Componentes essenciais de ensaios de transcrição in vitro de Borreliella (Borrelia) burgdorferi

Resumo

Ensaios de transcrição in vitro podem decifrar os mecanismos de regulação transcricional em Borreliella burgdorferi. Este protocolo descreve as etapas para purificar a RNA polimerase de B. burgdorferi e realizar reações de transcrição in vitro. Abordagens experimentais usando ensaios de transcrição in vitro requerem purificação e armazenamento confiáveis da RNA polimerase ativa.

Resumo

Borreliella burgdorferi é um patógeno bacteriano com repertórios metabólicos e genômicos limitados. B. burgdorferi transita extracelularmente entre vertebrados e carrapatos e remodela dramaticamente seu perfil transcricional para sobreviver em ambientes díspares durante a infecção. Um foco dos estudos de B. burgdorferi é entender claramente como a bactéria responde ao seu ambiente através de mudanças transcricionais. Ensaios de transcrição in vitro permitem dissecar bioquimicamente os mecanismos básicos de regulação transcricional. Aqui, apresentamos um protocolo detalhado descrevendo purificação e armazenamento da polimerase de RNA de B. burgdorferi , purificação do fator sigma, geração de molde de DNA e ensaios de transcrição in vitro . O protocolo descreve o uso da RNA polimerase purificada de B. burgdorferi 5A4 RpoC-His (5A4-RpoC). 5A4-RpoC é uma cepa publicada anteriormente que abriga um 10XHis-tag no gene rpoC que codifica a maior subunidade da RNA polimerase. Os ensaios de transcrição in vitro consistem na RNA polimerase purificada da cepa 5A4-RpoC, uma versão recombinante do fator sigma housekeeping RpoD e um molde de DNA de fita dupla gerado por PCR. Enquanto as técnicas de purificação de proteínas e as abordagens para montagem de ensaios de transcrição in vitro são conceitualmente bem compreendidas e relativamente comuns, as considerações de manuseio para RNA polimerases frequentemente diferem de organismo para organismo. O protocolo aqui apresentado destina-se a estudos enzimáticos da RNA polimerase de B. burgdorferi. O método pode ser adaptado para testar o papel de fatores de transcrição, promotores e modificações pós-traducionais na atividade da RNA polimerase.

Introdução

A doença de Lyme e a febre recidivante são causadas por patógenos espiroquetas dos gêneros Borrelia e Borreliella ^1,2,3. A doença de Lyme é uma proeminente doença transmitida por vetores na América do Norte e, consequentemente, a Borreliella burgdorferi é um organismo modelo proeminente para estudar a biologia das espiroquetas ^4,5. Investigações sobre os mecanismos de regulação transcricional de B. burgdorferi visam compreender melhor suas adaptações às mudanças no ambiente à medida que circula entre seu carrapato vetor e hospedeiros mamíferos ^6,7. Alterações no pH, temperatura, osmolaridade, disponibilidade de nutrientes, ácidos graxos de cadeia curta, ácidos orgânicos e níveis de oxigênio dissolvido e dióxido de carbono modulam a expressão de genes importantes para a sobrevivência de B. burgdorferi em seu artrópodes vetor e infectar animais 8,9,10,11,12,13,14,15^,16,17,18. A ligação dessas respostas a estímulos com mecanismos regulatórios tem sido um aspecto importante na pesquisa com B. burgdorferi19.

Fatores de transcrição e fatores sigma controlam a transcrição de genes que realizam processos celulares. As espiroquetas de Lyme e febre recidivante abrigam um conjunto relativamente escasso de fatores de transcrição e fatores sigma alternativos. Apesar disso, existem complexas alterações transcricionais direcionando as respostas de B. burgdorferi ao ambiente^20,21,22. Os mecanismos específicos que conduzem as mudanças transcricionais em B. burgdorferi em resposta a mudanças ambientais permanecem obscuros. Ensaios de transcrição in vitro são ferramentas poderosas para o emprego de uma abordagem bioquímica para testar a função e os mecanismos regulatórios dos fatores de transcrição e fatores sigma^23,24,25,26.

Um sistema de ensaio de transcrição in vitro utilizando a RNA polimerase de B. burgdorferi foi recentemente estabelecido²⁴. Como as bactérias frequentemente têm fisiologias celulares únicas, RNA polimerases de diferentes espécies e gêneros respondem diferentemente às condições de purificação enzimática, armazenamento enzimático e tampão de reação²⁷. B. burgdorferi também está geneticamente distante das muitas espécies bacterianas nas quais RNA polimerases têm sido^estudadas20. Aspectos da preparação enzimática, tais como condições de lise, lavagem e tampão de eluição, tampão de armazenamento, tampão de reação de transcrição in vitro e o método de construção do ensaio podem alterar a atividade da RNA polimerase. Neste trabalho, fornecemos um protocolo para a purificação da RNA polimerase e do fator sigma RpoD, a produção de molde linear de DNA de fita dupla e a construção de ensaios de transcrição in vitro para facilitar a reprodutibilidade entre laboratórios que utilizam este sistema. Detalhamos um exemplo de reação para demonstrar a faixa linear para transcrição dependente de RpoD e discutimos limitações e alternativas para essa abordagem.

Protocolo

1. Purificação da RNA polimerase e preparação do estoque de RNA polimerase

1. Coletar o pellet celular de 2-4 L de B. burgdorferi RpoC-His10X cultivado em meio BSKII em ambiente microaerofílico (34 °C, 5% CO 2, 3% O 2) a uma densidade de_2-4 x 10⁷ células/mL utilizando protocolos de coleta celular previamente descritos^28,29. Realizar centrifugação a 10.000 x g a 4 °C por 30 min em frascos centrífugos de 500 mL e despejar o sobrenadante.
2. Ressuspender as células em 30 mL de tampão HN gelado (10 mM HEPES, 10 mM NaCl, pH 8,0). Repita a etapa de centrifugação descrita acima usando um tubo centrífugo de 50 mL e decante o sobrenadante.
   NOTA: Ponto de parada. Congelar a pastilha celular a -80 °C para armazenar células por até 2 semanas ou proceder imediatamente à lise celular.
3. Manter as células, lisar e proteínas purificadas a 4 °C ou no gelo, a menos que congelem. Manter a RNA polimerase em um ambiente redutor adicionando TDT recém-preparado a uma concentração de 2 mM a cada tampão usado neste protocolo e manter o pH 8,0.
4. Preparar lisado a partir do pellet de células de B. burgdorferi usando um kit comercial de lise bacteriana seguindo as instruções do kit. Ressuspender o pellet em 10-15 mL de solução de B-PER à temperatura ambiente (TR) sem inibidor de protease e permitir que a lise prossiga por 5 min em gelo. O volume de lise depende do tamanho da pastilha celular, conforme descrito nas instruções do kit.
5. Adicionar coquetel de inibidor de protease à solução de lise, seguido de três rodadas de sonicação, conforme descrito na seção de resultados representativos.
   NOTA: Alternativamente, lise as células em uma célula de pressão francesa, conforme descrito anteriormente²⁴. Pule a etapa 1.4. e passo 1.5.
6. Clarificar o lisado celular usando centrifugação e filtração usando um tubo de centrífuga de 50 mL. Encher o volume do tubo até pelo menos 30 ml de volume total adicionando tampão de carregamento da coluna de cobalto (Tabela 1) à solução. Pellet os restos celulares por centrifugação a 20.000 x g por 30 min.
7. Filtrar o sobrenadante utilizando um filtro de seringa de 0,45 μm.
8. Diluir o lisado em tampão de carga da coluna de cobalto (quadro 1) utilizando uma relação de diluição final de 1:10.
9. Realizar cromatografia de afinidade no sobrenadante de lisado celular clarificado usando uma coluna de cobalto ou níquel-resina seguindo as instruções do fabricante. Consulte a seção de resultados representativos para obter um exemplo. Use os buffers listados na Tabela 1. Coletar as amostras de fluxo, lavagem e eluição para análise.
10. Trocar imediatamente a RNA polimerase na solução tampão de eluição por uma solução tampão de armazenamento de RNA polimerase (Tabela 1) usando uma coluna de troca de tampão seguindo as instruções do fabricante.
11. Preparar as reservas congeladoras concentrando a RNA polimerase utilizando unidades filtrantes centrífugas de corte de 10 kDa, numa concentração de 0,2-0,4 mg/mL determinada por espectrofotometria (A_280nm sem ajuste do coeficiente de extinção [1 abs a 1 cm = 1 mg·mL⁻¹]).
12. O congelador de RNA polimerase Aliquota armazena em volumes de 20-50 μL em tubos de PCR e armazena a RNA polimerase a -80 °C.
13. Determinar a qualidade da cromatografia de afinidade por SDS-PAGE e medir o rendimento total de proteínas por espectrofotometria ou ensaio de BCA. Executar as amostras em um gel de poliacrilamida a 7,5% a 120 V por 50 min para uma boa resolução por SDS-PAGE.

2. Purificação de RpoD recombinante e preparação de material de RpoD

1. Cultivar e induzir a expressão de B. burgdorferi RpoD recombinante marcado com Maltose Binding Protein (MBP-RpoD) em BL21::MBP-RpoD_Bb, conforme descrito pelo manual de instruções do sistema de purificação e fusão de proteínas listado na Tabela de Materiais, e coletar as células por centrifugação.
   NOTA: Ponto de parada. Congele os pellets de células a -80 °C para armazenar células por até 2 semanas ou proceda imediatamente à lise celular.
2. Realizar lise usando um kit comercial de lise de células bacterianas ou células de pressão francesas. Veja o exemplo de buffer de lise na Tabela 1.
3. Clarificar o lisado celular usando centrifugação e filtração. Pellet os restos celulares por centrifugação a 20.000 x g por 30 min. Filtrar o sobrenadante utilizando um filtro de 0,45 μm.
4. Extrair MBP-RpoD utilizando um protocolo de extração de proteínas para o sistema de expressão. Consulte a seção de resultados representativos para obter detalhes e resultados de implementação.
5. Determinar a qualidade do processo de cromatografia de afinidade e eluição por SDS-PAGE e medir o rendimento proteico por espectrofotometria (A_280nm sem ajuste do coeficiente de extinção [1 abs a 1 cm = 1 mg·mL⁻¹]). Use gel de poliacrilamida a 10% a 200 V por 30 min para separação em SDS-PAGE.
6. Concentrar a MBP-RpoD utilizando um filtro centrífugo de corte de 10 kDa até uma concentração de >2 mg/mL determinada por espectrofotometria.
7. Cleave MBP do RpoD no local de clivagem do Fator Xa. Adicionar CaCl 2 às frações de eluição por cromatografia de afinidade contendo MBP-RpoD na concentração de₂ mM. Adicionar 200 μg de Fator Xa Protease para cada 30 mg de proteína purificada. Incubar durante a noite no RT.
8. Confirme a clivagem completa da MBP do RpoD por SDS-PAGE. Use gel de poliacrilamida a 10% a 200 V por 30 min para separação em SDS-PAGE.
9. Diluir a solução contendo MBP e RpoD na proporção de 1:10 com um tampão de ligação à heparina.
10. Separe a PAM e a DPOr na coluna de heparina por FPLC. Consulte a Tabela 2 para obter as configurações de FPLC.
11. Determinar a qualidade dos produtos da cromatografia de afinidade por SDS-PAGE e medir o rendimento proteico por espectrofotometria. Use gel de poliacrilamida a 10% a 200 V por 30 min para separação em SDS-PAGE.
12. Concentrar as fracções de eluição contendo RpoD utilizando um filtro centrífugo de corte de 10 kDa para um volume final de 2-3 ml.
13. O tampão troca as frações de eluição concentradas de RpoD para o tampão de armazenamento usando uma coluna de filtração em gel.
14. Concentrar o estoque de RpoD usando um filtro centrífugo de corte de 10 kDa para uma concentração de 0,2-0,8 mg/mL, determinada por espectrofotometria.
15. Aliquot RpoD estoque em volumes de 20-50 μL em tubos de PCR e armazenar a -80 °C.

3. Preparação do estoque de modelo de DNA

1. A PCR amplifica a região de 500 pb ao redor de um sítio promotor impulsionado por RpoD do DNA genômico de B. burgdorferi usando uma reação de 200 μL (Tabela 3).
2. Purificar os produtos de PCR usando um kit de purificação PCR comercial. Eluir o DNA em biologia molecular grau H₂O.
3. Ajustar a concentração molar dos moldes de DNA gerados pela PCR para 100 nM por diluição em biologia molecular grau H₂O.

4. Realizar transcrição in vitro com incorporação de nucleotídeos radiomarcados

1. Preparar um plano experimental de transcrição in vitro . Determinar as concentrações de RNA polimerase, RpoD e molde de DNA. Determine os volumes de alíquotas e ordens de pipetagem para os tubos de reação. Veja a Tabela 4 e a Figura 1 para obter um exemplo.
   NOTA: Incluir controles no plano experimental, como reações que não contenham RNA polimerase, polimerase alternativa, nenhum modelo ou modelos alternativos.
2. Calcular o volume de ^α-32P-ATP necessário para o experimento. Incorpore isso no plano experimental. Tipicamente, incluem 2 μCi de atividade por reação de transcrição in vitro para detecção de tela de fósforo.
3. Preparar as superfícies de trabalho, incluindo a bancada de radiação, para reduzir o risco de contaminação por radiação.
4. Descongelar alíquotas frescas de RNA polimerase, Rpo, 5x tampão NTP e soluções estoque modelo no gelo. Misture bem todos os estoques congelados descongelados antes de pipetar.
5. Preparar uma mistura mestre de reação e uma mistura separada de NTP para nucleotídeos radiomarcados de acordo com o plano experimental.
6. Dispensar as reações de controle e conjuntos experimentais em tubos de PCR em preparação para adicionar radiomarcação na reação. Distribua suavemente H₂O, mistura mestre de reação, RNA polimerase e RpoD em tubos de PCR designados e misture por pipetagem.
7. Transfira os materiais preparados para uma bancada de radiação.
8. Adicione ^α-32P-ATP ao NTP e misture por pipetagem suave.
   CUIDADO: Ao trabalhar com material radioativo, use equipamentos de proteção apropriados e procedimentos de manuseio de isótopos radioativos.
9. Adicionar NTP aos tubos contendo as misturas de reacções de transcrição in vitro da etapa 4.6.
10. Iniciar a reação de transcrição in vitro com a adição de um molde de DNA. Misture o volume de reação pipetando suavemente.
11. Incubar tubos a 37 °C durante 5 min num termociclador ou bloco de calor.
12. Remova as reações do termociclador ou bloco de calor e adicione o corante de carregamento de RNA 2x contendo formamida a 50% a um volume de reação igual para interromper as reações de transcrição in vitro .
13. Desnaturar as enzimas incubando reações a 65 °C por 5 min em um termociclador ou bloco de calor.
14. Separar o RNA na mistura de reação de transcrição in vitro por eletroforese em gel usando géis de poliacrilamida de ureia TBE 10%-15% a 180 V por 30-45 min.
    NOTA: Dependendo das condições de eletroforese em gel, a solução tampão pode estar contaminada com nucleotídeos radiomarcados ou o gel pode conter a maioria ou todos os nucleotídeos radiomarcados. Planejar o armazenamento ou descarte adequado de radioatividade.
15. Imagem do RNA radiomarcado usando fosfotela após a remoção de qualquer porção do gel contendo ATP radiomarcado não incorporado. Expor o gel à fosfotela durante a noite (16 h) e imagem usando um imageador de fosfotela (resolução de 100 μm, tensão do tubo de 700 V PMT).
16. Analise os dados por meio de métodos de densitometria²⁴.

