Borreliella (Borrelia) burgdorferi의 필수 성분 In Vitro Transcription Assays

요약

시험관 내 전사 분석은 Borreliella burgdorferi의 전사 조절 메커니즘을 해독할 수 있습니다. 이 프로토콜은 B. burgdorferi RNA 중합효소를 정제하고 시험관 내 전사 반응을 수행하는 단계를 설명합니다. 시험관 전사 분석을 사용하는 실험적 접근법은 활성 RNA 중합효소의 신뢰할 수 있는 정제 및 보관을 필요로 합니다.

초록

Borreliella burgdorferi 는 대사 및 게놈 레퍼토리가 제한된 박테리아 병원체입니다. B. burgdorferi 는 척추동물과 진드기 사이를 세포 외로 이동하며 감염 시 이질적인 환경에서 생존하기 위해 전사 프로필을 극적으로 개조합니다. B. burgdorferi 연구의 초점은 박테리아가 전사 변화를 통해 환경에 어떻게 반응하는지 명확하게 이해하는 것입니다. 시험관 내 전사 분석을 통해 전사 조절의 기본 메커니즘을 생화학적으로 해부할 수 있습니다. 여기에서 우리는 B. burgdorferi RNA 중합효소 정제 및 저장, 시그마 인자 정제, DNA 템플릿 생성 및 시험관 내 전사 분석을 설명하는 자세한 프로토콜을 제시합니다. 상기 프로토콜은 B. burgdorferi 5A4 RpoC-His(5A4-RpoC)로부터 정제된 RNA 중합효소의 사용을 설명한다. 5A4-RpoC는 RNA 중합효소의 가장 큰 서브유닛을 코딩하는 rpoC 유전자에 10XHis-태그를 보유하는 이전에 발표된 균주입니다. 시험관내 전사 분석은 균주 5A4-RpoC로부터 정제된 RNA 중합효소, 하우스키핑 시그마 인자 RpoD의 재조합 버전 및 PCR 생성 이중 가닥 DNA 템플릿으로 구성됩니다. 체외 전사 분석을 조립하기 위한 단백질 정제 기술 및 접근 방식은 개념적으로 잘 알려져 있고 비교적 일반적이지만, RNA 중합효소에 대한 취급 고려 사항은 종종 유기체마다 다릅니다. 여기에 제시된 프로토콜은 B. burgdorferi RNA 중합효소에 대한 효소 연구를 위해 설계되었습니다. 상기 방법은 RNA 중합효소의 활성에 대한 전사 인자, 프로모터 및 번역후 변형의 역할을 시험하기 위해 적응될 수 있다.

서문

라임병과 재발열은 Borrelia 및 Borreliella 속의 스피로헤타 병원 균에 의해 발생합니다 1,2,3. 라임병은 북미에서 두드러진 매개체 매개 질병이며, 결과적으로 Borreliella burgdorferi는 스피로헤타 생물학을 연구하는 저명한 모델 유기체입니다 ^4,5. 전사 조절의 B. burgdorferi 메커니즘에 대한 조사는 진드기 벡터와 포유류 숙주 사이를 순환할 때 환경 변화에 대한 적응을 더 잘 이해하는 것을 목표로 합니다 ^6,7. pH, 온도, 삼투압, 영양소 가용성, 단쇄 지방산, 유기산, 용존 산소 및 이산화탄소 수준의 변화는 B. burgdorferi가 절지동물 벡터에서 생존하고 동물을 감염시키는 데 중요한 유전자의 발현을 조절합니다 8,9,10,11,12,13,14,15^,16,17,18. 자극에 대한 이러한 반응을 조절 메커니즘과 연결하는 것은 B. burgdorferi 연구¹⁹의 중요한 측면이었습니다.

전사 인자와 시그마 인자는 세포 과정을 수행하는 유전자의 전사를 조절합니다. 라임과 재발열 스피로헤타에는 비교적 희박한 전사 인자와 대체 시그마 인자 세트가 있습니다. 그럼에도 불구하고 B. burgdorferi가 환경에 대한 반응을 지시하는 복잡한 전사 변화가 있습니다^20,21,22. 환경 변화에 대한 반응으로 B. burgdorferi의 전사 변화를 유도하는 구체적인 메커니즘은 아직 명확하지 않습니다. 시험관 내 전사 분석은 전사 인자 및 시그마 인자^23,24,25,26의 기능 및 조절 메커니즘을 분석하기 위해 생화학적 접근법을 사용하기 위한 강력한 도구입니다.

