JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

İn vitro transkripsiyon testleri, Borreliella burgdorferi'deki transkripsiyonel düzenleme mekanizmalarını deşifre edebilir. Bu protokol, B. burgdorferi RNA polimerazını saflaştırma ve in vitro transkripsiyon reaksiyonlarını gerçekleştirme adımlarını açıklar. İn vitro transkripsiyon testlerini kullanan deneysel yaklaşımlar, aktif RNA polimerazın güvenilir saflaştırılmasını ve depolanmasını gerektirir.

Özet

Borreliella burgdorferi , sınırlı metabolik ve genomik repertuarlara sahip bakteriyel bir patojendir. B. burgdorferi , omurgalılar ve keneler arasında hücre dışı geçiş yapar ve enfeksiyon sırasında farklı ortamlarda hayatta kalmak için transkripsiyonel profilini çarpıcı bir şekilde yeniden şekillendirir. B. burgdorferi çalışmalarının odak noktası, bakterilerin transkripsiyonel değişiklikler yoluyla çevresine nasıl tepki verdiğini açıkça anlamaktır. İn vitro transkripsiyon testleri, transkripsiyonel regülasyonun temel mekanizmalarının biyokimyasal olarak diseke edilmesine izin verir. Burada, B. burgdorferi RNA polimeraz saflaştırma ve depolama, sigma faktör saflaştırma, DNA şablon oluşturma ve in vitro transkripsiyon tahlillerini açıklayan ayrıntılı bir protokol sunuyoruz. Protokol, B. burgdorferi 5A4 RpoC-His (5A4-RpoC) 'den saflaştırılmış RNA polimerazın kullanımını açıklar. 5A4-RpoC, RNA polimerazın en büyük alt birimini kodlayan rpoC geni üzerinde 10XHis etiketi barındıran daha önce yayınlanmış bir suştur. İn vitro transkripsiyon testleri, 5A4-RpoC suşundan saflaştırılmış RNA polimerazdan, temizlik sigma faktörü RpoD'nin rekombinant bir versiyonundan ve PCR tarafından üretilen çift sarmallı bir DNA şablonundan oluşur. Protein saflaştırma teknikleri ve in vitro transkripsiyon tahlillerinin birleştirilmesine yönelik yaklaşımlar kavramsal olarak iyi anlaşılmış ve nispeten yaygın olsa da, RNA polimerazları için ele alma hususları genellikle organizmadan organizmaya farklılık gösterir. Burada sunulan protokol, B. burgdorferi RNA polimeraz üzerindeki enzimatik çalışmalar için tasarlanmıştır. Yöntem, transkripsiyon faktörlerinin, promotörlerin ve translasyonel sonrası modifikasyonların RNA polimerazın aktivitesi üzerindeki rolünü test etmek için uyarlanabilir.

Giriş

Lyme hastalığı ve tekrarlayan ateş, Borrelia ve Borreliella 1,2,3 cinslerindeki spiroket patojenlerinden kaynaklanır. Lyme hastalığı, Kuzey Amerika'da belirgin bir vektör kaynaklı hastalıktır ve sonuç olarak, Borreliella burgdorferi, spiroket biyolojisini incelemek için önde gelen bir model organizmadır 4,5. Transkripsiyonel düzenlemenin B. burgdorferi mekanizmalarına yönelik araştırmalar, kene vektörü ile memeli konakçıları arasında dönerken çevredeki değişikliklere adaptasyonlarını daha iyi anlamayı amaçlamaktadır 6,7. pH, sıcaklık, ozmolarite, besin mevcudiyeti, kısa zincirli yağ asitleri, organik asitler ve çözünmüş oksijen ve karbondioksit seviyelerindeki değişiklikler, B. burgdorferi'nin eklembacaklı vektöründe hayatta kalması ve hayvanları enfekte etmesi için önemli olan genlerin ekspresyonunu modüle eder 8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18. Bu tepkileri uyaranlara düzenleyici mekanizmalarla ilişkilendirmek, B. burgdorferi araştırmasının önemli bir yönü olmuştur19.

