NOTA: In alternativa, lisare le celle in una cella a pressione francese come descritto in precedenza²⁴. Saltare il passaggio 1.4. e passo 1.5.
6. Chiarire il lisato cellulare mediante centrifugazione e filtrazione utilizzando una provetta da centrifuga da 50 ml. Riempire il volume del tubo ad almeno 30 mL di volume totale aggiungendo alla soluzione un tampone di carico a colonna di cobalto (Tabella 1). Pellettare i detriti cellulari mediante centrifugazione a 20.000 x g per 30 min.
7. Filtrare il surnatante utilizzando un filtro a siringa da 0,45 μm.
8. Diluire il lisato nel tampone di carico a colonna di cobalto (Tabella 1) utilizzando un rapporto di diluizione finale di 1:10.
9. Eseguire la cromatografia di affinità sul surnatante di lisato cellulare chiarificato utilizzando una colonna di cobalto o resina di nichel seguendo le istruzioni del produttore. Vedere la sezione dei risultati rappresentativi per un esempio. Utilizzare i buffer elencati nella tabella 1. Raccogliere i campioni di flusso, lavaggio ed eluizione per l'analisi.
10. Sostituire immediatamente la RNA polimerasi nella soluzione tampone di eluizione in una soluzione tampone di stoccaggio di RNA polimerasi (Tabella 1) utilizzando una colonna di scambio tampone seguendo le istruzioni del produttore.
11. Preparare le scorte di congelatore concentrando la RNA polimerasi utilizzando unità filtranti centrifughe a taglio di 10 kDa ad una concentrazione di 0,2-0,4 mg/ml determinata mediante spettrofotometria (A_280nm senza regolazione del coefficiente di estinzione [1 abs a 1 cm = 1 mg·mL⁻¹]).
12. Aliquot RNA polimerasi congela in volumi di 20-50 μL in provette per PCR e conservare l'RNA polimerasi a -80 °C.
13. Determinare la qualità della cromatografia di affinità mediante SDS-PAGE e misurare la resa proteica totale mediante spettrofotometria o saggio BCA. Eseguire i campioni su un gel di poliacrilammide al 7,5% a 120 V per 50 minuti per una buona risoluzione tramite SDS-PAGE.

2. Purificazione dell'RpoD ricombinante e preparazione dello stock di RpoD

1. Coltivare e indurre l'espressione di B. burgdorferi RpoD (MBP-RpoD) ricombinante marcato con proteine leganti il maltosio in BL21::MBP-RpoD_Bb, come descritto dal manuale di istruzioni del sistema di fusione e purificazione delle proteine elencato nella Tabella dei Materiali, e raccogliere le cellule mediante centrifugazione.
   NOTA: punto di arresto. Congelare i pellet cellulari a -80 °C per conservare le cellule per un massimo di 2 settimane o procedere immediatamente alla lisi cellulare.
2. Eseguire la lisi utilizzando un kit di lisi cellulare batterica commerciale o una cella a pressione francese. Vedere l'esempio di buffer di lisi nella Tabella 1.
3. Chiarire il lisato cellulare mediante centrifugazione e filtrazione. Pellettare i detriti cellulari mediante centrifugazione a 20.000 x g per 30 min. Filtrare il surnatante utilizzando un filtro da 0,45 μm.
4. Estrarre MBP-RpoD utilizzando un protocollo di estrazione proteica per il sistema di espressione. Vedere la sezione dei risultati rappresentativi per esempio i dettagli e i risultati dell'implementazione.
5. Determinare la qualità del processo cromatografico di affinità e dell'eluizione mediante SDS-PAGE e misurare la resa proteica mediante spettrofotometria (A_280nm senza aggiustamento del coefficiente di estinzione [1 abs a 1 cm = 1 mg·mL⁻¹]). Utilizzare gel di poliacrilammide al 10% a 200 V per 30 minuti per la separazione in SDS-PAGE.
6. Concentrare MBP-RpoD utilizzando un filtro centrifugo cutoff da 10 kDa ad una concentrazione di >2 mg/mL determinata mediante spettrofotometria.
7. Tagliare MBP da RpoD nel sito di scissione del fattore Xa. Aggiungere CaCl 2 alle frazioni di eluizione per cromatografia di affinità contenenti MBP-RpoD ad una concentrazione di₂ mM. Aggiungere 200 μg di Factor Xa Protease per ogni 30 mg di proteine purificate. Incubare durante la notte a RT.
8. Conferma la completa scissione di MBP da RpoD da SDS-PAGE. Utilizzare gel di poliacrilammide al 10% a 200 V per 30 minuti per la separazione in SDS-PAGE.
9. Diluire la soluzione contenente MBP e RpoD in rapporto 1:10 con un tampone legante l'eparina.
10. MBP e RpoD separati sulla colonna di eparina mediante FPLC. Vedere la Tabella 2 per le impostazioni FPLC.
11. Determinare la qualità dei prodotti per cromatografia di affinità mediante SDS-PAGE e misurare la resa proteica mediante spettrofotometria. Utilizzare gel di poliacrilammide al 10% a 200 V per 30 minuti per la separazione in SDS-PAGE.
12. Concentrare le frazioni di eluizione contenenti RpoD utilizzando un filtro centrifugo a taglio 10 kDa, ad un volume finale di 2-3 ml.
13. Sostituire le frazioni concentrate di eluizione RpoD con il tampone di stoccaggio utilizzando una colonna di filtrazione in gel.
14. Concentrare lo stock di RpoD utilizzando un filtro centrifugo a taglio 10 kDa ad una concentrazione di 0,2-0,8 mg/ml determinata mediante spettrofotometria.
15. Aliquot RpoD immagazzina a volumi di 20-50 μL in provette per PCR e conservata a -80 °C.

