Wesentliche Bestandteile von Borreliella (Borrelia) burgdorferi In-vitro-Transkriptionsassays

Zusammenfassung

In-vitro-Transkriptionsassays können die Mechanismen der Transkriptionsregulation in Borreliella burgdorferi entschlüsseln. Dieses Protokoll beschreibt die Schritte zur Aufreinigung der B. burgdorferi RNA-Polymerase und zur Durchführung von In-vitro-Transkriptionsreaktionen. Experimentelle Ansätze mit In-vitro-Transkriptionsassays erfordern eine zuverlässige Aufreinigung und Lagerung der aktiven RNA-Polymerase.

Zusammenfassung

Borreliella burgdorferi ist ein bakterieller Erreger mit begrenzten metabolischen und genomischen Repertoires. B. burgdorferi transpiriert extrazellulär zwischen Wirbeltieren und Zecken und verändert sein Transkriptionsprofil dramatisch, um während der Infektion in unterschiedlichen Umgebungen zu überleben. Ein Schwerpunkt der Studien von B. burgdorferi ist es, klar zu verstehen, wie das Bakterium durch transkriptionelle Veränderungen auf seine Umgebung reagiert. In-vitro-Transkriptionsassays ermöglichen es, die grundlegenden Mechanismen der Transkriptionsregulation biochemisch zu analysieren. In dieser Arbeit stellen wir ein detailliertes Protokoll vor, das die Reinigung und Lagerung von B. burgdorferi RNA-Polymerase, die Aufreinigung des Sigma-Faktors, die Generierung von DNA-Vorlagen und In-vitro-Transkriptionsassays beschreibt. Das Protokoll beschreibt die Verwendung von RNA-Polymerase, die aus B. burgdorferi 5A4 RpoC-His (5A4-RpoC) gereinigt wurde. 5A4-RpoC ist ein bereits publizierter Stamm, der einen 10XHis-Tag auf dem rpoC-Gen trägt, das für die größte Untereinheit der RNA-Polymerase kodiert. In-vitro-Transkriptionsassays bestehen aus der RNA-Polymerase, die aus dem Stamm 5A4-RpoC gereinigt wurde, einer rekombinanten Version des Housekeeping-Sigma-Faktors RpoD und einer PCR-generierten doppelsträngigen DNA-Vorlage. Während die Proteinreinigungstechniken und -ansätze zur Assemblierung von In-vitro-Transkriptionsassays konzeptionell gut verstanden und relativ verbreitet sind, unterscheiden sich die Überlegungen zur Handhabung von RNA-Polymerasen oft von Organismus zu Organismus. Das hier vorgestellte Protokoll ist für enzymatische Untersuchungen an der B. burgdorferi RNA-Polymerase konzipiert. Die Methode kann angepasst werden, um die Rolle von Transkriptionsfaktoren, Promotoren und posttranslationalen Modifikationen auf die Aktivität der RNA-Polymerase zu testen.

Einleitung

Borreliose und Rezidivfieber werden durch Spirochätenerreger der Gattungen Borrelien und Borreliella^{verursacht 1,2,3}. Die Lyme-Borreliose ist eine prominente vektorübertragene Krankheit in Nordamerika, und daher ist Borreliella burgdorferi ein prominenter Modellorganismus zur Untersuchung der Spirochätenbiologie ^4,5. Untersuchungen der Mechanismen der transkriptionellen Regulation von B. burgdorferi zielen darauf ab, seine Anpassungen an Veränderungen in der Umwelt besser zu verstehen, während er zwischen seinem Zeckenvektor und Säugetierwirten wechselt ^6,7. Veränderungen des pH-Werts, der Temperatur, der Osmolarität, der Nährstoffverfügbarkeit, der kurzkettigen Fettsäuren, der organischen Säuren sowie des Gehalts an gelöstem Sauerstoff und Kohlendioxid modulieren die Expression von Genen, die für das Überleben von B. burgdorferi in seinem Arthropodenvektor und für die Infektion von Tieren wichtig sind 8,9,10,11,12,13,14,15^,16,17,18. Die Verknüpfung dieser Reaktionen auf Reize mit regulatorischen Mechanismen war ein wichtiger Aspekt der Forschung von B. burgdorferi ¹⁹.

