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Resumen

Los ensayos de transcripción in vitro pueden descifrar los mecanismos de regulación transcripcional en Borreliella burgdorferi. Este protocolo describe los pasos para purificar la ARN polimerasa de B. burgdorferi y realizar reacciones de transcripción in vitro. Los enfoques experimentales que utilizan ensayos de transcripción in vitro requieren una purificación y almacenamiento confiables de ARN polimerasa activa.

Resumen

Borreliella burgdorferi es un patógeno bacteriano con repertorios metabólicos y genómicos limitados. B. burgdorferi transita extracelularmente entre vertebrados y garrapatas y remodela dramáticamente su perfil transcripcional para sobrevivir en ambientes dispares durante la infección. Un enfoque de los estudios de B. burgdorferi es comprender claramente cómo la bacteria responde a su entorno a través de cambios transcripcionales. Los ensayos de transcripción in vitro permiten diseccionar bioquímicamente los mecanismos básicos de regulación transcripcional. Aquí, presentamos un protocolo detallado que describe la purificación y almacenamiento de la polimerasa de ARN de B. burgdorferi , la purificación del factor sigma, la generación de plantillas de ADN y los ensayos de transcripción in vitro . El protocolo describe el uso de ARN polimerasa purificada de B. burgdorferi 5A4 RpoC-His (5A4-RpoC). 5A4-RpoC es una cepa previamente publicada que alberga una etiqueta 10XHis en el gen rpoC que codifica la subunidad más grande de la ARN polimerasa. Los ensayos de transcripción in vitro consisten en la ARN polimerasa purificada de la cepa 5A4-RpoC, una versión recombinante del factor sigma de mantenimiento RpoD y una plantilla de ADN bicatenario generada por PCR. Si bien las técnicas de purificación de proteínas y los enfoques para ensamblar ensayos de transcripción in vitro son conceptualmente bien entendidos y relativamente comunes, las consideraciones de manejo para las ARN polimerasas a menudo difieren de un organismo a otro. El protocolo presentado aquí está diseñado para estudios enzimáticos sobre la ARN polimerasa de B. burgdorferi. El método se puede adaptar para probar el papel de los factores de transcripción, promotores y modificaciones postraduccionales en la actividad de la ARN polimerasa.

Introducción

La enfermedad de Lyme y la fiebre recurrente son causadas por patógenos espiroquetas en los géneros Borrelia y Borreliella 1,2,3. La enfermedad de Lyme es una enfermedad transmitida por vectores prominente en América del Norte y, en consecuencia, Borreliella burgdorferi es un organismo modelo prominente para estudiar la biología de las espiroquetas 4,5. Las investigaciones sobre los mecanismos de regulación transcripcional de B. burgdorferi tienen como objetivo comprender mejor sus adaptaciones a los cambios en el medio ambiente a medida que circula entre su vector garrapata y los huéspedes mamíferos 6,7. Los cambios en el pH, la temperatura, la osmolaridad, la disponibilidad de nutrientes, los ácidos grasos de cadena corta, los ácidos orgánicos y los niveles de oxígeno disuelto y dióxido de carbono modulan la expresión de genes que son importantes para que B. burgdorferi sobreviva en su artrópodo vector e infecte a los animales 8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18. Vincular estas respuestas a estímulos con mecanismos reguladores ha sido un aspecto importante de la investigación de B. burgdorferi 19.

Los factores de transcripción y los factores sigma controlan la transcripción de genes que llevan a cabo procesos celulares. Las espiroquetas de Lyme y fiebre recidivante albergan un conjunto relativamente escaso de factores de transcripción y factores sigma alternativos. A pesar de esto, existen cambios transcripcionales complejos que dirigen las respuestas de B. burgdorferi al medio ambiente20,21,22. Los mecanismos específicos que impulsan los cambios transcripcionales en B. burgdorferi en respuesta a los cambios ambientales siguen sin estar claros. Los ensayos de transcripción in vitro son herramientas poderosas para emplear un enfoque bioquímico para evaluar la función y los mecanismos reguladores de los factores de transcripción y los factores sigma23,24,25,26.

