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Résumé

Les tests de transcription in vitro peuvent déchiffrer les mécanismes de régulation transcriptionnelle chez Borreliella burgdorferi. Ce protocole décrit les étapes pour purifier l’ARN polymérase de B. burgdorferi et effectuer des réactions de transcription in vitro. Les approches expérimentales utilisant des tests de transcription in vitro nécessitent une purification et un stockage fiables de l’ARN polymérase active.

Résumé

Borreliella burgdorferi est un pathogène bactérien avec des répertoires métaboliques et génomiques limités. B. burgdorferi transite extracellulaire entre les vertébrés et les tiques et remodèle radicalement son profil transcriptionnel pour survivre dans des environnements disparates pendant l’infection. L’un des objectifs des études sur B. burgdorferi est de comprendre clairement comment la bactérie réagit à son environnement par des changements transcriptionnels. Les essais de transcription in vitro permettent de disséquer biochimiquement les mécanismes de base de la régulation transcriptionnelle. Ici, nous présentons un protocole détaillé décrivant la purification et le stockage de l’ARN polymérase de B. burgdorferi , la purification du facteur sigma, la génération de modèles d’ADN et les tests de transcription in vitro . Le protocole décrit l’utilisation de l’ARN polymérase purifiée à partir de B. burgdorferi 5A4 RpoC-His (5A4-RpoC). 5A4-RpoC est une souche précédemment publiée hébergeant un marqueur 10XHis sur le gène rpoC codant pour la plus grande sous-unité de l’ARN polymérase. Les tests de transcription in vitro consistent en l’ARN polymérase purifiée à partir de la souche 5A4-RpoC, une version recombinante du facteur sigma d’entretien RpoD et un modèle d’ADN double brin généré par PCR. Bien que les techniques de purification des protéines et les approches d’assemblage des tests de transcription in vitro soient conceptuellement bien comprises et relativement courantes, les considérations de manipulation des ARN polymérases diffèrent souvent d’un organisme à l’autre. Le protocole présenté ici est conçu pour des études enzymatiques sur l’ARN polymérase de B. burgdorferi. La méthode peut être adaptée pour tester le rôle des facteurs de transcription, des promoteurs et des modifications post-traductionnelles sur l’activité de l’ARN polymérase.

Introduction

La maladie de Lyme et la fièvre récurrente sont causées par des spirochètes pathogènes des genres Borrelia et Borreliella 1,2,3. La maladie de Lyme est une maladie à transmission vectorielle importante en Amérique du Nord et, par conséquent, Borreliella burgdorferi est un organisme modèle important pour étudier la biologie des spirochètes 4,5. Les recherches sur les mécanismes de régulation transcriptionnelle de B. burgdorferi visent à mieux comprendre ses adaptations aux changements de l’environnement lorsqu’il circule entre son vecteur tique et ses hôtes mammifères 6,7. Les changements de pH, de température, d’osmolarité, de disponibilité des nutriments, d’acides gras à chaîne courte, d’acides organiques et d’oxygène dissous et de dioxyde de carbone modulent l’expression de gènes importants pour la survie de B. burgdorferi dans son vecteur arthropode et pour infecter les animaux 8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18. Relier ces réponses à des stimuli avec des mécanismes de régulation a été un aspect important de la recherche sur B. burgdorferi 19.

Les facteurs de transcription et les facteurs sigma contrôlent la transcription des gènes qui effectuent des processus cellulaires. Les spirochètes de la maladie de Lyme et de la fièvre récurrente abritent un ensemble relativement clairsemé de facteurs de transcription et de facteurs sigma alternatifs. Malgré cela, il existe des changements transcriptionnels complexes qui dirigent les réponses de B. burgdorferi à l’environnement20,21,22. Les mécanismes spécifiques à l’origine des changements transcriptionnels chez B. burgdorferi en réponse aux changements environnementaux restent incertains. Les tests de transcription in vitro sont des outils puissants pour utiliser une approche biochimique pour tester la fonction et les mécanismes de régulation des facteurs de transcription et des facteurs sigma23,24,25,26.