Transkriptionsfaktoren und Sigma-Faktoren steuern die Transkription von Genen, die zelluläre Prozesse ausführen. Lyme-Borreliose und schubförmige Spirochäten beherbergen eine relativ spärliche Anzahl von Transkriptionsfaktoren und alternativen Sigmafaktoren. Trotzdem gibt es komplexe transkriptionelle Veränderungen, die die Reaktionen von B. burgdorferi auf die Umwelt lenken^20,21,22. Die spezifischen Mechanismen, die zu transkriptionellen Veränderungen in B. burgdorferi als Reaktion auf Umweltveränderungen führen, sind noch unklar. In-vitro-Transkriptionsassays sind leistungsstarke Werkzeuge für die Anwendung eines biochemischen Ansatzes zur Untersuchung der Funktion und der regulatorischen Mechanismen von Transkriptionsfaktoren und Sigma-Faktoren^23,24,25,26.

Ein In-vitro-Transkriptionsassay-System mit der RNA-Polymerase von B. burgdorferi wurde kürzlich etabliert²⁴. Da Bakterien oft eine einzigartige zelluläre Physiologie aufweisen, reagieren RNA-Polymerasen verschiedener Spezies und Gattungen unterschiedlich auf Enzymreinigung, Enzymspeicherung und Reaktionspufferbedingungen²⁷. B. burgdorferi ist auch genetisch weit von den vielen Bakterienarten entfernt, an denen RNA-Polymerasen untersucht wurden²⁰. Aspekte der Enzymvorbereitung wie Lyse-, Wasch- und Elutionspufferbedingungen, Speicherpuffer, In-vitro-Transkriptionsreaktionspuffer und die Methode der Assay-Konstruktion können alle die RNA-Polymerase-Aktivität verändern. In dieser Arbeit stellen wir ein Protokoll für die Aufreinigung von RNA-Polymerase und Sigma-Faktor RpoD, die Herstellung von linearen doppelsträngigen DNA-Matrizen und die Konstruktion von In-vitro-Transkriptionsassays zur Verfügung, um die Reproduzierbarkeit zwischen Laboratorien, die dieses System verwenden, zu erleichtern. Wir beschreiben eine Beispielreaktion, um den linearen Bereich für die RpoD-abhängige Transkription zu demonstrieren und diskutieren Einschränkungen und Alternativen zu diesem Ansatz.

Protokoll

1. Aufreinigung der RNA-Polymerase und Herstellung des RNA-Polymerase-Stammes

1. Das Zellpellet wird aus 2-4 l B. burgdorferi RpoC-His10X, kultiviert in BSKI-Medium in einer mikroaerophilen Umgebung (34 °C, 5 % CO 2, 3 %_O2) auf eine Dichte von_2-4 x 10⁷ Zellen/ml unter Verwendung der zuvor beschriebenen Zellentnahmeprotokolle^{gesammelt 28,29}. Die Zentrifugation bei 10.000 x g bei 4 °C für 30 min in 500-ml-Zentrifugalflaschen durchführen und den Überstand abgießen.
2. Resuspendieren Sie die Zellen in 30 ml eiskaltem HN-Puffer (10 mM HEPES, 10 mM NaCl, pH 8,0). Wiederholen Sie den Zentrifugationsschritt wie oben beschrieben mit einem 50-ml-Zentrifugenröhrchen und dekantieren Sie den Überstand.
   Anmerkungen: Haltepunkt. Frieren Sie das Zellpellet bei −80 °C ein, um die Zellen bis zu 2 Wochen zu lagern, oder fahren Sie sofort mit der Zelllyse fort.
3. Bewahren Sie die Zellen, das Lysat und die gereinigten Proteine bei 4 °C oder auf Eis auf, es sei denn, sie frieren ein. Halten Sie die RNA-Polymerase in einer reduzierenden Umgebung, indem Sie jedem in diesem Protokoll verwendeten Puffer frisch zubereitetes DTT in einer Konzentration von 2 mM hinzufügen und den pH-Wert 8,0 aufrechterhalten.
4. Bereiten Sie das Lysat aus dem B. burgdorferi-Zellpellet mit einem handelsüblichen bakteriellen Lysekit gemäß den Anweisungen des Kits vor. Resuspendieren Sie das Pellet in 10-15 ml B-Per-Lösung bei Raumtemperatur (RT) OHNE Proteasehemmer und lassen Sie die Lyse 5 Minuten lang auf Eis fortsetzen. Das Lysevolumen hängt von der Größe des Zellpellets ab, wie in der Bauanleitung beschrieben.
5. Fügen Sie der Lyselösung einen Proteasehemmer-Cocktail hinzu, gefolgt von drei Beschallungsrunden, wie im Abschnitt "Repräsentative Ergebnisse" beschrieben.
   HINWEIS: Alternativ können die Zellen in einer französischen Druckzelle wie zuvor beschrieben lysiert^{werden 24}. Überspringen Sie Schritt 1.4. und Schritt 1.5.
6. Klären Sie das Zelllysat durch Zentrifugation und Filtration mit einem 50-ml-Zentrifugenröhrchen. Füllen Sie das Volumen des Röhrchens auf mindestens 30 ml Gesamtvolumen, indem Sie der Lösung Kobaltsäulen-Ladepuffer (Tabelle 1) hinzufügen. Pelletieren Sie die Zelltrümmer durch Zentrifugation bei 20.000 x g für 30 Minuten.
7. Filtrieren Sie den Überstand mit einem 0,45 μm Spritzenvorsatzfilter.
8. Verdünnen Sie das Lysat in Kobaltsäulenbeladungspuffer (Tabelle 1) mit einem Endverdünnungsverhältnis von 1:10.
9. Führen Sie eine Affinitätschromatographie des geklärten Zelllysatüberstandes unter Verwendung einer Kobalt- oder Nickelharzsäule gemäß den Anweisungen des Herstellers durch. Ein Beispiel finden Sie im Abschnitt "Repräsentative Ergebnisse". Verwenden Sie die in Tabelle 1 aufgeführten Puffer. Sammeln Sie die Durchfluss-, Wasch- und Elutionsproben für die Analyse.
10. Tauschen Sie die RNA-Polymerase in der Elutionspufferlösung sofort unter Verwendung einer Pufferaustauschsäule gemäß den Anweisungen des Herstellers in eine RNA-Polymerase-Speicherpufferlösung (Tabelle 1) aus.
11. Bereiten Sie die Gefriervorräte vor, indem Sie die RNA-Polymerase mit 10 kDa-Cutoff-Zentrifugalfiltereinheiten auf eine spektralphotometrisch bestimmte Konzentration von 0,2-0,4 mg/ml konzentrieren (A_{280 nm} ohne Anpassung des Extinktionskoeffizienten [1 abs bei 1 cm = 1 mg·ml⁻¹]).
12. Aliquot RNA-Polymerase gefriert in 20-50 μL Volumen in PCR-Röhrchen und lagert die RNA-Polymerase bei −80 °C.
13. Bestimmen Sie die Qualität der Affinitätschromatographie mit SDS-PAGE und messen Sie die Gesamtproteinausbeute mittels Spektrophotometrie oder BCA-Assay. Lassen Sie die Proben 50 Minuten lang auf einem 7,5%igen Polyacrylamid-Gel bei 120 V laufen, um eine gute Auflösung durch SDS-PAGE zu erzielen.

2. Aufreinigung von rekombinantem RpoD und Herstellung von RpoD-Bestand

1. Kultur und Induktion der Expression von Maltose Binding Protein-tagged recombinant B. burgdorferi RpoD (MBP-RpoD) in BL21::MBP-RpoD_Bb, wie in der Bedienungsanleitung des Proteinfusions- und -reinigungssystems beschrieben, die in der Materialtabelle aufgeführt ist, und Entnahme der Zellen durch Zentrifugation.
   Anmerkungen: Haltepunkt. Frieren Sie die Zellpellets bei −80 °C ein, um die Zellen bis zu 2 Wochen zu lagern, oder fahren Sie sofort mit der Zelllyse fort.
2. Führen Sie die Lyse mit einem handelsüblichen bakteriellen Zelllysekit oder einer französischen Druckzelle durch. Das Beispiel für einen Lysepuffer finden Sie in Tabelle 1.
3. Klärung des Zelllysats durch Zentrifugation und Filtration. Pelletieren Sie die Zelltrümmer durch Zentrifugation bei 20.000 x g für 30 Minuten. Filtern Sie den Überstand mit einem 0,45-μm-Filter.
4. Extrahieren Sie MBP-RpoD unter Verwendung eines Proteinextraktionsprotokolls für das Expressionssystem. Im Abschnitt "Repräsentative Ergebnisse" finden Sie z. B. Implementierungsdetails und -ergebnisse.
5. Bestimmung der Qualität des Affinitätschromatographie-Prozesses und der Elution mittels SDS-PAGE und Messung der Proteinausbeute mittels Spektrophotometrie (A_280nm ohne Anpassung des Extinktionskoeffizienten [1 abs bei 1 cm = 1 mg·mL⁻¹]). Verwenden Sie 10% Polyacrylamid-Gel bei 200 V für 30 min zur Trennung in SDS-PAGE.
6. MBP-RpoD wird mit einem Zentrifugalfilter mit 10 kDa-Abschaltung auf eine spektrophotometrisch ermittelte Konzentration von >2 mg/ml konzentriert.
7. Trennen Sie MBP von RpoD an der Faktor-Xa-Spaltstelle. Fügen Sie CaCl 2 zu den Affinitätschromatographie-Elutionsfraktionen hinzu, die MBP-RpoD in einer Konzentration von₂ mM enthalten. Fügen Sie 200 μg Faktor-Xa-Protease pro 30 mg gereinigtem Protein hinzu. Über Nacht bei RT inkubieren.
8. Bestätigen Sie die vollständige Spaltung von MBP von RpoD durch SDS-PAGE. Verwenden Sie 10% Polyacrylamid-Gel bei 200 V für 30 min zur Trennung in SDS-PAGE.
9. Die MBP- und RpoD-haltige Lösung wird im Verhältnis 1:10 mit einem Heparin-bindenden Puffer verdünnt.
10. Trennen Sie MBP und RpoD auf der Heparinsäule mittels FPLC. In Tabelle 2 finden Sie Informationen zu den FPLC-Einstellungen.
11. Bestimmen Sie die Qualität der Affinitätschromatographieprodukte mit SDS-PAGE und messen Sie die Proteinausbeute mittels Spektrophotometrie. Verwenden Sie 10% Polyacrylamid-Gel bei 200 V für 30 min zur Trennung in SDS-PAGE.
12. Die RpoD-haltigen Elutionsfraktionen werden mit einem 10 kDa-Cutoff-Zentrifugalfilter auf ein Endvolumen von 2-3 ml konzentriert.
13. Puffer tauschen die konzentrierten RpoD-Elutionsfraktionen mit Hilfe einer Gelfiltrationssäule in Speicherpuffer aus.
14. Konzentrieren Sie den RpoD-Stamm mit einem 10-kDa-Cutoff-Zentrifugalfilter auf eine spektralphotometrisch ermittelte Konzentration von 0,2-0,8 mg/ml.
15. Aliquot RpoD-Vorrat bei 20-50 μL Volumen in PCR-Röhrchen und bei −80 °C lagern.

3. Herstellung von DNA-Vorlagenmaterial

1. Die PCR amplifiziert die 500 bp große Region um eine RpoD-getriebene Promotorstelle aus genomischer DNA von B. burgdorferi mit Hilfe einer 200 μL Reaktion (Tabelle 3).
2. Reinigen Sie die PCR-Produkte mit einem handelsüblichen PCR-Aufreinigungskit. Elute die DNA in molekularbiologischer Klasse_H2O.
3. Die molare Konzentration der PCR-generierten DNA-Templates wird durch Verdünnung in molekularbiologischer Klasse_H2Oauf 100 nM eingestellt.

4. Führen Sie eine In-vitro-Transkription unter Einbeziehung von radioaktiv markierten Nukleotiden durch

1. Erstellen Sie einen experimentellen Plan für die In-vitro-Transkription . Bestimmen Sie die Konzentrationen der RNA-Polymerase, des RpoD und der DNA-Matrize. Bestimmen Sie die aliquoten Volumina und Pipettierreihenfolgen für die Reaktionsröhrchen. Ein Beispiel finden Sie in Tabelle 4 und Abbildung 1 .
   HINWEIS: Nehmen Sie Kontrollen in den Versuchsplan auf, z. B. Reaktionen, die keine RNA-Polymerase, alternative Polymerase, kein Template oder alternative Templates enthalten.
2. Berechnen Sie das Volumen von ^α-32P-ATP, das für das Experiment benötigt wird. Bauen Sie dies in den Versuchsplan ein. In der Regel werden 2 μCi Aktivität pro In-vitro-Transkriptionsreaktion für den Phosphorscreen-Nachweis angegeben.
3. Bereiten Sie die Arbeitsflächen, einschließlich der Bestrahlungsbank, vor, um das Risiko einer Strahlenkontamination zu verringern.
4. Frische Aliquots von RNA-Polymerase, Rpo, 5x-Puffer-NTP und Template-Stammlösungen auf Eis auftauen. Mischen Sie alle aufgetauten gefrorenen Brühen vor dem Pipettieren gründlich.
5. Bereiten Sie ein Master-Reaktionsgemisch und ein separates NTP-Gemisch für radioaktiv markierte Nukleotide gemäß dem Versuchsplan vor.
6. Dispensieren Sie die Kontrollreaktionen und Experimentiersets in PCR-Röhrchen, um die Zugabe von Radiomarkierung in die Reaktion vorzubereiten. _H2O, Reaktionsmastermix, RNA-Polymerase und RpoD vorsichtig in dafür vorgesehene PCR-Röhrchen dosieren und durch Pipettieren mischen.
7. Übertragen Sie die vorbereiteten Materialien auf eine Bestrahlungsbank.
8. Fügen Sie ^α-32P-ATP zu NTP hinzu und mischen Sie es durch sanftes Pipettieren.
   VORSICHT: Verwenden Sie bei der Arbeit mit radioaktivem Material geeignete Schutzausrüstung und Handhabungsverfahren für radioaktive Isotope.
9. NTP wird in die Röhrchen gegeben, die die In-vitro-Transkriptionsreaktionsgemische aus Schritt 4.6 enthalten.
10. Starten Sie die In-vitro-Transkriptionsreaktion mit der Zugabe einer DNA-Vorlage . Mischen Sie das Reaktionsvolumen durch vorsichtiges Pipettieren.
11. Röhrchen bei 37 °C für 5 min in einem Thermocycler oder Heizblock inkubieren.
12. Entfernen Sie die Reaktionen aus dem Thermocycler oder Heizblock und fügen Sie den 2x RNA-Beladungsfarbstoff mit 50 % Formamid zu einem gleichen Reaktionsvolumen hinzu, um In-vitro-Transkriptionsreaktionen zu stoppen.
13. Denaturieren Sie die Enzyme, indem Sie Reaktionen bei 65 °C für 5 min in einem Thermocycler oder Heizblock inkubieren.
14. Trennen Sie die RNA in der In-vitro-Transkriptionsreaktionsmischung durch Gelelektrophorese unter Verwendung von 10%-15%igen FSME-Harnstoffpolyacrylamidgelen bei 180 V für 30-45 min.
    Anmerkungen: Abhängig von den Bedingungen der Gelelektrophorese kann die Pufferlösung mit radioaktiv markierten Nukleotiden kontaminiert sein oder das Gel kann die meisten oder alle radioaktiv markierten Nukleotide enthalten. Planen Sie die ordnungsgemäße Lagerung oder Entsorgung von Radioaktivität ein.
15. Stellen Sie die radioaktiv markierte RNA mit einem Phosphoscreen dar, nachdem Sie einen Teil des Gels entfernt haben, der nicht inkorporiertes radioaktiv markiertes ATP enthält. Belichten Sie das Gel über Nacht (16 h) mit dem Phosphoscreen und fotografieren Sie es mit einem Phosphoscreen-Imager (100 μm Auflösung, 700 V PMT-Röhrenspannung).
16. Analysieren Sie die Daten mit Densitometrie-Methoden²⁴.