Resultados

Em uma reação de transcrição in vitro em que a etapa limitante da reação é o início da transcrição mediada pelo fator sigma, a atividade de transcrição deve aumentar linearmente com a quantidade de fator sigma. Apresentamos a preparação de experimentos de transcrição in vitro testando uma faixa de concentrações de RpoD juntamente com duas concentrações de RNA polimerase para observar o sinal variável resultante da incorporação de nucleotídeos radiomarcados em produtos de RNA. Res...

Discussão

Ensaios de transcrição in vitro construídos usando o protocolo apresentado foram recentemente utilizados para estudar o papel de um fator de transcrição em B. burgdorferi e podem ser aplicados para construir experimentos semelhantes usando outros fatores de transcrição, fatores sigma e moléculas²³. Uma vez que a RNA polimerase ativa de B. burgdorferi tenha sido obtida e sua atividade detectada, componentes e condições dentro dos ensaios de transcrição in ...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.45 micron syringe filter	Thermo Scientific	726-2545	Step 1.7 and 2.3
50 mL conical tubes	MidSci	C50B	Step 1.3, and subsequent steps
50 mL high-speed centrifuge tubes	Thermo Scientific	3119-0050PK	Step 1.2
500 mL Centrifuge bottles	Thermo Scientific	3120-9500PK	Step 1.1
B-PER and instruction manual	Thermo Scientific	78248	Step 1.4 and 2.2
Calcium chloride	Fisher Scientific	10035-04-8	Step 2.6
Centrifugal filters 10 Kd cutoff	Millipore Sigma	UFC8010	Step 1.11 and 2.11
Cobalt resin and instruction manual	Thermo Scientific	89969	Step 1.9
Dithiothreitol	Acros Organics	426380500	Step 1.4 and subsequent steps
Dnase (Nuclease)	Millipore Sigma	70746	Step 1.4 and 2.2
Factor Xa Protease	Haematologic Technologies	HCXA-0060	Step 2.6
GE Typhoon 5 Phosphoimager	GE lifesciences	Multiple	Step 4.15
Gel Imager	Bio-Rad	Mutiple	Step 1.13 and subsequent protien quality check steps
H2O for in vitro transcription	Fisher Scientific	7732-18-5	Step 3.2 and 3.3
high fidelity PCR kit	New England Biolabs	M0530S	Step 3.1
High-speed centrifuge	Eppendorf		Step 1.1, and subsequent steps
HiTrap Heparin HP 5 x 1 mL	Cytiva Life Sciences	17040601	Step 2.8
Imidazole	Sigma-Aldrich	56750-100G	Step 1.9
Lysozyme	Thermo Scientific	90082	Step 1.4 and 2.2
Magnesium chloride	Fisher Scientific	S25401	Step 4.1
Manganese chloride	Fisher Scientific	S25418	Step 4.1
Mini protean tetra cell	Bio-Rad	Mutiple	Step 1.13 and subsequent protien quality check steps
NP-40	Thermo Scientific	85124	Step 4.1
NTP mixture	Thermo Scientific	R0481	Step 4.1
PCR purification kit	Qiagen	28506	Step 3.2
PCR tubes	MidSci	PR-PCR28ACF	Step 1.12
PD-10 Sephadex buffer exchange column and instruction manual	Cytiva	17085101	Step 1.10 and 2.10 (gel filtration column)
pMAL Protein Fusion and Purification System Instruction manual	New England Biolabs	E8200S	Step 2.1
Polyacrylamide gels AnyKD	Bio-Rad	456-8125	Step 1.13 and subsequent protien quality check steps
Potassium glutamate	Sigma-Aldrich	G1251	Step 4.1
Protease inhibitor	Thermo Scientific	78425	Step 1.4 and 2.2
Radiolabeled ATP	Perkin Elmer	BLU503H	Step 4.2
RNA Loading Dye, (2x)	New England Biolabs	B0363S	Step 4.13
Rnase inhibitor	Thermo Scientific	EO0381	Step 4.1
Spectrophotometer	Biotek	Mutiple	Step 1.13 and subsequent protien quality check steps
TBE-Urea gels 10 percent	Bio-Rad	4566033	Step 4.14