Un système de dosage de transcription in vitro utilisant l’ARN polymérase de B. burgdorferi a récemment été mis en place24. Comme les bactéries ont souvent une physiologie cellulaire unique, les ARN polymérases de différentes espèces et genres réagissent différemment à la purification enzymatique, au stockage enzymatique et aux conditions tampons de réaction27. B. burgdorferi est également génétiquement éloigné des nombreuses espèces bactériennes chez lesquelles les ARN polymérases ont été étudiées20. Des aspects de la préparation enzymatique tels que les conditions tampons de lyse, de lavage et d’élution, le tampon de stockage, le tampon de réaction de transcription in vitro et la méthode de construction du test peuvent tous modifier l’activité de l’ARN polymérase. Ici, nous fournissons un protocole pour la purification de l’ARN polymérase et du facteur sigma RpoD, la production d’un modèle d’ADN double brin linéaire et la construction de tests de transcription in vitro pour faciliter la reproductibilité entre les laboratoires utilisant ce système. Nous détaillons un exemple de réaction pour démontrer la plage linéaire pour la transcription dépendante de RpoD et discutons des limites et des alternatives à cette approche.

Protocole

1. Purification de l’ARN polymérase et préparation du stock d’ARN polymérase

  1. Prélever la pastille cellulaire de 2 à 4 L de B. burgdorferi RpoC-His10X cultivé dans un milieu BSKII dans un environnement microaérophile (34 °C, 5 % CO 2, 3 %O2) jusqu’à une densité de2 à 4 x 107 cellules/ml en utilisant les protocoles de collecte cellulairedécrits précédemment 28,29. Effectuer une centrifugation à 10 000 x g à 4 °C pendant 30 min dans des flacons centrifuges de 500 ml et verser le surnageant.
  2. Resuspendre les cellules dans 30 mL de tampon HN glacé (10 mM HEPES, 10 mM NaCl, pH 8,0). Répétez l’étape de centrifugation décrite ci-dessus à l’aide d’un tube à centrifuger de 50 ml et décanter le surnageant.
    NOTE: Point d’arrêt. Congeler la pastille cellulaire à -80 °C pour stocker les cellules jusqu’à 2 semaines ou procéder immédiatement à la lyse cellulaire.
  3. Maintenir les cellules, le lysat et les protéines purifiées à 4 °C ou sur de la glace à moins de congélation. Conserver l’ARN polymérase dans un environnement réducteur en ajoutant du DTT fraîchement préparé à une concentration de 2 mM à chaque tampon utilisé dans ce protocole et maintenir un pH de 8,0.
  4. Préparer le lysat à partir de la pastille de cellules de B. burgdorferi à l’aide d’une trousse de lyse bactérienne commerciale en suivant les instructions de la trousse. Remettez la pastille en suspension dans 10-15 mL de solution de B-PER à température ambiante (RT) sans inhibiteur de protéase et laissez la lyse se dérouler pendant 5 minutes sur glace. Le volume de lyse dépend de la taille de la pastille de cellule, comme décrit dans les instructions du kit.
  5. Ajouter un cocktail d’inhibiteurs de protéase à la solution de lyse, suivi de trois cycles de sonication, comme décrit dans la section des résultats représentatifs.
    NOTE: Alternativement, lyser les cellules dans une cellule de pression française comme décrit précédemment24. Ignorez l’étape 1.4. et l’étape 1.5.
  6. Clarifier le lysat cellulaire par centrifugation et filtration à l’aide d’un tube à centrifuger de 50 mL. Remplir le volume du tube à au moins 30 mL de volume total en ajoutant un tampon de chargement de colonne de cobalt (tableau 1) à la solution. Enduire les débris cellulaires par centrifugation à 20 000 x g pendant 30 min.
  7. Filtrer le surnageant à l’aide d’un filtre à seringue de 0,45 μm.
  8. Diluer le lysat dans un tampon de chargement de colonne de cobalt (tableau 1) en utilisant un taux de dilution final de 1:10.
  9. Effectuer une chromatographie d’affinité sur le surnageant de lysat cellulaire clarifié à l’aide d’une colonne de cobalt ou de résine de nickel en suivant les instructions du fabricant. Voir la section des résultats représentatifs pour un exemple. Utilisez les tampons répertoriés dans le tableau 1. Prélever les échantillons d’écoulement, de lavage et d’élution pour analyse.
  10. Remplacer immédiatement l’ARN polymérase contenue dans la solution tampon d’élution dans une solution tampon de stockage de l’ARN polymérase (tableau 1) à l’aide d’une colonne d’échange tampon en suivant les instructions du fabricant.
  11. Préparer les stocks de congélation en concentrant l’ARN polymérase à l’aide d’unités filtrantes centrifuges à coupure de 10 kDa à une concentration de 0,2-0,4 mg/mL déterminée par spectrophotométrie (A280 nm sans ajustement du coefficient d’extinction [1 abs à 1 cm = 1 mg·mL−1]).
  12. L’ARN polymérase aliquote stocke des stocks dans des volumes de 20 à 50 μL dans des tubes de PCR et stocke l’ARN polymérase à -80 °C.
  13. Déterminer la qualité de la chromatographie d’affinité par SDS-PAGE et mesurer le rendement total en protéines par spectrophotométrie ou dosage BCA. Faites passer les échantillons sur un gel de polyacrylamide à 7,5% à 120 V pendant 50 min pour une bonne résolution par SDS-PAGE.