Transkripsiyon faktörleri ve sigma faktörleri, hücresel süreçleri gerçekleştiren genlerin transkripsiyonunu kontrol eder. Lyme ve tekrarlayan ateş spiroketleri, nispeten seyrek bir transkripsiyon faktörleri seti ve alternatif sigma faktörleri barındırır. Buna rağmen, B. burgdorferi'nin çevreye verdiği tepkileri yönlendiren karmaşık transkripsiyonel değişiklikler vardır20,21,22. Çevresel değişikliklere yanıt olarak B. burgdorferi'deki transkripsiyonel değişiklikleri yönlendiren spesifik mekanizmalar belirsizliğini korumaktadır. İn vitro transkripsiyon testleri, transkripsiyon faktörlerinin ve sigma faktörlerinin işlevini ve düzenleyici mekanizmalarını test etmek için biyokimyasal bir yaklaşım kullanmak için güçlü araçlardır23,24,25,26.

B. burgdorferi RNA polimerazı kullanan bir in vitro transkripsiyon tahlil sistemi yakın zamanda kurulmuştur24. Bakteriler genellikle benzersiz hücresel fizyolojilere sahip olduklarından, farklı türlerin ve cinslerin RNA polimerazları enzim saflaştırma, enzim depolama ve reaksiyon tamponu koşullarına farklı tepki verir27. B. burgdorferi ayrıca RNA polimerazlarının incelendiği birçok bakteri türünden genetik olarak uzaktır20. Lizis, yıkama ve elüsyon tamponu koşulları, depolama tamponu, in vitro transkripsiyon reaksiyon tamponu ve tahlil yapım yöntemi gibi enzim preparatının yönleri, RNA polimeraz aktivitesini değiştirebilir. Burada, RNA polimeraz ve sigma faktörü RpoD'nin saflaştırılması, doğrusal çift sarmallı DNA şablonunun üretimi ve bu sistemi kullanan laboratuvarlar arasında tekrarlanabilirliği kolaylaştırmak için in vitro transkripsiyon testlerinin inşası için bir protokol sunuyoruz. RpoD'ye bağımlı transkripsiyon için doğrusal aralığı göstermek ve bu yaklaşımın sınırlamalarını ve alternatiflerini tartışmak için örnek bir reaksiyonu detaylandırıyoruz.

