前药染料纳米组件的简单制备和光活化

摘要

该协议描述了光响应前药染料纳米组装的制造和表征。明确描述了通过光触发拆卸从纳米颗粒释放药物的方法，包括光照射设置。光照射后从纳米颗粒释放的药物对人结直肠肿瘤细胞表现出优异的抗增殖作用。

摘要

自组装是构建纳米级药物递送系统的一种简单而可靠的方法。光活化前药能够在光照射调节的靶位点从纳米载体中可控地释放药物。在该协议中，提出了一种通过分子自组装 制造 可光活化前药染料纳米颗粒的简便方法。详细介绍了前药合成、纳米颗粒制造、纳米组件的物理表征、光切割演示和 体外 细胞毒性验证的程序。首先合成了可光裂解的硼-二吡咯甲烷-苯丁酸氮芥（BC）前药。BC和近红外染料IR-783以优化的比例可以自组装成纳米颗粒（IR783 / BC NPs）。合成的纳米颗粒的平均尺寸为87.22 nm，表面电荷为-29.8 mV。纳米颗粒在光照射下分解，可以通过透射电子显微镜观察到。BC的光裂解在10 min内完成，苯丁酸氮芥的回收率为22%。与未辐照的纳米粒子和无辐照的BC前药相比，纳米粒子在530 nm的光照射下表现出更强的细胞毒性。该协议为光响应性药物递送系统的构建和评估提供了参考。

引言

化疗是一种常见的癌症治疗方法，它使用细胞毒性药物杀死癌细胞，从而抑制肿瘤生长¹。然而，由于^{化疗药物的}脱靶吸收，患者可能会遭受诸如心脏毒性和肝毒性等副作用2，^3，4。因此，通过肿瘤中药物释放/活化的时空控制进行局部药物递送对于最大限度地减少正常组织中的药物暴露至关重要。

前药是化学修饰的药物，在正常组织中表现出降低的毒性，同时在激活后保留其在病变中的作用^5，6。前药可以对多种刺激有反应，如pH⁷，⁸，酶⁹，10，超声11，¹²，热13和光¹⁴，¹⁵，^16，并在病变中特异性释放其母体药物。然而，许多前药表现出固有的缺点，如溶解度差、吸收率不正确和早期代谢破坏，这可能会限制它们的发育¹⁷。在这种情况下，前药纳米组件的形成具有减少副作用、原位药物释放、更好的保留以及治疗和成像相结合等优点，表明这些纳米组件具有巨大的应用潜力。已经开发出许多用于疾病治疗的前药纳米组件，包括阿霉素前药纳米球、姜黄素前药胶束和喜树碱前药纳米纤维¹⁸。

在该协议中，我们提出了一种制备前药染料纳米组件的简单方法，该方法具有高前药含量，良好的水分散性，长期稳定性和灵敏的反应能力。IR783是一种水溶性近红外染料，可作为纳米组件的稳定剂¹⁹。纳米组件的另一个成分是硼 - 二吡咯甲烷 - 苯丁酸氮芥（BODIPY-Cb，BC），这是一种前药，设计有两个主要原因。由于苯丁酸氮芥（Cb） 在体内表现出全身毒性，前药形式可以降低其毒性²⁰。BC前药可以使用针对疾病病变的530nm光照射进行光切割，从而实现Cb的局部释放。另一方面，Cb在水性环境中容易水解，可以通过将其转化为前药形式^来保护21。因此，BC前药和IR-783染料的共组装有望形成稳定有效的药物递送纳米系统（图1A）。这种前药染料纳米组装提高了前药分子的分散性和稳定性，表明其在光控药物递送中的应用潜力。BC前药的光切割能够分解纳米颗粒并在病变中光控制Cb的释放（补充图1）。

