ボレリエラ(ボレリア)ブルグドルフェリの必須成分 in vitro転写アッセイ

要約

インビトロ 転写アッセイは、 ボレリエラ・ブルグドルフェリにおける転写調節のメカニズムを解読することができる。このプロトコルでは、 B. burgdorferi RNAポリメラーゼを精製し、 in vitro 転写反応を実行する手順について説明します。 in vitro 転写アッセイを用いた実験的アプローチでは、活性RNAポリメラーゼの信頼性の高い精製と保存が必要です。

要約

ボレリエラ・ブルグドルフェリは、代謝およびゲノムレパートリーが限られている細菌性病原体です。B. burgdorferiは脊椎動物とマダニの間を細胞外に通過し、感染中に異なる環境で生き残るためにその転写プロファイルを劇的に再構築します。B. burgdorferi研究の焦点は、細菌が転写変化を通じてその環境にどのように反応するかを明確に理解することです。in vitro転写アッセイは、転写調節の基本的なメカニズムを生化学的に解剖することを可能にします。ここでは、B. burgdorferi RNAポリメラーゼの精製と保存、シグマ因子の精製、DNAテンプレートの生成、およびin vitro転写アッセイを説明する詳細なプロトコルを紹介します。このプロトコルは、B. burgdorferi 5A4 RpoC-His(5A4-RpoC)から精製されたRNAポリメラーゼの使用を記載している。5A4-RpoCは、RNAポリメラーゼの最大サブユニットをコードするrpoC遺伝子に10XHisタグを有する、以前に発表された株です。インビトロ転写アッセイは、株5A4-RpoCから精製されたRNAポリメラーゼ、ハウスキーピングシグマ因子RpoDの組換えバージョン、およびPCRで生成された二本鎖DNAテンプレートで構成されています。in vitro転写アッセイを組み立てるためのタンパク質精製技術とアプローチは概念的によく理解されており、比較的一般的ですが、RNAポリメラーゼの取り扱いに関する考慮事項は生物ごとに異なることがよくあります。ここで紹介するプロトコルは、B. burgdorferi RNAポリメラーゼの酵素研究用に設計されています。この方法は、RNAポリメラーゼの活性に対する転写因子、プロモーター、および翻訳後修飾の役割を試験するために適合させることができる。

概要

ライム病と再発熱は、ボレリア属とボレリエラ^属のスピロヘータ病原体によって引き起こされます^1,2,3。ライム病は北米で著名なベクター媒介性疾患であり、その結果、ボレリエラ・ブルグドルフェリはスピロヘータ生物学を研究するための著名なモデル生物です^4,5。B. burgdorferiの転写調節機構の調査は、ダニベクターと哺乳類宿主の間を循環する際の環境の変化への適応をよりよく理解することを目的としています^6,7。pH、温度、浸透圧、栄養素の利用可能性、短鎖脂肪酸、有機酸、溶存酸素および二酸化炭素レベルの変化は、B. burgdorferiがその節足動物ベクターで生存し、動物に感染するために重要な遺伝子の発現を調節します8,9,10,11,12,13,14,15^、16、^17、18。刺激に対するこれらの反応を調節メカニズムと結びつけることは、B. burgdorferi研究の重要な側面でした¹⁹。

転写因子とシグマ因子は、細胞プロセスを実行する遺伝子の転写を制御します。ライムと再発熱のスピロヘータは、比較的まばらな転写因子と代替シグマ因子のセットを持っています。それにもかかわらず、環境に対するB.ブルグドルフェリ応答を指示する複雑な転写変化があります^20,21,22。環境変化に応答してB. burgdorferiの転写変化を引き起こす特定のメカニズムは不明のままである。in vitro転写アッセイは、転写因子およびシグマ因子の機能と調節機構をアッセイするための生化学的アプローチを採用するための強力なツールです²³、²⁴、^25、26。