3. Preparazione del modello di DNA stock

1. La PCR amplifica la regione di 500 bp che circonda un sito di promotore guidato da RpoD dal DNA genomico di B. burgdorferi utilizzando una reazione di 200 μL (Tabella 3).
2. Purificare i prodotti PCR utilizzando un kit di purificazione PCR commerciale. Eluire il DNA in biologia molecolare grado H₂O.
3. Regolare la concentrazione molare dei modelli di DNA generati dalla PCR a 100 nM mediante diluizione in biologia molecolare di grado H₂O.

4. Eseguire trascrizioni in vitro con l'incorporazione di nucleotidi radiomarcati

1. Preparare un piano sperimentale di trascrizione in vitro . Determinare le concentrazioni di RNA polimerasi, RpoD e DNA modello. Determinare i volumi delle aliquote e gli ordini di pipettaggio per i tubi di reazione. Vedere la Tabella 4 e la Figura 1 per un esempio.
   NOTA: includere controlli nel piano sperimentale, ad esempio reazioni che non contengono RNA polimerasi, polimerasi alternativa, nessun modello o modelli alternativi.
2. Calcolare il volume di ^α-32P-ATP richiesto per l'esperimento. Incorporare questo nel piano sperimentale. Tipicamente, includere 2 μCi di attività per reazione di trascrizione in vitro per il rilevamento dello schermo al fosforo.
3. Preparare le superfici di lavoro, compreso il banco di radiazione, per ridurre il rischio di contaminazione da radiazioni.
4. Scongelare aliquote fresche di RNA polimerasi, Rpo, 5x buffer NTP e soluzioni stock modello su ghiaccio. Mescolare accuratamente tutte le scorte congelate prima del pipettaggio.
5. Preparare una miscela di reazione principale e una miscela NTP separata per nucleotidi radiomarcati secondo il piano sperimentale.
6. Erogare le reazioni di controllo e i set sperimentali in provette PCR in preparazione dell'aggiunta di radiomarcatura nella reazione. Erogare delicatamente H₂O, master mix di reazione, RNA polimerasi e RpoD in apposite provette per PCR e miscelare mediante pipettaggio.
7. Trasferire i materiali preparati in un banco di radiazioni.
8. Aggiungere ^{α-32 P-ATP}a NTP e mescolare con pipettaggio delicato.
   ATTENZIONE: Quando si lavora con materiale radioattivo, utilizzare dispositivi di protezione appropriati e procedure di manipolazione per gli isotopi radioattivi.
9. Aggiungere NTP alle provette contenenti le miscele di reazioni di trascrizione in vitro del punto 4.6.
10. Avviare la reazione di trascrizione in vitro con l'aggiunta di un modello di DNA. Mescolare il volume di reazione mediante pipettaggio delicato.
11. Incubare tubi a 37 °C per 5 minuti in un termociclatore o blocco termico.
12. Rimuovere le reazioni dal termociclatore o dal blocco termico e aggiungere il colorante di carico 2x RNA contenente il 50% di formammide a un volume di reazione uguale per interrompere le reazioni di trascrizione in vitro .
13. Denaturare gli enzimi incubando le reazioni a 65 °C per 5 minuti in un termociclatore o blocco termico.
14. Separare l'RNA nella miscela di reazione di trascrizione in vitro mediante elettroforesi su gel utilizzando gel di poliacrilammide urea TBE al 10%-15% a 180 V per 30-45 min.
    NOTA: A seconda delle condizioni di elettroforesi del gel, la soluzione tampone può essere contaminata da nucleotidi radiomarcati o il gel può contenere la maggior parte o tutti i nucleotidi radiomarcati. Pianificare una corretta conservazione o smaltimento della radioattività.
15. Immagine dell'RNA radiomarcato utilizzando phosphoscreen dopo aver rimosso qualsiasi porzione del gel contenente ATP radiomarcato non incorporato. Esporre il gel al fosfoschermo durante la notte (16 ore) e l'immagine utilizzando un imager fosfoscreen (risoluzione 100 μm, tensione del tubo PMT 700 V).
16. Analizzare i dati utilizzando metodi densitometrici²⁴.