Protokol

1. RNA polimerazın saflaştırılması ve RNA polimeraz stoğunun hazırlanması

  1. Hücre peletini mikroaerofilik bir ortamda (34 °C, %5 CO 2, %3 O 2) BSKII ortamında kültürlenmiş 2-4 L B. burgdorferi RpoC-His10X'ten, daha önce tarif edilen hücre toplama protokolleri28,29'u kullanarak2-4 x 107 hücre/mL yoğunluğa kadar toplayın. 500 mL santrifüjlü şişelerde 30 dakika boyunca 4 ° C'de 10.000 x g'de santrifüjleme yapın ve süpernatanı dökün.
  2. Hücreleri 30 mL buz gibi soğuk HN tamponunda (10 mM HEPES, 10 mM NaCl, pH 8.0) yeniden askıya alın. Santrifüjleme adımını yukarıda açıklandığı gibi 50 mL'lik bir santrifüj tüpü kullanarak tekrarlayın ve süpernatanı boşaltın.
    NOT: Durma noktası. Hücreleri 2 haftaya kadar saklamak için hücre peletini -80 ° C'de dondurun veya hemen hücre lizine devam edin.
  3. Hücreleri, lizatı ve saflaştırılmış proteinleri donmadıkça 4 ° C'de veya buz üzerinde tutun. Bu protokolde kullanılan her tampona 2 mM konsantrasyonda taze hazırlanmış DTT ekleyerek RNA polimerazı indirgeyici bir ortamda tutun ve pH 8.0'ı koruyun.
  4. Kit talimatlarını izleyerek ticari bir bakteriyel lizis kiti kullanarak B. burgdorferi hücre peletinden lizat hazırlayın. Pelet, proteaz inhibitörü olmadan 10-15 mL oda sıcaklığı (RT) B-PER çözeltisinde tekrar askıya alın ve lizisin buz üzerinde 5 dakika ilerlemesine izin verin. Lizis hacmi, kit talimatlarında açıklandığı gibi hücre pelet boyutuna bağlıdır.
  5. Lizis çözeltisine proteaz inhibitörü kokteyli ekleyin, ardından temsili sonuçlar bölümünde açıklandığı gibi üç tur sonikasyon ekleyin.
    NOT: Alternatif olarak, hücreleri daha önce24'te açıklandığı gibi bir Fransız basınç hücresinde lize edin. 1.4 adımını atlayın. ve adım 1.5.
  6. Santrifüjleme ve 50 mL'lik bir santrifüj tüpü kullanarak filtreleme kullanarak hücre lizatını netleştirin. Çözeltiye kobalt kolon yükleme tamponu (Tablo 1) ekleyerek tüpün hacmini en az 30 mL toplam hacme doldurun. Hücre enkazını santrifüjleme ile 20.000 x g'de 30 dakika boyunca pelet haline getirin.
  7. Süpernatantı 0,45 μm şırınga filtresi kullanarak filtreleyin.
  8. Lizatı kobalt kolon yükleme tamponunda (Tablo 1) 1:10 nihai seyreltme oranı kullanarak seyreltin.
  9. Üreticinin talimatlarını izleyerek bir kobalt veya nikel-reçine sütunu kullanarak arıtılmış hücre lizat süpernatantı üzerinde afinite kromatografisi yapın. Örnek için temsili sonuçlar bölümüne bakın. Tablo 1'de listelenen arabellekleri kullanın. Analiz için akış, yıkama ve elüsyon örneklerini toplayın.
  10. Elüsyon tampon çözeltisindeki RNA polimerazını, üreticinin talimatlarını izleyerek bir tampon değişim sütunu kullanarak derhal RNA polimeraz depolama tampon çözeltisine (Tablo 1) değiştirin.
  11. RNA polimerazını 10 kDa-cutoff santrifüj filtre üniteleri kullanarak spektrofotometri ile belirlenen 0.2-0.4 mg / mL'lik bir konsantrasyona yoğunlaştırarak dondurucu stoklarını hazırlayın (Yok olma katsayısı ayarı olmadan280nm [1 cm'de 1 abs = 1 mg · mL−1]).
  12. Aliquot RNA polimeraz dondurucu, PCR tüplerinde 20-50 μL hacimlerde stoklanır ve RNA polimerazı -80 ° C'de depolar.
  13. Afinite kromatografisinin kalitesini SDS-PAGE ile belirleyin ve toplam protein verimini spektrofotometri veya BCA testi ile ölçün. SDS-PAGE ile iyi çözünürlük için numuneleri 120 V'ta 50 dakika boyunca% 7.5'lik bir poliakrilamid jel üzerinde çalıştırın.