B. burgdorferi RNA 중합효소를 이용한 시험관 전사 분석 시스템이 최근에 확립되었다²⁴. 박테리아는 종종 독특한 세포 생리학을 가지고 있기 때문에 다른 종과 속의 RNA 중합효소는 효소 정제, 효소 저장 및 반응 완충 조건에 다르게 반응합니다²⁷. B. burgdorferi는 또한 RNA 중합효소가 연구된 많은 박테리아 종과 유전적으로 거리가 멀다²⁰. 용해, 세척 및 용출 완충액 조건, 저장 완충액, 시험관내 전사 반응 완충액 및 분석 구축 방법과 같은 효소 준비의 측면은 모두 RNA 중합효소 활성을 변경할 수 있습니다. 여기에서 우리는 RNA 중합효소 및 시그마 인자 RpoD의 정제, 선형 이중 가닥 DNA 템플릿의 생산 및 이 시스템을 사용하는 실험실 간의 재현성을 용이하게 하기 위한 시험관 내 전사 분석의 구축을 위한 프로토콜을 제공합니다. RpoD 의존적 전사의 선형 범위를 보여주기 위한 반응의 예를 자세히 설명하고 이 접근 방식의 한계와 대안에 대해 논의합니다.

프로토콜

1. RNA 중합효소의 정제 및 RNA 중합효소 스톡의 제조

1. 미세호기성 환경(34°C, 5% CO 2, 3% O 2)에서 BSKII 배지에서 배양된 B. burgdorferi RpoC-His10X의 2-4L에서 이전에 설명한 세포 수집 프로토콜^28,29를 사용하여_2-4 x 10⁷ cells/mL의 밀도로 세포 펠릿을 수집합니다. 500mL 원심분리 병에서 4°C에서 10,000 x g에서 30분 동안 원심분리를 수행하고 상층액을 붓습니다.
2. 30mL의 빙냉 HN 완충액(10mM HEPES, 10mM NaCl, pH 8.0)에 세포를 재현탁합니다. 50 mL 원심분리 튜브를 이용하여 상기와 같이 원심분리 단계를 반복하고, 상층액을 경사 분리한다.
   알림: 정지 지점. 세포 펠릿을 -80°C에서 동결하여 최대 2주 동안 세포를 저장하거나 즉시 세포 용해를 진행합니다.
3. 세포, 용해물 및 정제된 단백질을 동결되지 않는 한 4°C 또는 얼음 위에 유지한다. 이 프로토콜에 사용된 모든 완충액에 2mM 농도로 새로 제조된 DTT를 첨가하여 RNA 중합효소를 환원 환경에 유지하고 pH 8.0을 유지합니다.
4. 키트 지침에 따라 상업용 박테리아 용해 키트를 사용하여 B. burgdorferi 세포 펠릿에서 용해물을 준비합니다. 프로테아제 억제제가 없는 실온(RT) B-PER 용액 10-15mL에 펠릿을 재현탁하고 얼음에서 5분 동안 용해를 진행합니다. 용해 부피는 키트 지침에 설명된 대로 세포 펠릿 크기에 따라 다릅니다.
5. 프로테아제 억제제 칵테일을 용해 용액에 첨가한 다음, 대표적인 결과 섹션에 설명된 대로 3라운드의 초음파 처리가 뒤따른다.
   알림: 또는 앞서 설명한 대로 프렌치 압력 셀에서 셀을 용해합니다²⁴. 1.4단계를 건너뜁니다. 및 1.5 단계.
6. 원심분리를 사용하여 세포 용해물을 정화하고 50mL 원심분리기 튜브를 사용하여 여과합니다. 용액에 코발트 컬럼 로딩 완충액(표 1)을 추가하여 튜브의 부피를 총 부피 30mL 이상으로 채웁니다. 세포 파편을 20,000 x g 에서 30분 동안 원심분리하여 펠릿화합니다.
7. 0.45μm 주사기 필터를 사용하여 상층액을 여과합니다.
8. 용해물을 코발트 컬럼 로딩 완충액(표 1)에서 1:10 최종 희석 비율로 희석합니다.
9. 제조업체의 지침에 따라 코발트 또는 니켈 수지 컬럼을 사용하여 정화된 세포 용해물 상청액에 대해 친화성 크로마토그래피를 수행합니다. 예제는 대표 결과 섹션을 참조하세요. 표 1에 나열된 버퍼를 사용합니다. 분석을 위해 flow-through, wash 및 elution 샘플을 수집합니다.
10. 용출 완충 용액의 RNA 중합효소를 제조업체의 지침에 따라 완충액 교환 컬럼을 사용하여 RNA 중합효소 저장 완충용액(표 1)으로 즉시 교환합니다.
11. 10kDa 컷오프 원심 필터 장치를 사용하여 RNA 중합효소를 분광광도법으로 측정한 농도 0.2-0.4mg/mL로 농축하여 냉동고 재고를 준비합니다(흡광 계수 조정 없이_280nm [1cm에서 1abs = 1mg·^mL-1]).
12. 분취량 RNA 중합효소 냉동고는 PCR 튜브에 20-50μL 용량으로 보관하고 RNA 중합효소를 -80°C에서 보관합니다.
13. SDS-PAGE에 의해 친화성 크로마토그래피의 품질을 결정하고, 분광광도법 또는 BCA 분석에 의해 총 단백질 수율을 측정한다. SDS-PAGE에 의한 우수한 분해능을 위해 120V에서 50분 동안 7.5% 폴리아크릴아미드 겔에서 샘플을 실행합니다.