2. Purification du RpoD recombinant et préparation du stock de RpoD

  1. Cultiver et induire l’expression de B. burgdorferi RpoD recombinant marqué à la protéine de liaison au maltose (MBP-RpoD) dans BL21::MBP-RpoDBb, tel que décrit dans le manuel d’instructions du système de fusion et de purification des protéines répertorié dans le tableau des matériaux, et collecter les cellules par centrifugation.
    NOTE: Point d’arrêt. Congeler les pastilles cellulaires à -80 °C pour stocker les cellules jusqu’à 2 semaines ou procéder immédiatement à la lyse cellulaire.
  2. Effectuer la lyse à l’aide d’un kit de lyse cellulaire bactérienne commercial ou d’une cellule de pression française. Voir l’exemple de tampon de lyse dans le tableau 1.
  3. Clarifier le lysat cellulaire en utilisant la centrifugation et la filtration. Enduire les débris cellulaires par centrifugation à 20 000 x g pendant 30 min. Filtrer le surnageant à l’aide d’un filtre de 0,45 μm.
  4. Extraire MBP-RpoD à l’aide d’un protocole d’extraction de protéines pour le système d’expression. Voir la section des résultats représentatifs pour obtenir des exemples de détails et de résultats de la mise en œuvre.
  5. Déterminer la qualité du processus de chromatographie d’affinité et d’élution par SDS-PAGE et mesurer le rendement en protéines par spectrophotométrie (A280nm sans ajustement du coefficient d’extinction [1 abs à 1 cm = 1 mg·mL−1]). Utiliser du gel de polyacrylamide à 10 % à 200 V pendant 30 min pour la séparation dans SDS-PAGE.
  6. Concentrer le MBP-RpoD à l’aide d’un filtre centrifuge de coupure de 10 kDa à une concentration de >2 mg/mL déterminée par spectrophotométrie.
  7. Clivage du MBP de RpoD au site de clivage du facteur Xa. Ajouter CaCl 2 aux fractions d’élution de chromatographie d’affinité contenant du MBP-RpoD à une concentration de2 mM. Ajouter 200 μg de facteur Xa protéase pour chaque 30 mg de protéine purifiée. Incuber pendant la nuit chez RT.
  8. Confirmer le clivage complet du MBP de RpoD par SDS-PAGE. Utiliser du gel de polyacrylamide à 10 % à 200 V pendant 30 min pour la séparation dans SDS-PAGE.
  9. Diluer la solution contenant du MBP et du RpoD dans un rapport de 1:10 avec un tampon liant l’héparine.
  10. Séparer MBP et RpoD sur la colonne héparine par FPLC. Voir le Tableau 2 pour les paramètres FPLC.
  11. Déterminer la qualité des produits de chromatographie d’affinité par SDS-PAGE et mesurer le rendement en protéines par spectrophotométrie. Utiliser du gel de polyacrylamide à 10 % à 200 V pendant 30 min pour la séparation dans SDS-PAGE.
  12. Concentrer les fractions d’élution contenant du RpoD à l’aide d’un filtre centrifuge de coupure de 10 kDa jusqu’à un volume final de 2-3 mL.
  13. Le tampon échange les fractions d’élution concentrées de RpoD vers le tampon de stockage à l’aide d’une colonne de filtration sur gel.
  14. Concentrer le stock de RpoD à l’aide d’un filtre centrifuge de coupure de 10 kDa à une concentration de 0,2 à 0,8 mg/mL, déterminée par spectrophotométrie.
  15. Aliquote RpoD stocke à des volumes de 20 à 50 μL dans des tubes de PCR et stocke à −80 °C.