2. Rekombinant RpoD'nin saflaştırılması ve RpoD stoğunun hazırlanması

  1. BL21::MBP-RpoDBb'de Maltoz Bağlayıcı Protein etiketli rekombinant B. burgdorferi RpoD'nin (MBP-RpoD) ekspresyonunu kültüre alın ve indükleyin, Malzeme Tablosunda listelenen protein füzyon ve saflaştırma sistemi kullanım kılavuzunda açıklandığı gibi ve hücreleri santrifüjleme yoluyla toplayın.
    NOT: Durma noktası. Hücreleri 2 haftaya kadar saklamak için hücre peletlerini -80 ° C'de dondurun veya hemen hücre lizine devam edin.
  2. Ticari bir bakteri hücresi lizis kiti veya Fransız basınç hücresi kullanarak lizis gerçekleştirin. Tablo 1'deki örnek lizis arabelleğine bakın.
  3. Santrifüjleme ve filtreleme kullanarak hücre lizatını netleştirin. Hücre enkazını santrifüjleme ile 20.000 x g'de 30 dakika boyunca pelet haline getirin. Süpernatantı 0,45 μm filtre kullanarak filtreleyin.
  4. Ekspresyon sistemi için bir protein ekstraksiyon protokolü kullanarak MBP-RpoD'yi ayıklayın. Uygulama ayrıntıları ve sonuçları gibi temsili sonuçlar bölümüne bakın.
  5. SDS-PAGE ile afinite kromatografisi işleminin ve elüsyonunun kalitesini belirleyin ve spektrofotometri ile protein verimini ölçün (Yok olma katsayısı ayarı olmadan280nm [1 cm'de 1 abs = 1 mg · mL−1]). SDS-PAGE'de ayırma için 30 dakika boyunca 200 V'ta %10 poliakrilamid jel kullanın.
  6. MBP-RpoD'yi 10 kDa-kesme santrifüj filtre kullanarak spektrofotometri ile belirlenen >2 mg/mL konsantrasyonuna konsantre edin.
  7. MBP'yi Faktör Xa bölünme bölgesinde RpoD'den ayırın. 2 mM'lik bir konsantrasyonda MBP-RpoD içeren afinite kromatografisi elüsyon fraksiyonlarına CaCl2 ekleyin. Her 30 mg saflaştırılmış protein için 200 μg Faktör Xa Proteaz ekleyin. RT'de bir gecede kuluçkaya yatın.
  8. MBP'nin RpoD'den SDS-PAGE ile tamamen ayrıldığını onaylayın. SDS-PAGE'de ayırma için 30 dakika boyunca 200 V'ta %10 poliakrilamid jel kullanın.
  9. MBP ve RpoD içeren çözeltiyi, heparin bağlayıcı bir tamponla 1:10 oranında seyreltin.
  10. Heparin sütunundaki MBP ve RpoD'yi FPLC ile ayırın. FPLC ayarları için Tablo 2'ye bakın.
  11. SDS-PAGE ile afinite kromatografi ürünlerinin kalitesini belirleyin ve spektrofotometri ile protein verimini ölçün. SDS-PAGE'de ayırma için 30 dakika boyunca 200 V'ta %10 poliakrilamid jel kullanın.
  12. RpoD içeren elüsyon fraksiyonlarını 10 kDa-kesme santrifüj filtre kullanarak 2-3 mL'lik son hacme kadar yoğunlaştırın.
  13. Tampon, konsantre RpoD elüsyon fraksiyonlarını bir jel filtrasyon sütunu kullanarak depolama tamponuna değiştirin.
  14. RpoD stoğunu, spektrofotometri ile belirlenen 0,2-0,8 mg/mL konsantrasyona kadar 10 kDa-kesme santrifüj filtre kullanarak konsantre edin.
  15. Aliquot RpoD, PCR tüplerinde 20-50 μL hacimlerde stoklanır ve -80 ° C'de saklanır.

3. DNA şablon stoğunun hazırlanması

  1. PCR, 200 μL'lik bir reaksiyon kullanarak B. burgdorferi genomik DNA'sından RpoD tahrikli bir promotör bölgesini çevreleyen 500 bp bölgesini güçlendirir (Tablo 3).
  2. PCR ürünlerini ticari bir PCR saflaştırma kiti kullanarak saflaştırın. Moleküler biyolojide DNA'yı H2O sınıfında elute edin.
  3. PCR tarafından üretilen DNA şablonlarının molar konsantrasyonunu, moleküler biyoloji sınıfH2O'da seyreltme ile 100 nM'ye ayarlayın.