Recientemente se estableció un sistema de ensayo de transcripción in vitro utilizando la ARN polimerasa de B. burgdorferi 24. Como las bacterias a menudo tienen fisiologías celulares únicas, las ARN polimerasas de diferentes especies y géneros responden de manera diferente a la purificación enzimática, el almacenamiento de enzimas y las condiciones de amortiguación de reacción27. B. burgdorferi también está genéticamente distante de las muchas especies bacterianas en las que se han estudiado las ARN polimerasas20. Los aspectos de la preparación enzimática como la lisis, el lavado y las condiciones del tampón de elución, el tampón de almacenamiento, el tampón de reacción de transcripción in vitro y el método de construcción del ensayo pueden alterar la actividad de la ARN polimerasa. En este documento, proporcionamos un protocolo para la purificación de la ARN polimerasa y el factor sigma RpoD, la producción de plantillas lineales de ADN bicatenario y la construcción de ensayos de transcripción in vitro para facilitar la reproducibilidad entre laboratorios que utilizan este sistema. Detallamos un ejemplo de reacción para demostrar el rango lineal para la transcripción dependiente de RpoD y discutimos las limitaciones y alternativas a este enfoque.

Protocolo

1. Purificación de la ARN polimerasa y preparación del stock de ARN polimerasa

  1. Recoger el pellet celular de 2-4 L de B. burgdorferi RpoC-His10X cultivado en medio BSKII en un ambiente microaerofílico (34 °C, 5% CO 2, 3%O2) a una densidad de2-4 x 107 células/mL utilizando los protocolos de recolección celular descritos previamente28,29. Realizar la centrifugación a 10.000 g a 4 °C durante 30 min en botellas centrífugas de 500 ml y verter el sobrenadante.
  2. Resuspender las células en 30 mL de tampón HN helado (10 mM HEPES, 10 mM NaCl, pH 8.0). Repita el paso de centrifugación descrito anteriormente utilizando un tubo de centrífuga de 50 ml y decanta el sobrenadante.
    NOTA: Punto de parada. Congele la cápsula celular a -80 °C para almacenar las células durante un máximo de 2 semanas o proceda inmediatamente a la lisis celular.
  3. Mantener las células, el lisado y las proteínas purificadas a 4 °C o en hielo a menos que se congelen. Mantenga la ARN polimerasa en un ambiente reductor agregando TDT recién preparada a una concentración de 2 mM a cada tampón utilizado en este protocolo y mantenga el pH 8.0.
  4. Prepare el lisado a partir del pellet de células de B. burgdorferi utilizando un kit de lisis bacteriana comercial siguiendo las instrucciones del kit. Resuspender el pellet en 10-15 ml de solución B-PER a temperatura ambiente (RT) sin inhibidor de la proteasa y dejar que la lisis proceda durante 5 minutos en hielo. El volumen de lisis depende del tamaño del pellet de la celda, como se describe en las instrucciones del kit.
  5. Agregue un cóctel de inhibidores de proteasa a la solución de lisis, seguido de tres rondas de sonicación, como se describe en la sección de resultados representativos.
    NOTA: Alternativamente, lisar las celdas en una celda de presión francesa como se describió anteriormente24. Omita el paso 1.4. y paso 1.5.
  6. Aclarar el lisado celular mediante centrifugación y filtración utilizando un tubo de centrífuga de 50 ml. Llene el volumen del tubo hasta al menos 30 ml de volumen total agregando tampón de carga de columna de cobalto (Tabla 1) a la solución. Granular los restos celulares por centrifugación a 20.000 x g durante 30 min.
  7. Filtrar el sobrenadante con un filtro de jeringa de 0,45 μm.
  8. Diluir el lisado en tampón de carga de columna de cobalto (Tabla 1) utilizando una relación de dilución final de 1:10.
  9. Realizar cromatografía de afinidad en el sobrenadante de lisado celular clarificado utilizando una columna de cobalto o resina de níquel siguiendo las instrucciones del fabricante. Consulte la sección de resultados representativos para ver un ejemplo. Utilice los búferes enumerados en la Tabla 1. Recoja las muestras de flujo continuo, lavado y elución para su análisis.
  10. Cambie inmediatamente la ARN polimerasa en la solución tampón de elución por una solución tampón de almacenamiento de ARN polimerasa (Tabla 1) utilizando una columna de intercambio tampón siguiendo las instrucciones del fabricante.
  11. Preparar las existencias de congeladores concentrando la ARN polimerasa utilizando unidades de filtro centrífugas de corte de 10 kDa a una concentración de 0,2-0,4 mg/ml determinada por espectrofotometría (un ajuste de coeficiente de extinción de280 nm sin extinción [1 abs a 1 cm = 1 mg·mL−1]).
  12. El congelador de ARN polimerasa alícuota almacena volúmenes de 20-50 μL en tubos de PCR y almacena la ARN polimerasa a −80 °C.
  13. Determinar la calidad de la cromatografía de afinidad mediante SDS-PAGE y medir el rendimiento total de proteínas mediante espectrofotometría o ensayo BCA. Ejecute las muestras en un gel de poliacrilamida al 7,5% a 120 V durante 50 minutos para una buena resolución con SDS-PAGE.

2. Purificación de RpoD recombinante y preparación de existencias de RpoD

  1. Cultivar e inducir la expresión de B. burgdorferi RpoD recombinante marcada con la proteína de unión a maltosa (MBP-RpoD) en BL21::MBP-RpoDBb, como se describe en el manual de instrucciones del sistema de fusión y purificación de proteínas que figura en la Tabla de materiales, y recoger las células por centrifugación.
    NOTA: Punto de parada. Congele los gránulos celulares a -80 °C para almacenar las células durante un máximo de 2 semanas o proceda inmediatamente a la lisis celular.
  2. Realice la lisis utilizando un kit de lisis celular bacteriana comercial o una célula de presión francesa. Vea el ejemplo de búfer de lisis en la Tabla 1.
  3. Clarificar el lisado celular mediante centrifugación y filtración. Granular los restos celulares por centrifugación a 20.000 x g durante 30 min. Filtrar el sobrenadante con un filtro de 0,45 μm.
  4. Extraer MBP-RpoD utilizando un protocolo de extracción de proteínas para el sistema de expresión. Consulte la sección de resultados representativos para ver los detalles y resultados de la implementación.
  5. Determinar la calidad del proceso de cromatografía de afinidad y elución por SDS-PAGE y medir el rendimiento proteico por espectrofotometría (A280nm sin ajuste de coeficiente de extinción [1 abs a 1 cm = 1 mg·mL−1]). Use gel de poliacrilamida al 10% a 200 V durante 30 minutos para la separación en SDS-PAGE.
  6. Concentrar MBP-RpoD utilizando un filtro centrífugo de corte de 10 kDa hasta una concentración de >2 mg/ml determinada por espectrofotometría.
  7. Escinde MBP de RpoD en el sitio de escisión de Factor Xa. Añadir CaCl 2 a las fracciones de elución por cromatografía de afinidad que contienen MBP-RpoD a una concentración de2 mM. Añadir 200 μg de Factor Xa proteasa por cada 30 mg de proteína purificada. Incubar durante la noche en RT.
  8. Confirme la división completa de MBP de RpoD por SDS-PAGE. Use gel de poliacrilamida al 10% a 200 V durante 30 minutos para la separación en SDS-PAGE.
  9. Diluir la solución que contiene MBP y RpoD en una proporción de 1:10 con un tampón de unión a heparina.
  10. Separar MBP y RpoD en la columna de heparina por FPLC. Consulte la Tabla 2 para conocer la configuración de FPLC.
  11. Determinar la calidad de los productos de cromatografía de afinidad mediante SDS-PAGE y medir el rendimiento proteico mediante espectrofotometría. Use gel de poliacrilamida al 10% a 200 V durante 30 minutos para la separación en SDS-PAGE.
  12. Concentrar las fracciones de elución que contienen RpoD utilizando un filtro centrífugo de corte de 10 kDa hasta un volumen final de 2-3 ml.
  13. Intercambie las fracciones de elución RpoD concentradas al tampón de almacenamiento utilizando una columna de filtración de gel.
  14. Concentrar el material RpoD utilizando un filtro centrífugo de corte de 10 kDa hasta una concentración de 0,2-0,8 mg/ml determinada por espectrofotometría.
  15. Stock de RpoD alícuota a volúmenes de 20-50 μL en tubos de PCR y almacenar a −80 °C.