3. Préparation du stock de modèles d’ADN

  1. La PCR amplifie la région de 500 pb entourant un site promoteur piloté par RpoD à partir de l’ADN génomique de B. burgdorferi en utilisant une réaction de 200 μL (tableau 3).
  2. Purifiez les produits PCR à l’aide d’un kit de purification PCR commercial. Éluer l’ADN en biologie moléculaire gradeH2O.
  3. Ajuster la concentration molaire des matrices d’ADN générées par PCR à 100 nM par dilution dans un grade de biologie moléculaireH2O.

4. Effectuer une transcription in vitro avec incorporation de nucléotides radiomarqués

  1. Préparer un plan expérimental de transcription in vitro . Déterminer les concentrations de l’ARN polymérase, de la RpoD et de la matrice d’ADN. Déterminer les volumes aliquotes et les ordres de pipetage pour les tubes de réaction. Voir le tableau 4 et la figure 1 pour un exemple.
    REMARQUE : Inclure des contrôles dans le plan expérimental, tels que des réactions ne contenant pas d’ARN polymérase, de polymérase alternative, pas de matrice ou d’autres gabarites.
  2. Calculer le volume de α-32P-ATP requis pour l’expérience. Incorporez cela dans le plan expérimental. En règle générale, inclure 2 μCi d’activité par réaction de transcription in vitro pour la détection par écran phosphoreux.
  3. Préparer les surfaces de travail, y compris le banc de radiation, afin de réduire le risque de contamination par les radiations.
  4. Décongeler des aliquotes fraîches d’ARN polymérase, de Rpo, de NTP tampon 5x et de solutions mères matricielles sur de la glace. Bien mélanger tous les bouillons congelés décongelés avant de les pipeter.
  5. Préparer un mélange réactionnel principal et un mélange NTP séparé pour les nucléotides radiomarqués conformément au plan expérimental.
  6. Distribuer les réactions de contrôle et les ensembles expérimentaux dans des tubes de PCR en préparation de l’ajout de radiomarquage dans la réaction. Distribuer délicatement H2O, mélange maître réactionnel, ARN polymérase et RpoD dans des tubes PCR désignés et mélanger par pipetage.
  7. Transférer les matériaux préparés sur un banc de radiation.
  8. Ajouter α-32P-ATP au NTP et mélanger par pipetage doux.
    ATTENTION : Lorsque vous travaillez avec des matières radioactives, utilisez l’équipement de protection et les procédures de manipulation appropriés pour les isotopes radioactifs.
  9. Ajouter du NTP aux tubes contenant les mélanges réactionnels de transcription in vitro de l’étape 4.6.
  10. Commencez la réaction de transcription in vitro avec l’ajout d’un modèle d’ADN. Mélanger le volume de réaction en pipetant doucement.
  11. Incuber les tubes à 37 °C pendant 5 min dans un thermocycleur ou un bloc thermique.
  12. Retirez les réactions du thermocycleur ou du bloc thermique et ajoutez le colorant de chargement d’ARN 2x contenant 50% de formamide à un volume de réaction égal pour arrêter les réactions de transcription in vitro .
  13. Dénaturer les enzymes en incubant des réactions à 65 °C pendant 5 min dans un thermocycleur ou un bloc thermique.
  14. Séparer l’ARN dans le mélange réactionnel de transcription in vitro par électrophorèse sur gel en utilisant des gels de polyacrylamide d’urée TBE à 10%-15% à 180 V pendant 30-45 min.
    REMARQUE: Selon les conditions d’électrophorèse sur gel, la solution tampon peut être contaminée par des nucléotides radiomarqués ou le gel peut contenir la plupart ou la totalité des nucléotides radiomarqués. Planifiez le stockage ou l’élimination appropriés de la radioactivité.
  15. Imagez l’ARN radiomarqué à l’aide d’un phosphoscreen après avoir retiré toute partie du gel contenant de l’ATP radiomarqué non incorporé. Exposez le gel au phosphoscreen pendant la nuit (16 h) et imagez à l’aide d’un imageur phosphoscreen (résolution 100 μm, tension du tube PMT de 700 V).
  16. Analyser les données à l’aide de méthodes de densitométrie24.