研究方案

1. 硼-二吡咯甲烷-苯丁酸氮芥（BC）前药的合成（图2）²²

1. BODIPY-OAc的合成
   1. 称取1.903g2，4-二甲基吡咯，并在氮气气氛下将其溶解在圆底烧瓶中的20mL无水二氯甲烷（DCM）中。称取1.638g乙酰氧基乙酰氯，并将其滴加到溶液中。在室温下继续搅拌10分钟，然后在40°C下回流溶液1小时。
   2. 将混合物冷却至室温。称取5.170克N ，N-二异丙基乙胺（DIPEA），并在搅拌下将其滴加到混合物中。30分钟后，称取三氟化硼二乙醚酸硼5.677克（BF₃·_{OEt 2}），将其滴加到溶液中，并继续搅拌30分钟。
   3. 向混合物中加入10g硅胶（200-400目），并在45°C下通过旋转蒸发除去溶剂。 当硅胶恢复为干粉时停止蒸发。
   4. 将玻璃料添加到墨盒底部（参见 材料表）。将硅胶（来自步骤1.1.3）填充到小柱中，然后将另一个玻璃块添加到填充凝胶顶部的滤芯中。
   5. 将墨盒固定到与快速色谱系统连接的环中（参见 材料表），然后转动以锁定。将滤芯安装在快速色谱系统中六通阀的顶部，并在阀门下方安装闪蒸柱（见 材料表）。
   6. 启动色谱仪并将515 nm和365 nm设置为检测波长。用 4/3 （v/v） 己烷/DCM 进行洗脱。在出现 515 nm 信号时收集淋洗液级分。
   7. 通过在40°C下旋转蒸发从收集的馏分中除去溶剂，直到溶剂收集瓶中不再收集溶剂。将固体产品放入真空干燥室中过夜，以除去剩余的溶剂。
2. BODIPY-OH的合成
   1. 称取 1.120 g BODIPY-OAc（在步骤 1.1 中合成），并在室温下将其溶解在 70 mL 四氢呋喃 （THF） 中，并用箔纸完全覆盖。将 70 mL 的 0.1 M LiOH 水溶液滴加到 BODIPY-OAc 溶液中。
   2. 搅拌混合物30分钟，并在40°C下通过旋转蒸发除去溶剂，直到溶剂收集瓶中不再收集溶剂。将残留物放入真空干燥室中过夜以除去水分。
   3. 将干残留物溶解在 30 mL DCM 中，并向溶液中加入 10 g 硅胶。通过在40°C下旋转蒸发除去溶剂。 当硅胶恢复为干粉时停止蒸发。
   4. 按照步骤1.1.4至1.1.6，通过柱色谱纯化产物BODIPY-OH，仅使用DCM作为洗脱液。
   5. 将在不同洗脱时间点收集的馏分与薄层色谱（TLC）上的BODIPY-OAc的THF溶液进行比较，并确定产物²³。
      1. 将 3-4 μL 洗脱级分和 BODIPY-OAc 溶液分别点在相同高度的 TLC 板的一个边缘上。将TLC板放入含有1 mL DCM的玻璃室中，将斑点边缘浸入DCM溶剂中，但将两个斑点从溶剂中取出。
      2. 当DCM溶剂达到板高度的一半以上时，取出TLC板。选择具有与BODIPY-OAc点不同高度的TLC斑点的洗脱级分。
   6. 通过在40°C（步骤1.1.7）下旋转蒸发除去溶剂，得到产品BODIPY-OH。
3. 二味-_（Me）2-OH的合成
   1. 称取313mgBODIPY-OH，并在氮气气氛下在黑暗中将其溶解在35mL无水乙醚中。将3.75mL甲基碘化镁（3M乙醚溶液）滴加到溶液中，并在室温下保持搅拌3小时。
   2. 通过滴加 3.5 mL 水来淬灭反应。