B. burgdorferi RNAポリメラーゼを用いたin vitro転写アッセイ系が最近確立されました²⁴。細菌はしばしば独特の細胞生理学を持っているので、異なる種と属のRNAポリメラーゼは、酵素精製、酵素貯蔵、および反応緩衝条件に対して異なる反応を示します²⁷。B. burgdorferiはまた、RNAポリメラーゼが研究されている多くの細菌種から遺伝的に離れています²⁰。溶解、洗浄、および溶出バッファー条件、保存バッファー、in vitro転写反応バッファー、およびアッセイ構築方法などの酵素調製の態様はすべて、RNAポリメラーゼ活性を変化させる可能性があります。ここでは、RNAポリメラーゼとシグマ因子RpoDの精製、線状二本鎖DNAテンプレートの作成、およびこのシステムを使用するラボ間の再現性を促進するためのin vitro転写アッセイの構築のためのプロトコルを提供します。RpoD依存性転写の線形範囲を実証するために反応例を詳述し、このアプローチの限界と代替案について説明します。

プロトコル

1. RNAポリメラーゼの精製とRNAポリメラーゼ原液の調製

1. 前述の細胞収集プロトコル^28,29を使用して、微好気性環境(34°C、5%CO2、3%_O2)でBSKII培地で培養した2〜4 LのB.ブルグドルフェリRpoC-His10Xから2〜4 x 10⁷細胞/ mLの密度まで細胞ペレットを収集します。500 mL遠心ボトルで10,000 x g、4°Cで30分間遠心分離を行い、上清を注ぎます。
2. 細胞を30 mLの氷冷HNバッファー(10 mM HEPES、10 mM NaCl、pH 8.0)に再懸濁します。50mL遠沈管を用いて上記のような遠心分離工程を繰り返し、上清をデカントする。
   注意: 停止点。細胞ペレットを-80°Cで凍結して細胞を最大2週間保存するか、すぐに細胞溶解に進みます。
3. 凍結しない限り、細胞、ライセート、および精製タンパク質を4°Cまたは氷上で維持します。このプロトコルで使用するすべてのバッファーに2 mMの濃度で新たに調製したDTTを添加してRNAポリメラーゼを還元環境に保ち、pH 8.0を維持します。
4. B. burgdorferi細胞ペレットから、キットの指示に従って市販の細菌溶解キットを使用してライセートを調製します。プロテアーゼ阻害剤を含まない10〜15 mLの室温(RT)B-PER溶液にペレットを再懸濁し、氷上で5分間溶解を進行させます。溶解量は、キットの説明に記載されているように、細胞ペレットのサイズによって異なります。
5. プロテアーゼ阻害剤カクテルを溶解溶液に加え、続いて代表的な結果のセクションに記載されているように超音波処理の3ラウンドを行います。
   注:あるいは、前述のようにフレンチプレッシャーセルで細胞を溶解します²⁴。手順 1.4 をスキップします。およびステップ1.5。
6. 遠心分離および50 mL遠沈管を使用したろ過を使用して細胞ライセートを清澄化します。溶液にコバルトカラムローディングバッファー(表1)を加えて、チューブの容量を少なくとも全容量30 mLまで満たします。細胞残渣を20,000 x g で30分間遠心分離してペレット化します。
7. 0.45 μmシリンジフィルターを使用して上清をろ過します。
8. ライセートをコバルトカラムローディングバッファー(表1)で1:10の最終希釈比で希釈します。
9. 製造元の指示に従って、コバルトまたはニッケル樹脂カラムを使用して、清澄化された細胞ライセート上清に対してアフィニティークロマトグラフィーを実行します。例については、代表的な結果のセクションを参照してください。 表 1 にリストされているバッファーを使用します。分析のためにフロースルー、洗浄、および溶出サンプルを収集します。
10. 溶出バッファー溶液中のRNAポリメラーゼを、製造元の指示に従ってバッファー交換カラムを使用して、直ちにRNAポリメラーゼ保存バッファー溶液(表1)に交換します。
11. 10 kDaカットオフ遠心フィルターユニットを使用してRNAポリメラーゼを分光光度法で測定された0.2〜0.4 mg / mLの濃度に濃縮することにより、フリーザーストックを準備します(吸光係数調整なしの_280nm [1 cm = 1 mg·^mL-1で1 abs])。
12. RNAポリメラーゼフリーザーは、PCRチューブに20〜50 μLの容量でストックし、RNAポリメラーゼを-80°Cで保存します。
13. SDS-PAGEでアフィニティークロマトグラフィーの品質を測定し、分光光度法またはBCAアッセイで総タンパク質収量を測定します。サンプルを7.5%ポリアクリルアミドゲル上で120 Vで50分間実行し、SDS-PAGEによる良好な分離を実現します。