Résultats

Dans une réaction de transcription in vitro dans laquelle l’étape limite de la réaction est l’initiation de la transcription médiée par le facteur sigma, l’activité de transcription devrait augmenter linéairement avec la quantité de facteur sigma. Nous présentons la préparation d’expériences de transcription in vitro testant une gamme de concentrations de RpoD ainsi que deux concentrations d’ARN polymérase pour observer le signal variable résultant de l’incorporation de nucléot...

Discussion

Des tests de transcription in vitro construits à l’aide du protocole présenté ont récemment été utilisés pour étudier le rôle d’un facteur de transcription chez B. burgdorferi et peuvent être appliqués pour construire des expériences similaires en utilisant d’autres facteurs de transcription, facteurs sigma et molécules23. Une fois que l’ARN polymérase active de B. burgdorferi a été obtenue et que son activité a été détectée, les composants e...

Déclarations de divulgation

Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêts.

Remerciements

Ce travail a été soutenu par la subvention de perfectionnement du corps professoral du Fonds d’investissement stratégique en sciences de la santé de l’Université Creighton. La souche RpoC-His10X de B. burgdorferi a été aimablement fournie par le Dr D. Scott Samuels de l’Université du Montana. La souche E. coli hébergeant le plasmide pMAL-C5X codant pour un allèle rpoD marqué par une protéine de liaison au maltose a été aimablement fournie par le Dr Frank Gherardini de Rocky Mountain Laboratories, NIAID, NIH.

matériels

NameCompanyCatalog NumberComments
0.45 micron syringe filterThermo Scientific726-2545Step 1.7 and 2.3
50 mL conical tubesMidSciC50BStep 1.3, and subsequent steps
50 mL high-speed centrifuge tubesThermo Scientific3119-0050PKStep 1.2
500 mL Centrifuge bottlesThermo Scientific3120-9500PKStep 1.1
B-PER and instruction manualThermo Scientific78248Step 1.4 and 2.2
Calcium chlorideFisher Scientific10035-04-8Step 2.6
Centrifugal filters 10 Kd cutoffMillipore SigmaUFC8010Step 1.11 and 2.11
Cobalt resin and instruction manualThermo Scientific89969Step 1.9
DithiothreitolAcros Organics426380500Step 1.4 and subsequent steps
Dnase (Nuclease)Millipore Sigma70746Step 1.4 and 2.2
Factor Xa Protease Haematologic TechnologiesHCXA-0060Step 2.6
GE Typhoon 5 PhosphoimagerGE lifesciencesMultipleStep 4.15
Gel ImagerBio-RadMutipleStep 1.13 and subsequent protien quality check steps
H2O for in vitro transcriptionFisher Scientific7732-18-5Step 3.2 and 3.3
high fidelity PCR kitNew England BiolabsM0530SStep 3.1
High-speed centrifugeEppendorfStep 1.1, and subsequent steps
HiTrap Heparin HP 5 x 1 mLCytiva Life Sciences17040601Step 2.8
ImidazoleSigma-Aldrich56750-100GStep 1.9
LysozymeThermo Scientific90082Step 1.4 and 2.2
Magnesium chloride Fisher ScientificS25401Step 4.1
Manganese chlorideFisher ScientificS25418Step 4.1
Mini protean tetra cellBio-RadMutipleStep 1.13 and subsequent protien quality check steps
NP-40Thermo Scientific85124Step 4.1
NTP mixtureThermo ScientificR0481Step 4.1
PCR purification kitQiagen28506Step 3.2
PCR tubesMidSciPR-PCR28ACFStep 1.12
PD-10 Sephadex buffer exchange column and instruction manualCytiva17085101Step 1.10 and 2.10 (gel filtration column)
pMAL Protein Fusion
and Purification System Instruction manual		New England BiolabsE8200SStep 2.1
Polyacrylamide gels AnyKDBio-Rad456-8125Step 1.13 and subsequent protien quality check steps
Potassium glutamateSigma-AldrichG1251Step 4.1
Protease inhibitorThermo Scientific78425Step 1.4 and 2.2
Radiolabeled ATPPerkin ElmerBLU503HStep 4.2
RNA Loading Dye, (2x)New England BiolabsB0363SStep 4.13
Rnase inhibitorThermo ScientificEO0381Step 4.1
SpectrophotometerBiotekMutipleStep 1.13 and subsequent protien quality check steps
TBE-Urea gels 10 percentBio-Rad4566033Step 4.14

Références

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