רכיבים חיוניים של Borreliella (Borrelia) burgdorferi בדיקות תמלול חוץ גופי

Summary

מבחני שעתוק חוץ גופיים יכולים לפענח את מנגנוני ויסות השעתוק בבורליאלה בורגדורפרי. פרוטוקול זה מתאר את השלבים לטיהור B. burgdorferi RNA פולימראז וביצוע תגובות שעתוק חוץ גופי. גישות ניסיוניות המשתמשות במבחני שעתוק חוץ גופי דורשות טיהור ואחסון אמינים של RNA פולימראז פעיל.

Abstract

Borreliella burgdorferi הוא פתוגן חיידקי עם רפרטואר מטבולי וגנומי מוגבל. B. burgdorferi עובר באופן חוץ-תאי בין חולייתנים וקרציות ומשנה באופן דרמטי את פרופיל השעתוק שלו כדי לשרוד בסביבות שונות במהלך זיהום. מוקד המחקר של B. burgdorferi הוא להבין בבירור כיצד החיידק מגיב לסביבתו באמצעות שינויי שעתוק. מבחני שעתוק חוץ גופיים מאפשרים לנתח ביוכימית את המנגנונים הבסיסיים של ויסות השעתוק. כאן, אנו מציגים פרוטוקול מפורט המתאר טיהור ואחסון של B. burgdorferi RNA פולימראז, טיהור גורם סיגמא, יצירת תבניות DNA ומבחני שעתוק חוץ גופי . הפרוטוקול מתאר את השימוש ב-RNA פולימראז מטוהר מ-B. burgdorferi 5A4 RpoC-His (5A4-RpoC). 5A4-RpoC הוא זן שפורסם בעבר בעל תג 10XHis על הגן rpoC המקודד את תת-היחידה הגדולה ביותר של RNA פולימראז. בדיקות שעתוק חוץ גופיות מורכבות מ-RNA פולימראז מטוהר מזן 5A4-RpoC, גרסה רקומביננטית של גורם הסיגמא RpoD, ותבנית DNA דו-גדילי הנוצרת על ידי PCR. בעוד שטכניקות טיהור החלבונים והגישות להרכבה במבחני שעתוק חוץ גופי מובנות היטב ונפוצות יחסית, שיקולי הטיפול בפולימראז RNA שונים לעתים קרובות מאורגניזם לאורגניזם. הפרוטוקול המוצג כאן מיועד למחקרים אנזימטיים על B. burgdorferi RNA polymerase. ניתן להתאים את השיטה לבדיקת תפקידם של גורמי שעתוק, מקדמים ושינויים לאחר תרגום על פעילות ה-RNA פולימראז.

Introduction

מחלת ליים וקדחת התקפית נגרמות על ידי פתוגנים spirochete בסוגים Borrelia ו Borreliella ^1,2,3. מחלת ליים היא מחלה בולטת המועברת על ידי וקטורים בצפון אמריקה, וכתוצאה מכך, Borreliella burgdorferi הוא אורגניזם מודל בולט לחקר ביולוגיה ספירוצ'טה ^4,5. מחקרים על מנגנוני ויסות השעתוק של B. burgdorferi נועדו להבין טוב יותר את הסתגלותו לשינויים בסביבה כאשר הוא עובר בין וקטור הקרציות שלו לבין פונדקאים של יונקים ^6,7. שינויים ב- pH, טמפרטורה, אוסמולריות, זמינות חומרי מזון, חומצות שומן קצרות שרשרת, חומצות אורגניות ורמות חמצן מומס ופחמן דו חמצני מווסתים את ביטוי הגנים החשובים ל- B. burgdorferi לשרוד בווקטור פרוקי הרגליים שלו ולהדביק בעלי חיים 8,9,10,11,12,13,14,15^,16,17,18. קישור תגובות אלה לגירויים עם מנגנוני ויסות היה היבט חשוב במחקר B. burgdorferi ¹⁹.

גורמי שעתוק וגורמי סיגמא שולטים בשעתוק גנים המבצעים תהליכים תאיים. לליים ולספירוצ'טות קדחת התקפיתיות יש קבוצה דלילה יחסית של גורמי שעתוק וגורמי סיגמה חלופיים. למרות זאת, ישנם שינויי שעתוק מורכבים המכוונים את תגובות B. burgdorferi לסביבה^20,21,22. המנגנונים הספציפיים המניעים שינויי שעתוק ב- B. burgdorferi בתגובה לשינויים סביבתיים עדיין אינם ברורים. מבחני שעתוק חוץ גופי הם כלים רבי עוצמה לשימוש בגישה ביוכימית להערכת הפונקציה ומנגנוני הבקרה של גורמי שעתוק וגורמי סיגמא^23,24,25,26.

לאחרונה הוקמה מערכת בדיקת שעתוק חוץ גופית באמצעות B. burgdorferi RNA polymerase²⁴. מכיוון שלחיידקים יש לעתים קרובות פיזיולוגיות תאיות ייחודיות, RNA פולימראז ממינים וסוגים שונים מגיב באופן שונה לטיהור אנזימים, אחסון אנזימים ותנאי חיץ תגובה²⁷. B. burgdorferi גם מרוחק גנטית ממיני חיידקים רבים שבהם נחקרו RNA פולימראזות²⁰. היבטים של הכנת אנזימים כגון ליזה, שטיפה ותנאי חיץ אלוציה, מאגר אחסון, מאגר תגובת שעתוק חוץ גופית ושיטת בניית הבדיקה יכולים כולם לשנות את פעילות ה- RNA פולימראז. בזאת, אנו מספקים פרוטוקול לטיהור RNA פולימראז וגורם סיגמא RpoD, ייצור תבנית DNA ליניארית דו-גדילית, ובניית מבחני שעתוק חוץ גופיים כדי להקל על יכולת השחזור בין מעבדות המשתמשות במערכת זו. אנו מפרטים תגובה לדוגמה כדי להדגים את הטווח הליניארי עבור תמלול תלוי RpoD ולדון במגבלות ובחלופות לגישה זו.

Protocol

1. טיהור ה-RNA פולימראז והכנת מלאי RNA פולימראז

1. לאסוף את גלולת התא מ 2-4 L של B. burgdorferi RpoC-His10X בתרבית בתווך BSKII בסביבה מיקרואירופילית (34 ° C, 5% CO 2, 3% O 2) לצפיפות של_2-4 x 10⁷ תאים / מ"ל באמצעות פרוטוקולי איסוף תאים^{שתוארו קודם לכן 28,29}. בצע צנטריפוגה ב 10,000 x גרם ב 4 ° C במשך 30 דקות בבקבוקים צנטריפוגליים 500 מ"ל ויוצקים את supernatant.
2. להשהות מחדש את התאים ב 30 מ"ל של חיץ HN קר כקרח (10 mM HEPES, 10 mM NaCl, pH 8.0). חזור על שלב הצנטריפוגה כמתואר לעיל באמצעות צינור צנטריפוגה של 50 מ"ל ודקנט את הסופרנטנט.
   הערה: נקודת עצירה. יש להקפיא את כדורית התא בטמפרטורה של -80°C כדי לאחסן תאים למשך עד שבועיים או להמשיך מיד לליזה של התא.
3. שמרו על התאים, הליזט והחלבונים המטוהרים בטמפרטורה של 4°C או על קרח, אלא אם כן הם קופאים. שמור על RNA פולימראז בסביבה מפחיתה על ידי הוספת DTT טרי שהוכן בריכוז של 2 mM לכל מאגר המשמש בפרוטוקול זה ושמור על pH 8.0.
4. הכינו ליזט מכדורית תאי B. burgdorferi באמצעות ערכת ליזה חיידקית מסחרית בהתאם להוראות הערכה. השהה מחדש את הגלולה ב 10-15 מ"ל של טמפרטורת החדר (RT) B-לכל פתרון ללא מעכב פרוטאז ולאפשר ליזיס להמשיך במשך 5 דקות על קרח. נפח הליזה תלוי בגודל כדורי התא, כמתואר בהוראות הערכה.
5. הוסף קוקטייל מעכב פרוטאז לתמיסת הליזיס, ואחריו שלושה סבבי סוניקציה, כמתואר בסעיף התוצאות המייצגות.
   הערה: לחלופין, ליז את התאים בתא לחץ צרפתי כפי שתואר קודם²⁴. דלג על שלב 1.4. ושלב 1.5.
6. להבהיר את התא lysate באמצעות צנטריפוגה וסינון באמצעות צינור צנטריפוגה 50 מ"ל. מלא את נפח הצינור לנפח כולל של 30 מ"ל לפחות על-ידי הוספת מאגר העמסת עמודת קובלט (טבלה 1) לתמיסה. משחררים את פסולת התא באמצעות צנטריפוגה במהירות של 20,000 x גרם למשך 30 דקות.
7. סננו את הסופרנאטנט באמצעות מסנן מזרקים בגודל 0.45 מיקרומטר.
8. דללו את הליזט במאגר העמסת עמודת קובלט (טבלה 1) באמצעות יחס דילול סופי של 1:10.
9. בצע כרומטוגרפיית זיקה על הסופרנאטנט ליזט התא המובהר באמצעות עמודת קובלט או ניקל-שרף בהתאם להוראות היצרן. עיין בסעיף התוצאות המייצגות לקבלת דוגמה. השתמש במאגרים המפורטים בטבלה 1. אספו את דגימות הזרימה, השטיפה והאלוציה לצורך ניתוח.
10. החליפו מיד את ה-RNA פולימראז בתמיסת חיץ האלוציה בתמיסת חיץ אחסון RNA פולימראז (טבלה 1) באמצעות עמודת החלפת חיץ בהתאם להוראות היצרן.
11. הכינו את מלאי המקפיא על ידי ריכוז ה-RNA פולימראז באמצעות 10 יחידות מסנן צנטריפוגליות בחיתוך kDa, לריכוז של 0.2-0.4 מ"ג/מ"ל שנקבע על ידי ספקטרופוטומטריה (_280nm ללא התאמת מקדם הכחדה [1 abs ב-1 ס"מ = 1 מ"ג·מ"ל⁻¹]).
12. מקפיא מקפיא RNA פולימראז Aliquot בנפחים של 20-50 μL בצינורות PCR ומאחסן את ה- RNA פולימראז ב -80 מעלות צלזיוס.
13. קבע את איכות כרומטוגרפיית הזיקה על ידי SDS-PAGE ומדוד את תפוקת החלבון הכוללת על ידי ספקטרופוטומטריה או בדיקת BCA. הפעל את הדגימות על ג'ל פוליאקרילאמיד 7.5% במתח של 120 וולט למשך 50 דקות לקבלת רזולוציה טובה על ידי SDS-PAGE.

2. טיהור RpoD רקומביננטי והכנת מלאי RpoD

1. תרבית ותשרה את הביטוי של רקומביננט B. burgdorferi RpoD (MBP-RpoD) ב- BL21::MBP-RpoD_Bb, כמתואר במדריך ההוראות של מערכת איחוי וטיהור חלבונים המופיע בטבלת החומרים, ואיסוף התאים באמצעות צנטריפוגה.
   הערה: נקודת עצירה. הקפיאו את כדורי התא בטמפרטורה של -80°C כדי לאחסן תאים למשך עד שבועיים או המשיכו מיד לליזה של התא.
2. בצע ליזה באמצעות ערכת ליזה מסחרית של תא חיידקי או תא לחץ צרפתי. ראו את מאגר הליזיס לדוגמה בטבלה 1.
3. להבהיר את התא lysate באמצעות צנטריפוגה וסינון. משחררים את פסולת התא באמצעות צנטריפוגה במהירות של 20,000 x גרם למשך 30 דקות. סננו את הסופרנאטנט באמצעות מסנן של 0.45 מיקרומטר.
4. חלץ MBP-RpoD באמצעות פרוטוקול מיצוי חלבונים עבור מערכת הביטוי. עיין בסעיף תוצאות מייצגות לדוגמה, פרטי יישום ותוצאות.
5. לקבוע את איכות תהליך כרומטוגרפיית הזיקה וההדחה על ידי SDS-PAGE ולמדוד את תפוקת החלבון על ידי ספקטרופוטומטריה (_280nm ללא התאמת מקדם הכחדה [1 abs ב 1 ס"מ = 1 מ"ג^·mL−1]). יש להשתמש בג'ל 10% פוליאקרילאמיד במתח של 200 וולט למשך 30 דקות לצורך הפרדה ב-SDS-PAGE.
6. רכז MBP-RpoD באמצעות מסנן צנטריפוגלי בחיתוך 10 kDa, לריכוז של >2 מ"ג/מ"ל שנקבע על ידי ספקטרופוטומטריה.
7. לבקע MBP מ RpoD באתר המחשוף פקטור קסה. הוסף את CaCl 2 לשברי האלוציה של כרומטוגרפיית הזיקה המכילים MBP-RpoD בריכוז של₂ מילימול. הוסף 200 מיקרוגרם של פרוטאז פקטור Xa עבור כל 30 מ"ג של חלבון מטוהר. לדגור לילה ב-RT.
8. אשר שסע מלא של MBP מ- RpoD על ידי SDS-PAGE. יש להשתמש בג'ל 10% פוליאקרילאמיד במתח של 200 וולט למשך 30 דקות לצורך הפרדה ב-SDS-PAGE.
9. לדלל את התמיסה המכילה MBP ו- RpoD ביחס של 1:10 עם מאגר קושר הפרין.
10. MBP ו- RpoD נפרדים בעמודת הפרין על ידי FPLC. ראה טבלה 2 עבור הגדרות FPLC.
11. לקבוע את האיכות של מוצרי כרומטוגרפיית זיקה על ידי SDS-PAGE ולמדוד את תפוקת החלבון על ידי ספקטרופוטומטריה. יש להשתמש בג'ל 10% פוליאקרילאמיד במתח של 200 וולט למשך 30 דקות לצורך הפרדה ב-SDS-PAGE.
12. רכז את שברי האלוציה המכילים RpoD באמצעות מסנן צנטריפוגלי בחיתוך 10 kDa, לנפח סופי של 2-3 מ"ל.
13. מאגר מחליף את שברי האלוציה המרוכזים של RpoD למאגר אחסון באמצעות עמודת סינון ג'ל.
14. רכז את מלאי RpoD באמצעות מסנן צנטריפוגלי בחיתוך 10 kDa, לריכוז של 0.2-0.8 מ"ג/מ"ל כפי שנקבע על ידי ספקטרופוטומטריה.
15. מלאי Aliquot RpoD בנפחים של 20-50 μL בצינורות PCR ולאחסן ב -80 ° C.

3. הכנת מלאי תבניות DNA

1. PCR מגביר את אזור 500 bp המקיף אתר מקדם מונע RpoD מדנ"א גנומי B. burgdorferi באמצעות תגובה של 200 μL (טבלה 3).
2. לטהר את מוצרי ה-PCR באמצעות ערכת טיהור PCR מסחרית. להצדיע את הדנ"א בביולוגיה מולקולרית כיתה H₂O.
3. התאמת הריכוז המולרי של תבניות DNA שנוצרו על ידי PCR ל -100 ננומטר על ידי דילול בביולוגיה מולקולרית כיתה H₂O.

4. בצע תעתיק חוץ גופי עם שילוב של נוקלאוטידים מסומנים ברדיו

1. הכן תוכנית ניסוי שעתוק חוץ גופית . קבע את ריכוזי תבנית RNA פולימראז, RpoD ו- DNA. קבע את נפחי aliquot ואת פקודות pipetting עבור צינורות תגובה. ראו לדוגמה טבלה 4 ואיור 1 .
   הערה: כלול פקדים בתוכנית הניסוי, כגון תגובות שאינן מכילות RNA פולימראז, פולימראז חלופי, ללא תבנית או תבניות חלופיות.
2. חשב את נפח ^α-32P-ATP הדרוש לניסוי. שלבו זאת בתוכנית הניסוי. בדרך כלל, כלול 2 μCi של פעילות לכל תגובת שעתוק חוץ גופית לזיהוי מסך זרחן.
3. הכינו את משטחי העבודה, כולל ספסל הקרינה, כדי להפחית את הסיכון לזיהום קרינה.
4. הפשירו אליציטוטים טריים של RNA פולימראז, Rpo, 5x buffer NTP ופתרונות מלאי תבניות על קרח. מערבבים היטב את כל המלאים הקפואים המופשרים לפני הפיפט.
5. הכינו תערובת תגובת אב ותערובת NTP נפרדת לנוקלאוטידים מסומנים ברדיו בהתאם לתוכנית הניסוי.
6. לחלק את תגובות הבקרה ואת ערכות הניסוי לתוך צינורות PCR כהכנה של הוספת radiolabel בתגובה. יש להוציא בעדינות H₂O, תערובת מאסטר תגובה, RNA פולימראז ו-RpoD לצינורות PCR ייעודיים ולערבב באמצעות פיפטציה.
7. מעבירים את החומרים המוכנים לספסל קרינה.
8. מוסיפים ^α-32P-ATP ל-NTP ומערבבים בפיפטינג עדין.
   התראה: בעת עבודה עם חומר רדיואקטיבי, יש להשתמש בציוד מגן מתאים ובנהלי טיפול באיזוטופים רדיואקטיביים.
9. הוסף NTP לצינורות המכילים את תערובות תגובת השעתוק במבחנה משלב 4.6.
10. התחל את תגובת השעתוק במבחנה עם תוספת של תבנית DNA. מערבבים את עוצמת התגובה על ידי פיפטינג עדין.
11. לדגור צינורות ב 37 ° C במשך 5 דקות thermocycler או בלוק חום.
12. הסר את התגובות מהתרמוסייקלר או בלוק החום והוסף את צבע טעינת הרנ"א 2x המכיל 50% פורממיד לנפח תגובה שווה כדי לעצור תגובות שעתוק חוץ גופיות .
13. נטרל את האנזימים על ידי דגירה על תגובות ב 65 ° C במשך 5 דקות thermocycler או בלוק חום.
14. יש להפריד RNA בתערובת תגובת שעתוק חוץ גופית על ידי אלקטרופורזה בג'ל באמצעות ג'ל פוליאקרילאמיד אוריאה TBE 10%-15% במתח של 180 וולט למשך 30-45 דקות.
    הערה: בהתאם לתנאי אלקטרופורזה בג'ל, תמיסת החיץ עשויה להיות מזוהמת בנוקלאוטידים מסומנים ברדיו או שהג'ל עשוי להכיל את רוב או כל הנוקלאוטידים המסומנים ברדיו. תכננו אחסון או השלכה נאותים של רדיואקטיביות.
15. דמיינו את ה-RNA המסומן ברדיו באמצעות phosphoscreen לאחר הסרת כל חלק של הג'ל המכיל ATP לא משולב. חשוף את הג'ל למסך הזרחן למשך הלילה (16 שעות) ותמונה באמצעות מצלמת PhosphoScreen (רזולוציה של 100 מיקרומטר, מתח צינור PMT של 700 V).
16. נתח את הנתונים באמצעות שיטות צפיפות²⁴.

תוצאות

בתגובת שעתוק חוץ גופית שבה השלב המגביל של התגובה הוא התחלת שעתוק בתיווך גורם סיגמא, פעילות השעתוק צריכה לגדול באופן ליניארי עם כמות גורם הסיגמא. אנו מציגים את ההכנה של ניסויי שעתוק חוץ גופי הבודקים טווח של ריכוזי RpoD יחד עם שני ריכוזים של RNA פולימראז כדי לצפות באות המשתנה המתקבל מש...

Discussion

מבחני שעתוק חוץ גופיים שנבנו באמצעות הפרוטוקול המוצג שימשו לאחרונה לחקר תפקידו של גורם שעתוק ב- B. burgdorferi וניתן ליישם אותם לבניית ניסויים דומים באמצעות גורמי שעתוק אחרים, גורמי סיגמא ומולקולות²³. לאחר קבלת RNA פולימראז פעיל מ- B. burgdorferi וזיהוי פעילותו, ניתן לשנות רכי...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.45 micron syringe filter	Thermo Scientific	726-2545	Step 1.7 and 2.3
50 mL conical tubes	MidSci	C50B	Step 1.3, and subsequent steps
50 mL high-speed centrifuge tubes	Thermo Scientific	3119-0050PK	Step 1.2
500 mL Centrifuge bottles	Thermo Scientific	3120-9500PK	Step 1.1
B-PER and instruction manual	Thermo Scientific	78248	Step 1.4 and 2.2
Calcium chloride	Fisher Scientific	10035-04-8	Step 2.6
Centrifugal filters 10 Kd cutoff	Millipore Sigma	UFC8010	Step 1.11 and 2.11
Cobalt resin and instruction manual	Thermo Scientific	89969	Step 1.9
Dithiothreitol	Acros Organics	426380500	Step 1.4 and subsequent steps
Dnase (Nuclease)	Millipore Sigma	70746	Step 1.4 and 2.2
Factor Xa Protease	Haematologic Technologies	HCXA-0060	Step 2.6
GE Typhoon 5 Phosphoimager	GE lifesciences	Multiple	Step 4.15
Gel Imager	Bio-Rad	Mutiple	Step 1.13 and subsequent protien quality check steps
H2O for in vitro transcription	Fisher Scientific	7732-18-5	Step 3.2 and 3.3
high fidelity PCR kit	New England Biolabs	M0530S	Step 3.1
High-speed centrifuge	Eppendorf		Step 1.1, and subsequent steps
HiTrap Heparin HP 5 x 1 mL	Cytiva Life Sciences	17040601	Step 2.8
Imidazole	Sigma-Aldrich	56750-100G	Step 1.9
Lysozyme	Thermo Scientific	90082	Step 1.4 and 2.2
Magnesium chloride	Fisher Scientific	S25401	Step 4.1
Manganese chloride	Fisher Scientific	S25418	Step 4.1
Mini protean tetra cell	Bio-Rad	Mutiple	Step 1.13 and subsequent protien quality check steps
NP-40	Thermo Scientific	85124	Step 4.1
NTP mixture	Thermo Scientific	R0481	Step 4.1
PCR purification kit	Qiagen	28506	Step 3.2
PCR tubes	MidSci	PR-PCR28ACF	Step 1.12
PD-10 Sephadex buffer exchange column and instruction manual	Cytiva	17085101	Step 1.10 and 2.10 (gel filtration column)
pMAL Protein Fusion and Purification System Instruction manual	New England Biolabs	E8200S	Step 2.1
Polyacrylamide gels AnyKD	Bio-Rad	456-8125	Step 1.13 and subsequent protien quality check steps
Potassium glutamate	Sigma-Aldrich	G1251	Step 4.1
Protease inhibitor	Thermo Scientific	78425	Step 1.4 and 2.2
Radiolabeled ATP	Perkin Elmer	BLU503H	Step 4.2
RNA Loading Dye, (2x)	New England Biolabs	B0363S	Step 4.13
Rnase inhibitor	Thermo Scientific	EO0381	Step 4.1
Spectrophotometer	Biotek	Mutiple	Step 1.13 and subsequent protien quality check steps
TBE-Urea gels 10 percent	Bio-Rad	4566033	Step 4.14