4. Radyoaktif işaretli nükleotidlerin dahil edilmesiyle in vitro transkripsiyon gerçekleştirin

  1. Bir in vitro transkripsiyon deney planı hazırlayın. RNA polimeraz, RpoD ve DNA şablon konsantrasyonlarını belirleyin. Reaksiyon tüpleri için alikot hacimlerini ve pipetleme sıralarını belirleyin. Örnek için Tablo 4 ve Şekil 1'e bakınız.
    NOT: RNA polimeraz, alternatif polimeraz, şablon içermeyen reaksiyonlar veya alternatif şablonlar gibi kontrolleri deneysel plana dahil edin.
  2. Deney için gereken α-32P-ATP hacmini hesaplayın. Bunu deneysel plana dahil edin. Tipik olarak, fosfor ekran tespiti için in vitro transkripsiyon reaksiyonu başına 2 μCi aktivite ekleyin.
  3. Radyasyon kontaminasyon riskini azaltmak için radyasyon tezgahı da dahil olmak üzere çalışma yüzeylerini hazırlayın.
  4. RNA polimeraz, Rpo, 5x tampon NTP ve şablon stok çözeltilerinin taze alikotlarını buz üzerinde çözün. Pipetlemeden önce çözülmüş tüm dondurulmuş stokları iyice karıştırın.
  5. Deneysel plana göre radyoaktif işaretli nükleotidler için bir ana reaksiyon karışımı ve ayrı bir NTP karışımı hazırlayın.
  6. Kontrol reaksiyonlarını ve deney setlerini, reaksiyona radyoetiket eklemenin hazırlanmasında PCR tüplerine dağıtın. H2 O, reaksiyon anakarışımı, RNA polimeraz ve RpoD'yi belirlenmiş PCR tüplerine nazikçe dağıtın ve pipetleme ile karıştırın.
  7. Hazırlanan malzemeleri bir radyasyon tezgahına aktarın.
  8. NTP'ye α-32P-ATP ekleyin ve nazik pipetleme ile karıştırın.
    DİKKAT: Radyoaktif malzemelerle çalışırken, radyoaktif izotoplar için uygun koruyucu ekipman ve taşıma prosedürleri kullanın.
  9. Adım 4.6'dan itibaren in vitro transkripsiyon reaksiyon karışımlarını içeren tüplere NTP ekleyin.
  10. Bir DNA şablonunun eklenmesiyle in vitro transkripsiyon reaksiyonunu başlatın. Reaksiyon hacmini nazikçe pipetleyerek karıştırın.
  11. Tüpleri 37 ° C'de bir termosikler veya ısı bloğunda 5 dakika boyunca inkübe edin.
  12. Reaksiyonları termosiklerden veya ısı bloğundan çıkarın ve in vitro transkripsiyon reaksiyonlarını durdurmak için% 50 formamid içeren 2x RNA yükleme boyasını eşit bir reaksiyon hacmine ekleyin.
  13. Bir termosiklet veya ısı bloğunda 5 dakika boyunca 65 ° C'de reaksiyonları inkübe ederek enzimleri denatüre edin.
  14. 30-45 dakika boyunca 180 V'ta% 10-15 TBE üre poliakrilamid jelleri kullanarak% 10 -% 15 TBE üre poliakrilamid jelleri kullanarak jel elektroforezi ile in vitro transkripsiyon reaksiyonu karışımında RNA'yı ayırın.
    NOT: Jel elektroforezi koşullarına bağlı olarak, tampon çözeltisi radyoaktif işaretli nükleotitlerle kontamine olabilir veya jel, radyoaktif işaretli nükleotitlerin çoğunu veya tamamını içerebilir. Uygun radyoaktivite depolaması veya bertarafı için plan yapın.
  15. Radyoaktif işaretli ATP içeren jelin herhangi bir bölümünü çıkardıktan sonra fosfoekran kullanarak radyoaktif etiketli RNA'yı görüntüleyin. Jeli gece boyunca (16 saat) fosfoekrana maruz bırakın ve bir fosfoekran görüntüleyici (100 μm çözünürlük, 700 V PMT tüp voltajı) kullanarak görüntüyü görüntüleyin.
  16. Dansitometri yöntemlerini kullanarak verileri analiz etme24.

Sonuçlar

Reaksiyonun sınırlayıcı adımının sigma faktörü aracılı transkripsiyon başlangıcı olduğu bir in vitro transkripsiyon reaksiyonunda, transkripsiyon aktivitesi sigma faktörü miktarı ile doğrusal olarak artmalıdır. Radyoaktif işaretli nükleotidin RNA ürünlerine dahil edilmesinden kaynaklanan değişen sinyali gözlemlemek için iki RNA polimeraz konsantrasyonu ile birlikte bir dizi RpoD konsantrasyonunu test eden in vitro transkripsiyon deneylerinin hazırlanmasını sunuyoruz. RNA ...

Tartışmalar

Sunulan protokol kullanılarak oluşturulan in vitro transkripsiyon testleri yakın zamanda B. burgdorferi'de bir transkripsiyon faktörünün rolünü incelemek için kullanılmıştır ve diğer transkripsiyon faktörlerini, sigma faktörlerini ve molekülleri kullanarak benzer deneyler yapmak için uygulanabilir23. B. burgdorferi'den aktif RNA polimeraz elde edildikten ve aktivitesi tespit edildikten sonra, in vitro transkripsiyon tahlillerindeki bileşenler ...