   3. 用DCM和水提取混合物。
      1. 将混合物转移到 125 mL 分离漏斗中。将 20 mL DCM 加入混合物中。
      2. 关闭分离漏斗的盖子。将漏斗倾斜约 45°，然后轻轻摇动漏斗。打开盖子放气。重复此步骤3次，静置3分钟。
      3. 打开底部阀门，将下部有机相收集在烧杯中。
      4. 向水相中加入 30 mL DCM。重复提取（步骤1.3.3.2和1.3.3.3）3次，每次用30 mL DCM。
   4. 将10g固体Na₂SO₄ 加入收集的有机相中，使有机相干燥过夜。
   5. 将过滤瓶连接到带有橡胶管的真空泵。将一张滤纸放在 Büchner 漏斗上，然后将漏斗插入烧瓶顶部。用 1 mL DCM 润湿滤纸，将混合物转移到漏斗中，然后打开真空泵。收集烧瓶中的有机溶液。
   6. 在有机溶液中加入10克硅胶。通过在40°C下旋转蒸发除去有机溶剂，直到硅胶恢复为干粉。以己烷/DCM = 1/1 （v/v） 为洗脱液，通过柱层析（步骤1.1.4至1.1.6）纯化产物BODIPY-（Me）_2-OH。
   7. 使用步骤1.2.5中所述的TLC分析选择含有产物的洗脱级分（TLC点与BODIPY-OH高度不同）。通过在40°C下旋转蒸发除去溶剂，得到步骤1.1.7所述的产物。
4. 肉毒杆菌-（Me）_{2-I 2-OH}的合成
   1. 称取 41 mg BODIPY-（Me）2-OH，并在氮气气氛下在黑暗中溶解在 _2.5 mL 无水 THF 中。称取74mg的 N-碘琥珀酰亚胺，并将其溶解在1mL无水THF中。
   2. 将 N-碘琥珀酰亚胺溶液滴加到BODIPY-（Me）_2-OH溶液中。在室温下搅拌3.5小时后，在40°C下通过旋转蒸发除去溶剂，直到在旋转蒸发器的溶剂收集瓶中不再收集溶剂。
   3. 将残留物溶解在 10 mL DCM 中，每次用 30 mL 水洗涤 3 次，如步骤 1.3.3 中所述。用Na₂SO 4干燥有机相（步骤1.3.4和1.3.5）。 通过40°C旋转蒸发除去溶剂（步骤1.1.7），得到产物BODIPY-（Me）_{2-I 2-OH}。
5. BODIPY-Cb的合成
   1. 称取85mg苯丁酸氮芥，在氮气气氛下避光溶解于2mL无水DCM中。称取 69 mg N，N'-二环己基碳二亚胺，并将其溶解在 1 mL 无水 DCM 中。将其滴加到苯丁酸氮芥溶液中，搅拌10分钟。
   2. 将 1.7 mg 4-二甲氨基吡啶溶解在 0.5 mL 无水 DCM 中。将此溶液加入混合物中，并在室温下继续搅拌10分钟。然后加入73mg溶解在2mL无水DCM中的BODIPY-（Me）_2-I 2-OH，并保持搅拌₂小时。
   3. 向混合物中加入10g硅胶，并在40°C下通过旋转蒸发除去溶剂。 当硅胶恢复为干粉时停止蒸发。以己烷/DCM = 7/3 （v/v） 为洗脱液，通过柱层析（步骤1.1.4至1.1.6，540 nm和365 nm信号波长）纯化产物BODIPY-Cb。
   4. 使用TLC分析（步骤1.2.5）选择含有不同于BODIPY-（Me）_{2-I 2-OH}产物的洗脱级分。通过在40°C下旋转蒸发除去溶剂（步骤1.1.7），得到产品BODIPY-Cb。