3. Preparación del stock de plantillas de ADN

  1. La PCR amplifica la región de 500 pb que rodea un sitio promotor impulsado por RpoD a partir del ADN genómico de B. burgdorferi utilizando una reacción de 200 μL (Tabla 3).
  2. Purificar los productos de PCR utilizando un kit de purificación de PCR comercial. Eluya el ADN en biología molecular gradoH2O.
  3. Ajustar la concentración molar de los moldes de ADN generados por PCR a 100 nM por dilución en biología molecular gradoH2O.

4. Realizar transcripción in vitro con la incorporación de nucleótidos radiomarcados

  1. Preparar un plan experimental de transcripción in vitro . Determine las concentraciones de ARN polimerasa, RpoD y plantilla de ADN. Determinar los volúmenes alícuotas y las órdenes de pipeteo de los tubos de reacción. Consulte la Tabla 4 y la Figura 1 para ver un ejemplo.
    NOTA: Incluya controles en el plan experimental, como reacciones que no contengan ARN polimerasa, polimerasa alternativa, ninguna plantilla o plantillas alternativas.
  2. Calcule el volumen de α-32P-ATP requerido para el experimento. Incorpore esto en el plan experimental. Por lo general, incluyen 2 μCi de actividad por reacción de transcripción in vitro para la detección de la pantalla de fósforo.
  3. Prepare las superficies de trabajo, incluido el banco de radiación, para reducir el riesgo de contaminación por radiación.
  4. Descongele las alícuotas frescas de ARN polimerasa, Rpo, NTP tampón 5x y soluciones madre plantilla en hielo. Mezcle bien todas las existencias congeladas descongeladas antes del pipeteo.
  5. Preparar una mezcla de reacción maestra y una mezcla de NTP separada para nucleótidos radiomarcados de acuerdo con el plan experimental.
  6. Dispensar las reacciones de control y los conjuntos experimentales en tubos de PCR en preparación para agregar radiomarcado en la reacción. Dispensar suavementeH2O, mezcla maestra de reacción, ARN polimerasa y RpoD en tubos de PCR designados y mezclar por pipeteo.
  7. Transfiera los materiales preparados a un banco de radiación.
  8. Agregue α-32P-ATP a NTP y mezcle con un pipeteo suave.
    PRECAUCIÓN: Mientras trabaje con material radiactivo, utilice el equipo de protección y los procedimientos de manipulación adecuados para los isótopos radiactivos.
  9. Añadir NTP a los tubos que contienen las mezclas de reacción de transcripción in vitro del paso 4.6.
  10. Comience la reacción de transcripción in vitro con la adición de una plantilla de ADN. Mezclar el volumen de reacción pipeteando suavemente.
  11. Incubar tubos a 37 °C durante 5 min en un termociclador o bloque térmico.
  12. Retire las reacciones del termociclador o bloque de calor y agregue el tinte de carga de ARN 2x que contiene 50% de formamida a un volumen de reacción igual para detener las reacciones de transcripción in vitro .
  13. Desnaturalice las enzimas incubando reacciones a 65 °C durante 5 minutos en un termociclador o bloque de calor.
  14. Separar el ARN en la mezcla de reacción de transcripción in vitro mediante electroforesis en gel utilizando geles de poliacrilamida de urea TBE al 10%-15% a 180 V durante 30-45 min.
    NOTA: Dependiendo de las condiciones de electroforesis en gel, la solución tampón puede estar contaminada con nucleótidos radiomarcados o el gel puede contener la mayoría o todos los nucleótidos radiomarcados. Planifique el almacenamiento o la eliminación adecuados de la radiactividad.
  15. Imagen del ARN radiomarcado usando fosfopantalla después de eliminar cualquier porción del gel que contenga ATP radiomarcado no incorporado. Exponga el gel al fosfopantalla durante la noche (16 h) y la imagen utilizando un generador de imágenes de fosfopantalla (resolución de 100 μm, voltaje del tubo de 700 V PMT).
  16. Analizar los datos utilizando métodos de densitometría24.