2. 組換えRpoDの精製とRpoDストックの調製

1. マルトース結合タンパク質タグ付き組換え B.ブルグドルフェリ RpoD(MBP-RpoD)をBL21::MBP-RpoD_Bbで培養および発現誘導し、 材料表に記載されているタンパク質融合精製システム取扱説明書に記載されているように、遠心分離により細胞を回収した。
   注意: 停止点。細胞ペレットを-80°Cで凍結して細胞を最大2週間保存するか、すぐに細胞溶解に進みます。
2. 市販の細菌細胞溶解キットまたはフレンチプレッシャーセルを使用して溶解を行います。 表1の溶解バッファーの例を参照してください。
3. 遠心分離とろ過を使用して細胞ライセートを清澄化します。細胞残渣を20,000 x g で30分間遠心分離してペレット化します。0.45 μmのフィルターを用いて上清をろ過します。
4. 発現系用のタンパク質抽出プロトコルを用いてMBP-RpoDを抽出します。実装の詳細と結果の例については、代表的な結果のセクションを参照してください。
5. SDS-PAGEによるアフィニティークロマトグラフィープロセスおよび溶出の品質を決定し、分光光度法(吸光係数調整なしの_280nm [1 cmで1 abs = 1 mg·mL⁻¹])によってタンパク質収量を測定します。SDS-PAGEで分離するために、10%ポリアクリルアミドゲルを200Vで30分間使用します。
6. 10 kDaカットオフ遠心フィルターを使用してMBP-RpoDを吸光光度法で測定した>2 mg/mLの濃度に濃縮します。
7. 第Xa因子切断部位でRpoDからMBPを切断します。MBP-RpoDを2 mMの濃度で含むアフィニティークロマトグラフィー溶出画分に_CaCl2 を添加します。精製タンパク質30 mgごとに200 μgの第Xa因子プロテアーゼを添加します。RTで一晩インキュベートします。
8. SDS-PAGEによってRpoDからのMBPの完全な切断を確認します。SDS-PAGEで分離するために、10%ポリアクリルアミドゲルを200Vで30分間使用します。
9. MBPおよびRpoD含有溶液をヘパリン結合バッファーで1:10の比率で希釈します。
10. ヘパリンカラム上のMBPとRpoDをFPLCで分離します。FPLC の設定については、 表 2 を参照してください。
11. SDS-PAGEでアフィニティークロマトグラフィー産物の品質を測定し、分光光度法でタンパク質収量を測定します。SDS-PAGEで分離するために、10%ポリアクリルアミドゲルを200Vで30分間使用します。
12. 10 kDaカットオフ遠心フィルターを使用してRpoDを含む溶出画分を最終容量2〜3 mLまで濃縮します。
13. 濃縮されたRpoD溶出画分をゲルろ過カラムを用いて保存バッファーに交換するバッファー。
14. 10 kDaカットオフ遠心フィルターを使用してRpoDストックを、分光光度法で測定した濃度0.2〜0.8 mg/mLに濃縮します。
15. PCRチューブに20〜50 μLの容量でRpoDストックを分注し、-80°Cで保存します。

3. DNAテンプレートストックの調製

1. PCRは、200 μLの反応を用いて、 B. burgdorferi ゲノムDNAからRpoD駆動プロモーター部位を囲む500 bp領域を増幅します(表3)。
2. 市販のPCR精製キットを用いてPCR産物を精製する。分子生物学グレードH₂OでDNAを溶出します。
3. PCRで生成されたDNAテンプレートのモル濃度を分子生物学グレード_H2Oで希釈して100nMに調整します。

4.放射性標識ヌクレオチドを組み込んだ in vitro 転写を行う

1. インビトロ転写実験計画を準備します。RNAポリメラーゼ、RpoD、およびDNAテンプレートの濃度を決定します。反応チューブのアリコート量とピペッティング順序を決定します。例については、表 4 および 図 1 を参照してください。
   注:RNAポリメラーゼを含まない反応、代替ポリメラーゼ、テンプレートなし、または代替テンプレートを含む反応など、実験計画にコントロールを含めます。
2. 実験に必要な^α-32P-ATPの量を計算します。これを実験計画に組み込みます。典型的には、蛍光体スクリーン検出のための in vitro 転写反応あたり2 μCiの活性を含む。
3. 放射線汚染のリスクを減らすために、放射線ベンチを含む作業面を準備します。
4. RNAポリメラーゼ、Rpo、5xバッファーNTP、およびテンプレートストック溶液の新鮮なアリコートを氷上で解凍します。ピペッティングの前に、解凍したすべての冷凍ストックを完全に混合します。
5. 実験計画に従って、放射性標識ヌクレオチド用のマスター反応混合物と別のNTP混合物を調製します。
6. コントロール反応と実験セットをPCRチューブに分注し、反応に放射性標識を追加する準備をします。H₂O、反応マスターミックス、RNAポリメラーゼ、およびRpoDを指定されたPCRチューブに穏やかに分注し、ピペッティングで混合します。
7. 準備した材料を放射線ベンチに移します。
8. ^{α-32 P-ATP}をNTPに加え、穏やかにピペッティングして混合します。
   注意: 放射性物質を取り扱うときは、放射性同位元素の適切な保護具と取り扱い手順を使用してください。
9. ステップ4.6の in vitro 転写反応混合物を含むチューブにNTPを追加します。
10. DNAテンプレートを添加して in vitro 転写反応を開始します。穏やかにピペッティングして反応量を混合します。
11. チューブをサーモサイクラーまたはヒートブロックで37°Cで5分間インキュベートします。
12. サーモサイクラーまたはヒートブロックから反応物を取り除き、50%ホルムアミドを含む2x RNAローディング色素を等しい反応量まで添加して、 in vitro 転写反応を停止します。
13. サーモサイクラーまたはヒートブロックで65°Cで5分間反応をインキュベートすることにより、酵素を変性させます。
14. 10%〜15%TBE尿素ポリアクリルアミドゲルを180Vで30〜45分間使用したゲル電気泳動により、 in vitro 転写反応混合物中のRNAを分離します。
    注:ゲル電気泳動条件によっては、緩衝液が放射性標識ヌクレオチドで汚染されているか、ゲルに放射性標識ヌクレオチドのほとんどまたはすべてが含まれている場合があります。適切な放射能の保管または廃棄を計画します。
15. 取り込まれていない放射性標識ATPを含むゲルの任意の部分を除去した後にホスホスクリーンを使用して放射性標識RNAを画像化する。ゲルをホスホスクリーンに一晩(16時間)さらし、フォスフォスクリーンイメージャー(解像度100 μm、チューブ電圧700 V PMT)を使用して画像化します。
16. デンシトメトリー法を使用してデータを分析します²⁴.

結果

反応の制限段階がシグマ因子を介した転写開始である in vitro 転写反応では、転写活性はシグマ因子の量とともに直線的に増加するはずです。RNA産物への放射性標識ヌクレオチドの取り込みから生じる変化するシグナルを観察するために、2つの濃度のRNAポリメラーゼとともにさまざまなRpoD濃度をテストする in vitro 転写実験の準備を紹介します。RNAポリメラーゼ、RpoD、および二?...

ディスカッション

提示されたプロトコルを使用して構築されたインビトロ転写アッセイは、最近、B. burgdorferiにおける転写因子の役割を研究するために使用され、他の転写因子、シグマ因子、および分子を使用して同様の実験を構築するために適用できます²³。B. burgdorferiから活性RNAポリメラーゼが得られ、その活性が検出されると、in vitro転写アッセイ内の成分お?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.45 micron syringe filter	Thermo Scientific	726-2545	Step 1.7 and 2.3
50 mL conical tubes	MidSci	C50B	Step 1.3, and subsequent steps
50 mL high-speed centrifuge tubes	Thermo Scientific	3119-0050PK	Step 1.2
500 mL Centrifuge bottles	Thermo Scientific	3120-9500PK	Step 1.1
B-PER and instruction manual	Thermo Scientific	78248	Step 1.4 and 2.2
Calcium chloride	Fisher Scientific	10035-04-8	Step 2.6
Centrifugal filters 10 Kd cutoff	Millipore Sigma	UFC8010	Step 1.11 and 2.11
Cobalt resin and instruction manual	Thermo Scientific	89969	Step 1.9
Dithiothreitol	Acros Organics	426380500	Step 1.4 and subsequent steps
Dnase (Nuclease)	Millipore Sigma	70746	Step 1.4 and 2.2
Factor Xa Protease	Haematologic Technologies	HCXA-0060	Step 2.6
GE Typhoon 5 Phosphoimager	GE lifesciences	Multiple	Step 4.15
Gel Imager	Bio-Rad	Mutiple	Step 1.13 and subsequent protien quality check steps
H2O for in vitro transcription	Fisher Scientific	7732-18-5	Step 3.2 and 3.3
high fidelity PCR kit	New England Biolabs	M0530S	Step 3.1
High-speed centrifuge	Eppendorf		Step 1.1, and subsequent steps
HiTrap Heparin HP 5 x 1 mL	Cytiva Life Sciences	17040601	Step 2.8
Imidazole	Sigma-Aldrich	56750-100G	Step 1.9
Lysozyme	Thermo Scientific	90082	Step 1.4 and 2.2
Magnesium chloride	Fisher Scientific	S25401	Step 4.1
Manganese chloride	Fisher Scientific	S25418	Step 4.1
Mini protean tetra cell	Bio-Rad	Mutiple	Step 1.13 and subsequent protien quality check steps
NP-40	Thermo Scientific	85124	Step 4.1
NTP mixture	Thermo Scientific	R0481	Step 4.1
PCR purification kit	Qiagen	28506	Step 3.2
PCR tubes	MidSci	PR-PCR28ACF	Step 1.12
PD-10 Sephadex buffer exchange column and instruction manual	Cytiva	17085101	Step 1.10 and 2.10 (gel filtration column)
pMAL Protein Fusion and Purification System Instruction manual	New England Biolabs	E8200S	Step 2.1
Polyacrylamide gels AnyKD	Bio-Rad	456-8125	Step 1.13 and subsequent protien quality check steps
Potassium glutamate	Sigma-Aldrich	G1251	Step 4.1
Protease inhibitor	Thermo Scientific	78425	Step 1.4 and 2.2
Radiolabeled ATP	Perkin Elmer	BLU503H	Step 4.2
RNA Loading Dye, (2x)	New England Biolabs	B0363S	Step 4.13
Rnase inhibitor	Thermo Scientific	EO0381	Step 4.1
Spectrophotometer	Biotek	Mutiple	Step 1.13 and subsequent protien quality check steps
TBE-Urea gels 10 percent	Bio-Rad	4566033	Step 4.14