2. 闪速沉淀法制备IR783/BC NPs

1. 称取 10 mg BC 前药 （BODIPY-Cb），并将其溶解在 1.5 mL 微管中的 1 mL DMSO 中，以获得 10 mg/mL 储备溶液。用箔纸覆盖BC溶液。
2. 在 1.5 mL 微管中制备 300 μL 0.4 mg/mL IR-783 的过滤去离子水中。将该微管以 1，500 rpm 的速度放置在涡旋混合器上。
3. 使用 20 μL 移液器在 10 秒内将 20 μL DMSO 中的 BC 溶液加入到 IR-783 溶液中。移液器吸头的末端应接触微管的内壁（图1B）。
4. 将微管在涡旋混合器上再保持30秒，以获得IR783 / BC NP溶液。然后，将纳米颗粒溶液放在完全覆盖有箔纸的架子上。
5. 将所得的IR783 / BC NP溶液在2，000× g 和4°C下离心10分钟以除去聚集体。收集上清液，在管中留下~20μL以避免干扰沉淀。丢弃颗粒。
6. 将上清液在30，000× g 和4°C下离心两次30分钟，并从两次离心中收集纳米颗粒沉淀。将纳米颗粒重悬于 300 μL 的 1x PBS 中。
   注意:当DMSO中的疏水BC前药涡旋分散在水中时，DMSO被水溶解，前药分子倾向于形成纳米级组装体，以在局部过饱和情况下保持自身稳定²⁴。
7. 使用 表1所示的洗脱方法，通过高效液相色谱（HPLC）定量IR-783和BC的含量。
   注意:HPLC样品是通过混合等体积的纳米颗粒溶液和乙腈来制备的。进样体积为20μL。苯丁酸氮芥和BC前药的检测波长为260 nm，IR783的检测波长为783 nm。HPLC色谱柱是一种分析型4.6 mm（内径）x 100 mm（长度）C18色谱柱，粒径为2.7 μm，孔径为120 Å。
8. 根据以下公式计算前药包封效率（EE%）和负载能力（LC%）:
   

时间（分钟）	乙腈（%）	水 （%）
0	20	80
5	20	80
30	95	5
35	95	5

表1:用于BC前药及其光切割的定性和定量分析的HPLC方法。 经许可转载²⁵.版权所有 2022，威利。

3. IR783/BC NP的表征

1. 使用动态光散射（DLS）仪器测量IR783 / BC NP的平均尺寸（参见 材料表）。在比色皿中加入 200 μL IR783/BC NP 溶液，然后将比色皿插入支架中进行测量。将测量类型设置为"尺寸"，将测量温度设置为25°C。 每次测量执行三次测量，持续时间为 20 秒。
2. 使用 DLS 仪器使用 zeta 电位测试比色皿测量 IR783/BC NP 的表面电荷。
   1. 在 1.5 mL 微管中用 725 μL 去离子水稀释 25 μL IR783/BC NP 溶液，并将溶液加入 zeta 电位测试比色皿中。将比色皿放入样品槽中。盖上样品槽。
   2. 将测量类型设置为"zeta电位"，将测量温度设置为25°C。 执行 10 次测量。
3. 准备用于透射电子显微镜（TEM）成像的样品。在铜网格（300目）上的一块多孔碳膜上加入 10 μL IR783/BC NP 溶液，并去除 7 μL。 将 3 μL 溶液留在薄膜上过夜以进行自动蒸发。
   注意:加入 10 μL NP 溶液，然后去除 7 μL，可使液滴覆盖薄膜上更广泛的区域。

4. IR783/BC NPs的光活化

1. 用铁支架设置一个LED灯（530 nm;见 材料表），使灯直接面向操作地板。将积分球光电二极管光度计（见 材料表）直接放在LED灯下方。
   注意:为了防止环境光的影响，所有光照射实验都在暗室中进行。
2. 打开LED灯，打开光度计的盖子。使用相关软件记录辐照度并设置灯参数（见 材料表）。调整输入电流 （mA） 以将辐照度设置为 50 mW/cm²。
   注意:辐照度还受LED灯和光度计之间距离的影响。在这里使用的设置（图3A，B）中，距离固定为5厘米。
3. 根据BC浓度，用去离子水将IR783 / BC NP溶液稀释至50μM。将 200 μL IR783/BC NP 溶液加入 1.5 mL 微管中。将管子放在泡沫块上，泡沫块具有微管的凹槽配件尺寸，并且与步骤4.1中的光度计高度相同（图3C，D）。
4. 打开管子的盖子。打开LED灯并照射纳米颗粒溶液1，2，3，5，7和10分钟。
5. 量化光照射后HPLC的BC消耗和Cb释放。使用以下公式计算剩余BC和Cb释放的百分比:
   