Resultados

En una reacción de transcripción in vitro en la que el paso limitante de la reacción es el inicio de la transcripción mediada por el factor sigma, la actividad de transcripción debe aumentar linealmente con la cantidad de factor sigma. Presentamos la preparación de experimentos de transcripción in vitro que prueban un rango de concentraciones de RpoD junto con dos concentraciones de ARN polimerasa para observar la señal variable resultante de la incorporación de nucleótidos radiomarcados en pr...

Discusión

Los ensayos de transcripción in vitro construidos utilizando el protocolo presentado se utilizaron recientemente para estudiar el papel de un factor de transcripción en B. burgdorferi y se pueden aplicar para construir experimentos similares utilizando otros factores de transcripción, factores sigma y moléculas23. Una vez obtenida la ARN polimerasa activa de B. burgdorferi y detectada su actividad, se pueden modificar los componentes y las condiciones dentro de los e...

Divulgaciones

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Agradecimientos

Este trabajo fue apoyado por el Fondo de Inversión Estratégica en Ciencias de la Salud Faculty Development Grant de la Universidad de Creighton. La cepa RpoC-His10X de B. burgdorferi fue amablemente proporcionada por el Dr. D. Scott Samuels de la Universidad de Montana. La cepa de E. coli que alberga el plásmido pMAL-C5X que codifica un alelo rpoD marcado con proteína de unión a maltosa fue amablemente proporcionada por el Dr. Frank Gherardini de Rocky Mountain Laboratories, NIAID, NIH.

Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
0.45 micron syringe filterThermo Scientific726-2545Step 1.7 and 2.3
50 mL conical tubesMidSciC50BStep 1.3, and subsequent steps
50 mL high-speed centrifuge tubesThermo Scientific3119-0050PKStep 1.2
500 mL Centrifuge bottlesThermo Scientific3120-9500PKStep 1.1
B-PER and instruction manualThermo Scientific78248Step 1.4 and 2.2
Calcium chlorideFisher Scientific10035-04-8Step 2.6
Centrifugal filters 10 Kd cutoffMillipore SigmaUFC8010Step 1.11 and 2.11
Cobalt resin and instruction manualThermo Scientific89969Step 1.9
DithiothreitolAcros Organics426380500Step 1.4 and subsequent steps
Dnase (Nuclease)Millipore Sigma70746Step 1.4 and 2.2
Factor Xa Protease Haematologic TechnologiesHCXA-0060Step 2.6
GE Typhoon 5 PhosphoimagerGE lifesciencesMultipleStep 4.15
Gel ImagerBio-RadMutipleStep 1.13 and subsequent protien quality check steps
H2O for in vitro transcriptionFisher Scientific7732-18-5Step 3.2 and 3.3
high fidelity PCR kitNew England BiolabsM0530SStep 3.1
High-speed centrifugeEppendorfStep 1.1, and subsequent steps
HiTrap Heparin HP 5 x 1 mLCytiva Life Sciences17040601Step 2.8
ImidazoleSigma-Aldrich56750-100GStep 1.9
LysozymeThermo Scientific90082Step 1.4 and 2.2
Magnesium chloride Fisher ScientificS25401Step 4.1
Manganese chlorideFisher ScientificS25418Step 4.1
Mini protean tetra cellBio-RadMutipleStep 1.13 and subsequent protien quality check steps
NP-40Thermo Scientific85124Step 4.1
NTP mixtureThermo ScientificR0481Step 4.1
PCR purification kitQiagen28506Step 3.2
PCR tubesMidSciPR-PCR28ACFStep 1.12
PD-10 Sephadex buffer exchange column and instruction manualCytiva17085101Step 1.10 and 2.10 (gel filtration column)
pMAL Protein Fusion
and Purification System Instruction manual		New England BiolabsE8200SStep 2.1
Polyacrylamide gels AnyKDBio-Rad456-8125Step 1.13 and subsequent protien quality check steps
Potassium glutamateSigma-AldrichG1251Step 4.1
Protease inhibitorThermo Scientific78425Step 1.4 and 2.2
Radiolabeled ATPPerkin ElmerBLU503HStep 4.2
RNA Loading Dye, (2x)New England BiolabsB0363SStep 4.13
Rnase inhibitorThermo ScientificEO0381Step 4.1
SpectrophotometerBiotekMutipleStep 1.13 and subsequent protien quality check steps
TBE-Urea gels 10 percentBio-Rad4566033Step 4.14

Referencias

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