Açıklamalar

Yazarlar çıkar çatışması olmadığını beyan ederler.

Teşekkürler

Bu çalışma Creighton Üniversitesi Sağlık Bilimleri Stratejik Yatırım Fonu Fakülte Geliştirme Hibesi ile desteklenmiştir. B. burgdorferi RpoC-His10X suşu Montana Üniversitesi'nden Dr. D. Scott Samuels tarafından nazikçe sağlanmıştır. Maltoz bağlayıcı protein etiketli rpoD alelini kodlayan pMAL-C5X plazmidini barındıran E. coli suşu, Rocky Mountain Laboratories, NIAID, NIH'den Dr. Frank Gherardini tarafından nazikçe sağlanmıştır.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
0.45 micron syringe filterThermo Scientific726-2545Step 1.7 and 2.3
50 mL conical tubesMidSciC50BStep 1.3, and subsequent steps
50 mL high-speed centrifuge tubesThermo Scientific3119-0050PKStep 1.2
500 mL Centrifuge bottlesThermo Scientific3120-9500PKStep 1.1
B-PER and instruction manualThermo Scientific78248Step 1.4 and 2.2
Calcium chlorideFisher Scientific10035-04-8Step 2.6
Centrifugal filters 10 Kd cutoffMillipore SigmaUFC8010Step 1.11 and 2.11
Cobalt resin and instruction manualThermo Scientific89969Step 1.9
DithiothreitolAcros Organics426380500Step 1.4 and subsequent steps
Dnase (Nuclease)Millipore Sigma70746Step 1.4 and 2.2
Factor Xa Protease Haematologic TechnologiesHCXA-0060Step 2.6
GE Typhoon 5 PhosphoimagerGE lifesciencesMultipleStep 4.15
Gel ImagerBio-RadMutipleStep 1.13 and subsequent protien quality check steps
H2O for in vitro transcriptionFisher Scientific7732-18-5Step 3.2 and 3.3
high fidelity PCR kitNew England BiolabsM0530SStep 3.1
High-speed centrifugeEppendorfStep 1.1, and subsequent steps
HiTrap Heparin HP 5 x 1 mLCytiva Life Sciences17040601Step 2.8
ImidazoleSigma-Aldrich56750-100GStep 1.9
LysozymeThermo Scientific90082Step 1.4 and 2.2
Magnesium chloride Fisher ScientificS25401Step 4.1
Manganese chlorideFisher ScientificS25418Step 4.1
Mini protean tetra cellBio-RadMutipleStep 1.13 and subsequent protien quality check steps
NP-40Thermo Scientific85124Step 4.1
NTP mixtureThermo ScientificR0481Step 4.1
PCR purification kitQiagen28506Step 3.2
PCR tubesMidSciPR-PCR28ACFStep 1.12
PD-10 Sephadex buffer exchange column and instruction manualCytiva17085101Step 1.10 and 2.10 (gel filtration column)
pMAL Protein Fusion
and Purification System Instruction manual		New England BiolabsE8200SStep 2.1
Polyacrylamide gels AnyKDBio-Rad456-8125Step 1.13 and subsequent protien quality check steps
Potassium glutamateSigma-AldrichG1251Step 4.1
Protease inhibitorThermo Scientific78425Step 1.4 and 2.2
Radiolabeled ATPPerkin ElmerBLU503HStep 4.2
RNA Loading Dye, (2x)New England BiolabsB0363SStep 4.13
Rnase inhibitorThermo ScientificEO0381Step 4.1
SpectrophotometerBiotekMutipleStep 1.13 and subsequent protien quality check steps
TBE-Urea gels 10 percentBio-Rad4566033Step 4.14