2. 재조합 RpoD의 정제 및 RpoD 스톡의 제조

1. 배양 및 말토스 결합 단백질 태그된 재조합 B. burgdorferi RpoD(MBP-RpoD)의 발현을 BL21::MBP-RpoD_Bb에 기재된 바와 같이, 표 of Materials에 열거된 단백질 융합 및 정제 시스템 사용 설명서에 기재된 바와 같이, 원심분리를 통해 세포를 수집한다.
   알림: 정지 지점. 세포 펠릿을 -80°C에서 동결하여 최대 2주 동안 세포를 저장하거나 즉시 세포 용해를 진행합니다.
2. 상업용 박테리아 세포 용해 키트 또는 프렌치 압력 셀을 사용하여 용해를 수행합니다. 표 1의 용해 버퍼 예를 참조하십시오.
3. 원심분리 및 여과를 사용하여 세포 용해물을 정화합니다. 세포 파편을 20,000 x g 에서 30분 동안 원심분리하여 펠릿화합니다. 0.45 μm 필터를 사용하여 상청액을 여과합니다.
4. 발현 시스템에 대한 단백질 추출 프로토콜을 사용하여 MBP-RpoD를 추출합니다. 대표 결과 섹션(예: 구현 세부 정보 및 결과)을 참조하세요.
5. SDS-PAGE에 의한 친화성 크로마토그래피 공정 및 용출의 품질을 결정하고 분광광도법으로 단백질 수율을 측정합니다(흡광 계수 조정이 없는_280nm [1cm에서 1abs = 1mg·^mL-1]). SDS-PAGE에서 분리를 위해 200V에서 30분 동안 10% 폴리아크릴아미드 겔을 사용합니다.
6. MBP-RpoD를 10kDa 컷오프 원심 필터를 사용하여 분광 광도계로 측정한 >2mg/mL 농도로 농축합니다.
7. Factor Xa 절단 부위의 RpoD에서 MBP를 절단합니다. 2 mM의 농도로 MBP-RpoD를 함유하는 친화성 크로마토그래피 용출 분획에_CaCl2 를 첨가한다. 정제된 단백질 30mg당 200μg의 Factor Xa 프로테아제를 추가합니다. RT에서 하룻밤 동안 배양하십시오.
8. SDS-PAGE에 의해 RpoD에서 MBP의 완전한 분할을 확인합니다. SDS-PAGE에서 분리를 위해 200V에서 30분 동안 10% 폴리아크릴아미드 겔을 사용합니다.
9. MBP 및 RpoD 함유 용액을 헤파린 결합 완충액으로 1:10의 비율로 희석합니다.
10. FPLC에 의해 헤파린 컬럼에서 MBP와 RpoD를 분리합니다. FPLC 설정은 표 2 를 참조하십시오.
11. SDS-PAGE로 친화성 크로마토그래피 산물의 품질을 측정하고 분광광도법으로 단백질 수율을 측정한다. SDS-PAGE에서 분리를 위해 200V에서 30분 동안 10% 폴리아크릴아미드 겔을 사용합니다.
12. 10kDa-컷오프 원심분리 필터를 사용하여 RpoD를 포함하는 용출 분획을 2-3mL의 최종 부피로 농축합니다.
13. 농축된 RpoD 용출 분획을 겔 여과 컬럼을 사용하여 저장 완충액으로 완충액으로 완충액으로 교환한다.
14. 분광 광도계에 의해 결정된 바와 같이 10kDa 컷오프 원심 필터를 사용하여 0.2-0.8 mg/mL의 농도로 RpoD 스톡을 농축합니다.
15. 분취량 RpoD는 PCR 튜브에 20-50 μL 부피로 저장되며 -80 °C에서 보관됩니다.

3. DNA 주형 스톡 준비

1. PCR은 200 μL 반응을 사용하여 B. burgdorferi 게놈 DNA로부터 RpoD 구동 프로모터 부위를 둘러싸고 있는 500 bp 영역을 증폭합니다(표 3).
2. 상용 PCR 정제 키트를 사용하여 PCR 산물을 정제합니다. 분자 생물학 등급 H₂O에서 DNA를 용출합니다.
3. PCR에서 생성된 DNA 주형의 몰 농도를 분자생물학 등급_H2O로 희석하여 100 nM로 조정한다.

4. 방사성 표지 된 뉴클레오티드의 혼입으로 시험관 내 전사를 수행하십시오

1. 시험관 전사 실험 계획을 준비합니다. RNA 중합효소, RpoD 및 DNA 템플릿 농도를 결정합니다. 반응 튜브에 대한 분취량 부피와 피펫팅 순서를 결정합니다. 예를 들어 표 4와 그림 1을 참조하십시오.
   참고: RNA 중합효소, 대체 중합효소, 템플릿 없음 또는 대체 템플릿을 포함하지 않는 반응과 같은 대조군을 실험 계획에 포함합니다.
2. 실험에 필요한 ^α-32P-ATP의 부피를 계산합니다. 이것을 실험 계획에 통합하십시오. 전형적으로, 형광체화 검출을 위한 시험관내 전사 반응당 2 μCi의 활성을 포함한다.
3. 방사선 오염 위험을 줄이기 위해 방사선 벤치를 포함한 작업 표면을 준비하십시오.
4. RNA 중합효소, Rpo, 5x 완충액 NTP 및 템플릿 스톡 용액의 신선한 분취량을 얼음에서 해동합니다. 피펫팅하기 전에 해동된 모든 냉동 육수를 완전히 혼합하십시오.
5. 실험 계획에 따라 방사성 동위원소 동위원소 뉴클레오티드에 대한 마스터 반응 혼합물 및 별도의 NTP 혼합물을 제조한다.
6. 반응에 방사성 표지를 첨가하기 위해 대조 반응과 실험 세트를 PCR 튜브에 분배합니다. _H2O, 반응 마스터 믹스, RNA 중합효소 및 RpoD를 지정된 PCR 튜브에 부드럽게 분주하고 피펫팅으로 혼합합니다.
7. 준비된 재료를 방사선 벤치로 옮깁니다.
8. ^α-32P-ATP를 NTP에 넣고 부드러운 피펫팅으로 혼합합니다.
   주의 : 방사성 물질로 작업하는 동안 방사성 동위원소에 대한 적절한 보호 장비와 취급 절차를 사용하십시오.
9. 단계 4.6의 시험관내 전사 반응 혼합물을 포함하는 튜브에 NTP를 추가합니다.
10. DNA 주형의 추가로 시험관내 전사 반응을 시작한다. 부드럽게 피펫팅하여 반응 부피를 혼합합니다.
11. 37°C에서 5분 동안 열순환기 또는 열 블록에서 튜브를 배양합니다.
12. 열순환기 또는 열 블록에서 반응을 제거하고 50% 포름아미드를 함유한 2x RNA 로딩 염료를 동일한 반응 부피에 추가하여 시험관 내 전사 반응을 중지합니다.
13. 65°C에서 5분 동안 열순환기 또는 열 블록에서 반응을 배양하여 효소를 변성시킵니다.
14. 180V에서 30-45분 동안 10%-15% TBE 요소 폴리아크릴아미드 겔을 사용하여 겔 전기영동에 의해 시험관 내 전사 반응 혼합물에서 RNA를 분리합니다.
    참고 : 겔 전기 영동 조건에 따라, 완충 용액은 방사성 표지 된 뉴클레오티드로 오염 될 수 있거나 겔은 방사성 표지 된 뉴클레오티드의 대부분 또는 전부를 함유 할 수있다. 적절한 방사능 저장 또는 폐기를 계획하십시오.
15. 통합되지 않은 방사성 표지 ATP를 함유하는 겔의 임의의 부분을 제거한 후 포스 포 스크린을 사용하여 방사성 표지 된 RNA를 이미지화한다. 겔을 포스포스크린에 밤새도록(16시간) 노출시키고 포스포스크린 이미저(100μm 분해능, 700V PMT 튜브 전압)를 사용하여 이미지화합니다.
16. 밀도 측정 방법²⁴를 사용하여 데이터 분석.

결과

반응의 제한 단계가 시그마 인자-매개 전사 개시인 시험관내 전사 반응에서, 전사 활성은 시그마 인자의 양에 따라 선형적으로 증가해야 한다. 우리는 RNA 산물에 방사성 표지 된 뉴클레오티드 결합의 결과적인 다양한 신호를 관찰하기 위해 두 가지 농도의 RNA 중합 효소와 함께 다양한 RpoD 농도를 테스트하는 시험관 내 전사 실험의 준비를 제시합니다. RNA 중합효소, RpoD, 및 이중-가닥 D...

토론

제시된 프로토콜을 사용하여 구성된 시험관 내 전사 분석은 최근 B. burgdorferi에서 전사 인자의 역할을 연구하는 데 사용되었으며 다른 전사 인자, 시그마 인자 및 분자²³을 사용하여 유사한 실험을 구축하는 데 적용될 수 있습니다. B. burgdorferi의 활성 RNA 중합효소를 얻고 그 활성이 검출되면 시험관 내 전사 분석 내의 구성 요소 및 조건을 수정할 수 있습...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.45 micron syringe filter	Thermo Scientific	726-2545	Step 1.7 and 2.3
50 mL conical tubes	MidSci	C50B	Step 1.3, and subsequent steps
50 mL high-speed centrifuge tubes	Thermo Scientific	3119-0050PK	Step 1.2
500 mL Centrifuge bottles	Thermo Scientific	3120-9500PK	Step 1.1
B-PER and instruction manual	Thermo Scientific	78248	Step 1.4 and 2.2
Calcium chloride	Fisher Scientific	10035-04-8	Step 2.6
Centrifugal filters 10 Kd cutoff	Millipore Sigma	UFC8010	Step 1.11 and 2.11
Cobalt resin and instruction manual	Thermo Scientific	89969	Step 1.9
Dithiothreitol	Acros Organics	426380500	Step 1.4 and subsequent steps
Dnase (Nuclease)	Millipore Sigma	70746	Step 1.4 and 2.2
Factor Xa Protease	Haematologic Technologies	HCXA-0060	Step 2.6
GE Typhoon 5 Phosphoimager	GE lifesciences	Multiple	Step 4.15
Gel Imager	Bio-Rad	Mutiple	Step 1.13 and subsequent protien quality check steps
H2O for in vitro transcription	Fisher Scientific	7732-18-5	Step 3.2 and 3.3
high fidelity PCR kit	New England Biolabs	M0530S	Step 3.1
High-speed centrifuge	Eppendorf		Step 1.1, and subsequent steps
HiTrap Heparin HP 5 x 1 mL	Cytiva Life Sciences	17040601	Step 2.8
Imidazole	Sigma-Aldrich	56750-100G	Step 1.9
Lysozyme	Thermo Scientific	90082	Step 1.4 and 2.2
Magnesium chloride	Fisher Scientific	S25401	Step 4.1
Manganese chloride	Fisher Scientific	S25418	Step 4.1
Mini protean tetra cell	Bio-Rad	Mutiple	Step 1.13 and subsequent protien quality check steps
NP-40	Thermo Scientific	85124	Step 4.1
NTP mixture	Thermo Scientific	R0481	Step 4.1
PCR purification kit	Qiagen	28506	Step 3.2
PCR tubes	MidSci	PR-PCR28ACF	Step 1.12
PD-10 Sephadex buffer exchange column and instruction manual	Cytiva	17085101	Step 1.10 and 2.10 (gel filtration column)
pMAL Protein Fusion and Purification System Instruction manual	New England Biolabs	E8200S	Step 2.1
Polyacrylamide gels AnyKD	Bio-Rad	456-8125	Step 1.13 and subsequent protien quality check steps
Potassium glutamate	Sigma-Aldrich	G1251	Step 4.1
Protease inhibitor	Thermo Scientific	78425	Step 1.4 and 2.2
Radiolabeled ATP	Perkin Elmer	BLU503H	Step 4.2
RNA Loading Dye, (2x)	New England Biolabs	B0363S	Step 4.13
Rnase inhibitor	Thermo Scientific	EO0381	Step 4.1
Spectrophotometer	Biotek	Mutiple	Step 1.13 and subsequent protien quality check steps
TBE-Urea gels 10 percent	Bio-Rad	4566033	Step 4.14