Risultati

In una reazione di trascrizione in vitro in cui la fase limitante della reazione è l'inizio della trascrizione mediata dal fattore sigma, l'attività di trascrizione dovrebbe aumentare linearmente con la quantità di fattore sigma. Presentiamo la preparazione di esperimenti di trascrizione in vitro testando una gamma di concentrazioni di RpoD insieme a due concentrazioni di RNA polimerasi per osservare il segnale variabile risultante dall'incorporazione di nucleotidi radiomarcati nei prodotti di RNA. V...

Discussione

I saggi di trascrizione in vitro costruiti utilizzando il protocollo presentato sono stati recentemente utilizzati per studiare il ruolo di un fattore di trascrizione in B. burgdorferi e possono essere applicati per costruire esperimenti simili utilizzando altri fattori di trascrizione, fattori sigma e molecole²³. Una volta ottenuta la RNA polimerasi attiva da B. burgdorferi e rilevata la sua attività, i componenti e le condizioni all'interno dei saggi di trascrizione <...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.45 micron syringe filter	Thermo Scientific	726-2545	Step 1.7 and 2.3
50 mL conical tubes	MidSci	C50B	Step 1.3, and subsequent steps
50 mL high-speed centrifuge tubes	Thermo Scientific	3119-0050PK	Step 1.2
500 mL Centrifuge bottles	Thermo Scientific	3120-9500PK	Step 1.1
B-PER and instruction manual	Thermo Scientific	78248	Step 1.4 and 2.2
Calcium chloride	Fisher Scientific	10035-04-8	Step 2.6
Centrifugal filters 10 Kd cutoff	Millipore Sigma	UFC8010	Step 1.11 and 2.11
Cobalt resin and instruction manual	Thermo Scientific	89969	Step 1.9
Dithiothreitol	Acros Organics	426380500	Step 1.4 and subsequent steps
Dnase (Nuclease)	Millipore Sigma	70746	Step 1.4 and 2.2
Factor Xa Protease	Haematologic Technologies	HCXA-0060	Step 2.6
GE Typhoon 5 Phosphoimager	GE lifesciences	Multiple	Step 4.15
Gel Imager	Bio-Rad	Mutiple	Step 1.13 and subsequent protien quality check steps
H2O for in vitro transcription	Fisher Scientific	7732-18-5	Step 3.2 and 3.3
high fidelity PCR kit	New England Biolabs	M0530S	Step 3.1
High-speed centrifuge	Eppendorf		Step 1.1, and subsequent steps
HiTrap Heparin HP 5 x 1 mL	Cytiva Life Sciences	17040601	Step 2.8
Imidazole	Sigma-Aldrich	56750-100G	Step 1.9
Lysozyme	Thermo Scientific	90082	Step 1.4 and 2.2
Magnesium chloride	Fisher Scientific	S25401	Step 4.1
Manganese chloride	Fisher Scientific	S25418	Step 4.1
Mini protean tetra cell	Bio-Rad	Mutiple	Step 1.13 and subsequent protien quality check steps
NP-40	Thermo Scientific	85124	Step 4.1
NTP mixture	Thermo Scientific	R0481	Step 4.1
PCR purification kit	Qiagen	28506	Step 3.2
PCR tubes	MidSci	PR-PCR28ACF	Step 1.12
PD-10 Sephadex buffer exchange column and instruction manual	Cytiva	17085101	Step 1.10 and 2.10 (gel filtration column)
pMAL Protein Fusion and Purification System Instruction manual	New England Biolabs	E8200S	Step 2.1
Polyacrylamide gels AnyKD	Bio-Rad	456-8125	Step 1.13 and subsequent protien quality check steps
Potassium glutamate	Sigma-Aldrich	G1251	Step 4.1
Protease inhibitor	Thermo Scientific	78425	Step 1.4 and 2.2
Radiolabeled ATP	Perkin Elmer	BLU503H	Step 4.2
RNA Loading Dye, (2x)	New England Biolabs	B0363S	Step 4.13
Rnase inhibitor	Thermo Scientific	EO0381	Step 4.1
Spectrophotometer	Biotek	Mutiple	Step 1.13 and subsequent protien quality check steps
TBE-Urea gels 10 percent	Bio-Rad	4566033	Step 4.14