Referanslar

  1. Brisson, D., Drecktrah, D., Eggers, C. H., Samuels, D. S. Genetics of Borrelia burgdorferi. Annual Review of Genetics. 46, 515-536 (2012).
  2. Kingry, L. C., et al. Surveillance for and discovery of Borrelia Species in US patients suspected of tickborne illness. Clinical Infectious Diseases. 66 (12), 1864-1871 (2018).
  3. Cutler, S. J. Relapsing fever Borreliae: A global review. Clinics in Laboratory Medicine. 35 (4), 847-865 (2015).
  4. Barbour, A. G., Hayes, S. F. Biology of Borrelia species. Microbiological Reviews. 50 (4), 381-400 (1986).
  5. Tilly, K., Rosa, P. A., Stewart, P. E. Biology of infection with Borrelia burgdorferi. Infectious Disease Clinics of North America. 22 (2), 217-234 (2008).
  6. Radolf, J. D., Caimano, M. J., Stevenson, B., Hu, L. T. Of ticks, mice and men: understanding the dual-host lifestyle of Lyme disease spirochaetes. Nature Reviews Microbiology. 10 (2), 87-99 (2012).
  7. Caimano, M. J., Drecktrah, D., Kung, F., Samuels, D. S. Interaction of the Lyme disease spirochete with its tick vector. Cellular Microbiology. 18 (7), 919-927 (2016).
  8. Dulebohn, D. P., Richards, C. L., Su, H., Lawrence, K. A., Gherardini, F. C. Weak organic acids decrease Borrelia burgdorferi cytoplasmic pH, eliciting an acid stress response and impacting RpoN- and RpoS-dependent gene expression. Frontiers in Microbiology. 8, 1734 (2017).
  9. Bontemps-Gallo, S., Lawrence, K., Gherardini, F. C. Two different virulence-related regulatory pathways in Borrelia burgdorferi are directly affected by osmotic fluxes in the blood meal of feeding ixodes ticks. PLoS Pathogens. 12 (8), 1005791 (2016).
  10. Bugrysheva, J. V., et al. Characterization of the RelBbu Regulon in Borrelia burgdorferi reveals modulation of glycerol metabolism by (p)ppGpp. PLoS One. 10 (2), 0118063 (2015).
  11. Carroll, J. A., Garon, C. F., Schwan, T. G. Effects of environmental pH on membrane proteins in Borrelia burgdorferi. Infection and Immunity. 67 (7), 3181-3187 (1999).
  12. Drecktrah, D., et al. The Borrelia burgdorferi RelA/SpoT homolog and stringent response regulate survival in the tick vector and global gene expression during starvation. PLoS Pathogens. 11 (9), 1005160 (2015).
  13. Hyde, J. A., Trzeciakowski, J. P., Skare, J. T. Borrelia burgdorferi alters its gene expression and antigenic profile in response to CO2 levels. Journal of Bacteriology. 189 (2), 437-445 (2007).
  14. Lin, Y. H., Chen, Y., Smith, T. C., Karna, S. L. R., Seshu, J. Short-chain fatty acids alter metabolic and virulence attributes of Borrelia burgdorferi. Infection and Immunity. 86 (9), 00217-00218 (2018).
  15. Seshu, J., Boylan, J. A., Gherardini, F. C., Skare, J. T. Dissolved oxygen levels alter gene expression and antigen profiles in Borrelia burgdorferi. Infection and Immunity. 72 (3), 1580-1586 (2004).
  16. Stevenson, B., Schwan, T. G., Rosa, P. A. Temperature-related differential expression of antigens in the Lyme disease spirochete, Borrelia burgdorferi. Infection and Immunity. 63 (11), 4535-4539 (1995).
  17. Troxell, B., et al. Manganese and zinc regulate virulence determinants in Borrelia burgdorferi. Infection and Immunity. 81 (8), 2743-2752 (2013).
  18. Yang, X., et al. Interdependence of environmental factors influencing reciprocal patterns of gene expression in virulent Borrelia burgdorferi. Molecular Microbiology. 37 (6), 1470-1479 (2000).
  19. Samuels, D. S., et al. Gene regulation and transcriptomics. Current Issues in Molecular Biology. 42, 223-266 (2021).
  20. Fraser, C. M., et al. Genomic sequence of a Lyme disease spirochaete, Borrelia burgdorferi. Nature. 390 (6660), 580-586 (1997).
  21. Iyer, R., Schwartz, I. Microarray-based comparative genomic and transcriptome analysis of Borrelia burgdorferi. Microarrays. 5 (2), 9 (2016).