5. 测试IR783 / BC NPs在有和没有光照射下的细胞毒性

1. 在含有10%胎牛血清和1%青霉素 - 链霉素（完全培养基）的RPMI 1640培养基中培养HCT116细胞（人结直肠肿瘤细胞系）在37°C的5%CO₂ 气氛中（~2 x 10⁶ 个细胞在90mm细胞培养皿中）。每2-3天常规传代培养细胞。
   注意:HCT116是一种人结肠细胞系。与HeLa、MCF7和A549细胞等其他癌细胞相比，HCT-116细胞表达更高水平的caveolin-1²⁵，可被IR783靶向并增强IR783 / BC NPs的细胞摄取。
2. 将HCT116细胞接种在96孔板中，RPMI 1640完全培养基的密度为每孔10⁴ 个细胞。
   1. 当细胞汇合度超过50%时，从培养皿中吸出培养基。用1x PBS洗涤细胞并去除PBS。加入1mL的0.25%胰蛋白酶溶液，并在37°C的5%CO₂ 培养箱中孵育。
   2. 3分钟后，加入2mL完全培养基以淬灭胰蛋白酶消化。重悬细胞，将细胞悬液转移到15 mL离心管中，并以300 x g 离心3分钟。弃去上清液并将细胞沉淀重悬于1mL完全培养基中。
   3. 用完全培养基将 10 μL 细胞悬液稀释至 200 μL。将 10 μL 放在血细胞计数器上并用盖玻片盖住。
   4. 在显微镜下观察血细胞计数器（目镜:10x;物镜:4x）。计数并记录四个角方块和中心的单元格编号。使用以下公式计算细胞浓度:
      
      其中 n = 五个方块的单元格数的平均值。
   5. 将细胞悬液稀释至 1 x 10⁵ 个细胞/mL。在 96 孔板中每孔加入 100 μL 细胞悬液以接种细胞。在未接种的孔中每孔加入 100 μL PBS。
3. 用 （1） 0.1-150 μM 游离 BC、（2） 0.1-150 μM IR783/BC NP（基于 BC 浓度）、（3） 0.1-150 μM 游离 BC 用光照射处理细胞，或 （4） 0.1-150 μM IR783/BC NP（基于 BC 浓度）用光照射。将细胞在37°C的5%CO₂ 培养箱中孵育6小时。
   注意:游离的BC和IR783 / BC NP溶液用完整的培养基从各自的储备溶液中稀释。
4. 孵育6小时后，用新鲜的完全培养基替换含前药/纳米颗粒的培养基。将非辐照组1和2在黑暗中孵育24小时。对于第3组和第4组，用530nm LED灯（50mW /^{cm 2}）照射细胞5分钟，孵育24小时。
   注意:将细胞板放置在泡沫块上，以确保与步骤4.1中的光度计相同的高度。
5. 用3-（4，5-二甲基噻唑-2-基）-2，5-二苯基四唑溴化物（MTT）测定法测定细胞活力。
   1. BC或纳米颗粒处理后，向每个孔中加入10μLMTT（PBS中的10mg / mL），并将板在37°C孵育3小时。然后，取出培养基并向每个孔中加入 100 μL DMSO。用酶标仪在490 nm、570 nm和630 nm处读取吸光度。
   2. 使用以下公式计算细胞活力:
      
      注意:每组进行四个独立实验（n = 4）进行分析。在计算细胞活力时，OD₄₉₀ 可以用OD_{570-OD 630} 代替。

结果

本研究采用闪速降水法成功制备了IR783/BC NPs。合成的IR783 / BC NPs呈紫色溶液，而IR783的水溶液为蓝色（图4A）。 如图4B所示，IR783/BC NPs的平均尺寸约为87.22 nm，多分散指数（PDI）为0.089，尺寸分布较窄。IR783/NPs的表面电荷约为-29.8 mV（图4C），这可能归因于IR783带负电荷的磺酸盐基团。 图4D 显示了IR783/BC NP的稳定...

讨论

该协议概述了用于制造前药物染料纳米颗粒的简便闪蒸沉淀方法，该方法为纳米颗粒形成提供了一种简单方便的方法。此方法有几个关键步骤。首先，对于合成、制造和表征的所有步骤，微管等容器应用箔覆盖，以避免环境光对BC前药进行不必要的光切割。此外，在闪速沉淀步骤中，应将含有IR-783溶液的微管稳定地放置在涡旋混合器上，同时缓慢加入BC前药溶液。这样，BC前药溶液（在DMSO中）可以...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
1260 Infinity II HPLC	Agilent Technologies
2,4-Dimethyl pyrrole	J&K Scientific	315305
3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide(MTT)	Gibco	M6494
4-Dimethylaminopyridine (4-DMAP)	J&K Scientific	212279
90 mm Petri Dish Clear Treated Sterile	SPL	11090
96-well Tissue Culture Plate Clear Treated Sterile	SPL	30096
Acetoxyacetyl chloride	J&K Scientific	192001
Boron trifluoride diethyl etherate	J&K Scientific	921076
Büchner funnel	AS ONE	3-6466-01
Chlorambucil	J&K Scientific	321407-1G
CM100 Transmission Electron Microscope	Philips
CombiFlash RF chromatography system	Teledyne ISCO
Dichloromethane	DUKSAN Pure Chemicals	JT9315-88
Dimethyl sulfoxide	DUKSAN Pure Chemicals	2762
Disposable cuvette	Malvern Panalytical	DTS1070	Zeta potential measurement
Disposable cuvette	Malvern Panalytical	ZEN0040
Empty Disposable Sample Load Cartridges	Teledyne ISCO	693873225	can hold up to 65 g
Fetal bovine serum	Gibco	10270106
Filtering flask	AS ONE	3-7089-03
Hexane	DUKSAN Pure Chemicals	4198
Holey carbon film on copper grid	Beijing Zhongjingkeyi Technology Co.,Ltd	BZ10023a
HPLC column (InfinityLab Poroshell 120)	Agilent Technologies	695975-902T
Integrating sphere photodiode power sensor	Thorlabs	S142C
IR783	Tokyo Chemical Industry (TCI) Co., Ltd	I1031
LED	Mightex	LCS-0530-15-11
LED Driver Control Panel V3.2.0 (Software)	Mightex
Lithium Hydroxide Anhydrous	TCI	L0225
Methylmagnesium iodide, 3M solution in diethyl ether	Aladdin	M140783
N,N-Diisopropyl ethyl amine (DIPEA)	J&K Scientific	203402
N,N'-Dicyclohexylcarbodiimide (DCC)	J&K Scientific	275928
penicillin–streptomycin	Gibco	15140122
Phosphate-buffered saline (10×)	Sigma-Aldrich	P5493
Power and energy meter	Thorlabs	PM100 USB
Rotavapor	BUCHI Rotavapor R300
RMPI 1640	Gibco	21870076
Separatory funnel (125 mL)	Synthware	F474125L
Silver Silica Gel Disposable Flash Columns, 40 g	Teledyne ISCO	692203340
Sodium sulfate, anhydrous	Alfa Aesar	A19890
SpectraMax M4	Molecular Devices LLC
Tetrahydrofuran (THF), anhydrous	J&K Scientific	943616
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red	Gibco	25200056
Vortex	DLAB Scientific Co., Ltd	MX-S
Zetasizer Nano ZS90	Malvern Instrument