Ergebnisse

Bei einer in vitro Transkriptionsreaktion, bei der der limitierende Schritt der Reaktion die Sigma-Faktor-vermittelte Transkriptionsinitiierung ist, sollte die Transkriptionsaktivität linear mit der Menge des Sigma-Faktors zunehmen. Wir stellen die Vorbereitung von in vitro Transkriptionsexperimenten vor, bei denen eine Reihe von RpoD-Konzentrationen zusammen mit zwei Konzentrationen von RNA-Polymerase getestet werden, um das resultierende unterschiedliche Signal des radioaktiv markierten Nukleotideinbaus i...

Diskussion

In-vitro-Transkriptionsassays, die mit dem vorgestellten Protokoll konstruiert wurden, wurden kürzlich verwendet, um die Rolle eines Transkriptionsfaktors in B. burgdorferi zu untersuchen, und können für ähnliche Experimente mit anderen Transkriptionsfaktoren, Sigma-Faktoren und Molekülen verwendet werden²³. Sobald die aktive RNA-Polymerase aus B. burgdorferi gewonnen und ihre Aktivität nachgewiesen wurde, können Komponenten und Bedingungen innerhalb der In-vitro-...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.45 micron syringe filter	Thermo Scientific	726-2545	Step 1.7 and 2.3
50 mL conical tubes	MidSci	C50B	Step 1.3, and subsequent steps
50 mL high-speed centrifuge tubes	Thermo Scientific	3119-0050PK	Step 1.2
500 mL Centrifuge bottles	Thermo Scientific	3120-9500PK	Step 1.1
B-PER and instruction manual	Thermo Scientific	78248	Step 1.4 and 2.2
Calcium chloride	Fisher Scientific	10035-04-8	Step 2.6
Centrifugal filters 10 Kd cutoff	Millipore Sigma	UFC8010	Step 1.11 and 2.11
Cobalt resin and instruction manual	Thermo Scientific	89969	Step 1.9
Dithiothreitol	Acros Organics	426380500	Step 1.4 and subsequent steps
Dnase (Nuclease)	Millipore Sigma	70746	Step 1.4 and 2.2
Factor Xa Protease	Haematologic Technologies	HCXA-0060	Step 2.6
GE Typhoon 5 Phosphoimager	GE lifesciences	Multiple	Step 4.15
Gel Imager	Bio-Rad	Mutiple	Step 1.13 and subsequent protien quality check steps
H2O for in vitro transcription	Fisher Scientific	7732-18-5	Step 3.2 and 3.3
high fidelity PCR kit	New England Biolabs	M0530S	Step 3.1
High-speed centrifuge	Eppendorf		Step 1.1, and subsequent steps
HiTrap Heparin HP 5 x 1 mL	Cytiva Life Sciences	17040601	Step 2.8
Imidazole	Sigma-Aldrich	56750-100G	Step 1.9
Lysozyme	Thermo Scientific	90082	Step 1.4 and 2.2
Magnesium chloride	Fisher Scientific	S25401	Step 4.1
Manganese chloride	Fisher Scientific	S25418	Step 4.1
Mini protean tetra cell	Bio-Rad	Mutiple	Step 1.13 and subsequent protien quality check steps
NP-40	Thermo Scientific	85124	Step 4.1
NTP mixture	Thermo Scientific	R0481	Step 4.1
PCR purification kit	Qiagen	28506	Step 3.2
PCR tubes	MidSci	PR-PCR28ACF	Step 1.12
PD-10 Sephadex buffer exchange column and instruction manual	Cytiva	17085101	Step 1.10 and 2.10 (gel filtration column)
pMAL Protein Fusion and Purification System Instruction manual	New England Biolabs	E8200S	Step 2.1
Polyacrylamide gels AnyKD	Bio-Rad	456-8125	Step 1.13 and subsequent protien quality check steps
Potassium glutamate	Sigma-Aldrich	G1251	Step 4.1
Protease inhibitor	Thermo Scientific	78425	Step 1.4 and 2.2
Radiolabeled ATP	Perkin Elmer	BLU503H	Step 4.2
RNA Loading Dye, (2x)	New England Biolabs	B0363S	Step 4.13
Rnase inhibitor	Thermo Scientific	EO0381	Step 4.1
Spectrophotometer	Biotek	Mutiple	Step 1.13 and subsequent protien quality check steps
TBE-Urea gels 10 percent	Bio-Rad	4566033	Step 4.14