  22. Iyer, R., et al. Stage-specific global alterations in the transcriptomes of Lyme disease spirochetes during tick feeding and following mammalian host adaptation. Molecular Microbiology. 95 (3), 509-538 (2015).
  23. Boyle, W. K., et al. DksA-dependent regulation of RpoS contributes to Borrelia burgdorferi tick-borne transmission and mammalian infectivity. PLoS Pathogen. 17 (2), 1009072 (2021).
  24. Boyle, W. K., et al. Establishment of an in vitro RNA polymerase transcription system: a new tool to study transcriptional activation in Borrelia burgdorferi. Scientific Reports. 10 (1), 8246 (2020).
  25. Silar, R., et al. Use of in vitro transcription system for analysis of Corynebacterium glutamicum promoters recognized by two sigma factors. Current Microbiology. 73 (3), 401-408 (2016).
  26. Maciag, A., et al. In vitro transcription profiling of the sigmaS subunit of bacterial RNA polymerase: re-definition of the sigmaS regulon and identification of sigmaS-specific promoter sequence elements. Nucleic Acids Research. 39 (13), 5338-5355 (2011).
  27. Chang, A., et al. BRENDA, the ELIXIR core data resource in 2021: New developments and updates. Nucleic Acids Research. 49, 498-508 (2021).
  28. Samuels, D. S., Drecktrah, D., Hall, L. S. Genetic transformation and complementation. Methods in Molecular Biology. 1690, 183-200 (2018).
  29. Hyde, J. A., Weening, E. H., Skare, J. T. Genetic transformation of Borrelia burgdorferi. Current Protocols in Microbiology. 20, 1-17 (2011).
  30. Ge, Y., Old, I. G., Saint Girons, I., Charon, N. W. Molecular characterization of a large Borrelia burgdorferi motility operon which is initiated by a consensus sigma70 promoter. Journal of Bacteriology. 179 (7), 2289-2299 (1997).
  31. Ozaki, M., Wada, A., Fujita, N., Ishihama, A. Growth phase-dependent modification of RNA polymerase in Escherichia coli. Molecular Genetics and Genomics. 230 (1-2), 17-23 (1991).
  32. Jasinski, D. L., Schwartz, C. T., Haque, F., Guo, P. Large scale purification of RNA nanoparticles by preparative ultracentrifugation. Methods in Molecular Biology. 1297, 67-82 (2015).
  33. Gierl, A., Zillig, W., Stetter, K. O. The role of the components sigma and y of the DNA-dependent RNA polymerase of Lactobacillus curvatus in promotor selection. European Journal of Biochemistry. 125 (1), 41-47 (1982).
  34. Stetter, K. O., Zillig, W. Transcription in lactobacillaceae. DNA-dependent RNA polymerase from Lactobacillus curvatus. European Journal of Biochemistry. 48 (2), 527-540 (1974).
  35. Borbley, G., Schneider, G. Cyanobacteria. Methods in Enzymology. 167, 3 (1988).
  36. Svetlov, V., Artsimovitch, I. Purification of bacterial RNA polymerase: Tools and protocols. Methods in Molecular Biology. 1276, 13-29 (2015).
  37. Shimada, T., Yamazaki, Y., Tanaka, K., Ishihama, A. The whole set of constitutive promoters recognized by RNA polymerase RpoD holoenzyme of Escherichia coli. PLoS One. 9 (3), 90447 (2014).
  38. Daubendiek, S. L., Ryan, K., Kool, E. T. Rolling-circle RNA synthesis: Circular oligonucleotides as efficient substrates for T7 RNA polymerase. Journal of the American Chemical Society. 117 (29), 7818-7819 (1995).
  39. Marras, S. A., Gold, B., Kramer, F. R., Smith, I., Tyagi, S. Real-time measurement of in vitro transcription. Nucleic Acids Research. 32 (9), 72 (2004).
  40. Chamberlin, M. J., Nierman, W. C., Wiggs, J., Neff, N. A quantitative assay for bacterial RNA polymerases. Journal of Biological Chemistry. 254 (20), 10061-10069 (1979).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

JoVE de Bu AySay 185BorreliaBorreliellain vitro transkripsiyonRNA polimerazRpoDRpoC

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır