Componentes essenciais de ensaios de transcrição in vitro de Borreliella (Borrelia) burgdorferi

Resumo

Ensaios de transcrição in vitro podem decifrar os mecanismos de regulação transcricional em Borreliella burgdorferi. Este protocolo descreve as etapas para purificar a RNA polimerase de B. burgdorferi e realizar reações de transcrição in vitro. Abordagens experimentais usando ensaios de transcrição in vitro requerem purificação e armazenamento confiáveis da RNA polimerase ativa.

Resumo

Borreliella burgdorferi é um patógeno bacteriano com repertórios metabólicos e genômicos limitados. B. burgdorferi transita extracelularmente entre vertebrados e carrapatos e remodela dramaticamente seu perfil transcricional para sobreviver em ambientes díspares durante a infecção. Um foco dos estudos de B. burgdorferi é entender claramente como a bactéria responde ao seu ambiente através de mudanças transcricionais. Ensaios de transcrição in vitro permitem dissecar bioquimicamente os mecanismos básicos de regulação transcricional. Aqui, apresentamos um protocolo detalhado descrevendo purificação e armazenamento da polimerase de RNA de B. burgdorferi , purificação do fator sigma, geração de molde de DNA e ensaios de transcrição in vitro . O protocolo descreve o uso da RNA polimerase purificada de B. burgdorferi 5A4 RpoC-His (5A4-RpoC). 5A4-RpoC é uma cepa publicada anteriormente que abriga um 10XHis-tag no gene rpoC que codifica a maior subunidade da RNA polimerase. Os ensaios de transcrição in vitro consistem na RNA polimerase purificada da cepa 5A4-RpoC, uma versão recombinante do fator sigma housekeeping RpoD e um molde de DNA de fita dupla gerado por PCR. Enquanto as técnicas de purificação de proteínas e as abordagens para montagem de ensaios de transcrição in vitro são conceitualmente bem compreendidas e relativamente comuns, as considerações de manuseio para RNA polimerases frequentemente diferem de organismo para organismo. O protocolo aqui apresentado destina-se a estudos enzimáticos da RNA polimerase de B. burgdorferi. O método pode ser adaptado para testar o papel de fatores de transcrição, promotores e modificações pós-traducionais na atividade da RNA polimerase.

Introdução

A doença de Lyme e a febre recidivante são causadas por patógenos espiroquetas dos gêneros Borrelia e Borreliella ^1,2,3. A doença de Lyme é uma proeminente doença transmitida por vetores na América do Norte e, consequentemente, a Borreliella burgdorferi é um organismo modelo proeminente para estudar a biologia das espiroquetas ^4,5. Investigações sobre os mecanismos de regulação transcricional de B. burgdorferi visam compreender melhor suas adaptações às mudanças no ambiente à medida....

Protocolo

1. Purificação da RNA polimerase e preparação do estoque de RNA polimerase

1. Coletar o pellet celular de 2-4 L de B. burgdorferi RpoC-His10X cultivado em meio BSKII em ambiente microaerofílico (34 °C, 5% CO 2, 3% O 2) a uma densidade de_2-4 x 10⁷ células/mL utilizando protocolos de coleta celular previamente descritos^28,29. Realizar centrifugação a 10.000 x g a 4 °C por 30 min em frascos centrífugos de 500 mL e despejar o sobrenadante.
2. Ressuspender as células em 30 mL de tampão HN gelado (10 mM HEPES, 10 mM NaCl, pH 8,0). Repi....

Resultados

Em uma reação de transcrição in vitro em que a etapa limitante da reação é o início da transcrição mediada pelo fator sigma, a atividade de transcrição deve aumentar linearmente com a quantidade de fator sigma. Apresentamos a preparação de experimentos de transcrição in vitro testando uma faixa de concentrações de RpoD juntamente com duas concentrações de RNA polimerase para observar o sinal variável resultante da incorporação de nucleotídeos radiomarcados em produtos de RNA. Res.......

Discussão

Ensaios de transcrição in vitro construídos usando o protocolo apresentado foram recentemente utilizados para estudar o papel de um fator de transcrição em B. burgdorferi e podem ser aplicados para construir experimentos semelhantes usando outros fatores de transcrição, fatores sigma e moléculas²³. Uma vez que a RNA polimerase ativa de B. burgdorferi tenha sido obtida e sua atividade detectada, componentes e condições dentro dos ensaios de transcrição in .......

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.45 micron syringe filter	Thermo Scientific	726-2545	Step 1.7 and 2.3
50 mL conical tubes	MidSci	C50B	Step 1.3, and subsequent steps
50 mL high-speed centrifuge tubes	Thermo Scientific	3119-0050PK	Step 1.2
500 mL Centrifuge bottles	Thermo Scientific	3120-9500PK	Step 1.1
B-PER and instruction manual	Thermo Scientific	78248	Step 1.4 and 2.2
Calcium chloride	Fisher Scientific	10035-04-8	Step 2.6
Centrifugal filters 10 Kd cutoff	Millipore Sigma	UFC8010	Step 1.11 and 2.11
Cobalt resin and instruction manual	Thermo Scientific	89969	Step 1.9
Dithiothreitol	Acros Organics	426380500	Step 1.4 and subsequent steps
Dnase (Nuclease)	Millipore Sigma	70746	Step 1.4 and 2.2
Factor Xa Protease	Haematologic Technologies	HCXA-0060	Step 2.6
GE Typhoon 5 Phosphoimager	GE lifesciences	Multiple	Step 4.15
Gel Imager	Bio-Rad	Mutiple	Step 1.13 and subsequent protien quality check steps
H2O for in vitro transcription	Fisher Scientific	7732-18-5	Step 3.2 and 3.3
high fidelity PCR kit	New England Biolabs	M0530S	Step 3.1
High-speed centrifuge	Eppendorf		Step 1.1, and subsequent steps
HiTrap Heparin HP 5 x 1 mL	Cytiva Life Sciences	17040601	Step 2.8
Imidazole	Sigma-Aldrich	56750-100G	Step 1.9
Lysozyme	Thermo Scientific	90082	Step 1.4 and 2.2
Magnesium chloride	Fisher Scientific	S25401	Step 4.1
Manganese chloride	Fisher Scientific	S25418	Step 4.1
Mini protean tetra cell	Bio-Rad	Mutiple	Step 1.13 and subsequent protien quality check steps
NP-40	Thermo Scientific	85124	Step 4.1
NTP mixture	Thermo Scientific	R0481	Step 4.1
PCR purification kit	Qiagen	28506	Step 3.2
PCR tubes	MidSci	PR-PCR28ACF	Step 1.12
PD-10 Sephadex buffer exchange column and instruction manual	Cytiva	17085101	Step 1.10 and 2.10 (gel filtration column)
pMAL Protein Fusion and Purification System Instruction manual	New England Biolabs	E8200S	Step 2.1
Polyacrylamide gels AnyKD	Bio-Rad	456-8125	Step 1.13 and subsequent protien quality check steps
Potassium glutamate	Sigma-Aldrich	G1251	Step 4.1
Protease inhibitor	Thermo Scientific	78425	Step 1.4 and 2.2
Radiolabeled ATP	Perkin Elmer	BLU503H	Step 4.2
RNA Loading Dye, (2x)	New England Biolabs	B0363S	Step 4.13
Rnase inhibitor	Thermo Scientific	EO0381	Step 4.1
Spectrophotometer	Biotek	Mutiple	Step 1.13 and subsequent protien quality check steps
TBE-Urea gels 10 percent	Bio-Rad	4566033	Step 4.14