Fácil preparação e fotoativação de nanomontagens de pró-fármaco-corante

Resumo

Este protocolo descreve a fabricação e caracterização de um nanoconjunto fotorresponsivo de corante pró-fármaco. A metodologia para liberação de fármacos a partir das nanopartículas por desmontagem desencadeada por luz, incluindo a configuração da irradiação luminosa, é explicitamente descrita. Os fármacos liberados das nanopartículas após irradiação luminosa exibiram excelentes efeitos antiproliferativos em células tumorais colorretais humanas.

Resumo

A automontagem é um método simples, mas confiável, para a construção de sistemas de liberação de fármacos em nanoescala. Os pró-fármacos fotoativáveis permitem a liberação controlável de fármacos a partir de nanocarreadores em locais-alvo modulados pela irradiação luminosa. Neste protocolo, um método fácil para a fabricação de nanopartículas fotoativáveis de pró-fármaco corante via automontagem molecular é apresentado. Os procedimentos para síntese de pró-fármacos, fabricação de nanopartículas, caracterização física da nanomontagem, demonstração de fotoclivagem e verificação de citotoxicidade in vitro são descritos em detalhes. Um pró-fármaco fotoclimovível boro-dipirrometeno-clorambucil (BC) foi sintetizado pela primeira vez. BC e um corante de infravermelho próximo, IR-783, em uma proporção otimizada, poderiam se auto-montar em nanopartículas (IR783/BC NPs). As nanopartículas sintetizadas apresentaram tamanho médio de 87,22 nm e carga superficial de -29,8 mV. As nanopartículas se desmontaram após irradiação luminosa, o que pôde ser observado por microscopia eletrônica de transmissão. A fotoclivagem da CB foi concluída em 10 min, com eficiência de recuperação de 22% para clorambucil. As nanopartículas apresentaram maior citotoxicidade sob irradiação luminosa a 530 nm em comparação com as nanopartículas não irradiadas e o pró-fármaco BC livre irradiado. Este protocolo fornece uma referência para a construção e avaliação de sistemas de liberação fotorresponsiva de fármacos.

Introdução

A quimioterapia é um tratamento comum do câncer que emprega agentes citotóxicos para matar as células cancerosas e, assim, inibe o crescimento tumoral¹. Entretanto, os pacientes podem sofrer efeitos colaterais como cardiotoxicidade e hepatotoxicidade devido à absorção fora do alvo dos quimioterápicos ^2,3,4. Portanto, a liberação localizada de fármacos por meio do controle espaço-temporal da liberação/ativação de fármacos em tumores é essencial para minimizar a exposição a fármacos em tecidos normais.

Os pró-fármacos são drogas quimicamente modificadas que apresentam toxicidade reduzida em tecidos normais, mantendo sua ação em lesões doentes após ativação ^5,6. Os pró-fármacos podem ser responsivos a uma variedade de estímulos, como pH^7,8, enzimas^9,10, ultrassom 11,12, calor 13 e luz^{14,15,1 6,} e liberar seus fármacos precursores especificamente nas lesões. No entanto, muitos pró-fármacos apresentam desvantagens inerentes, como baixa solubilidade, taxa de absorção incorreta e destruição metabólica precoce, o que pode limitar seu desenvolvimento¹⁷. Nesse contexto, a formação de nanomontagens de pró-fármacos oferece vantagens como diminuição de efeitos colaterais, liberação in situ de fármacos, melhor retenção e combinação de tratamento e imagem, indicando grande potencial de aplicação desses nanoconjuntos. Muitos nanoconjuntos de pró-fármacos foram desenvolvidos para o tratamento de doenças, incluindo nanoesferas de pró-fármacos de doxorrubicina, micelas de pró-fármacos para curcumina e nanofibras de pró-fármacos para camptotecina¹⁸.

Neste protocolo, apresentamos um método simples para a preparação de nanomontagens de corantes pró-fármacos que exibem alto conteúdo de pró-fármaco, boa dispersibilidade em água, estabilidade a longo prazo e capacidade de resposta sensível. O IR783 é um corante solúvel em água no infravermelho próximo que pode servir como estabilizador das nanomontagens¹⁹. O outro componente da nanomontagem é o boro-dipirrometeno-clorambucil (BODIPY-Cb, BC), um pró-fármaco que foi projetado por duas razões principais. Como o clorambucil (Cb) apresenta toxicidade sistêmica in vivo, a forma pró-fármaco pode diminuir sua toxicidade²⁰. O pró-fármaco BC pode ser fotoclivado com irradiação luminosa de 530 nm direcionada às lesões da doença, possibilitando a liberação local de Cb. Por outro lado, o Cb é propenso à hidrólise em ambientes aquosos, podendo ser protegido transformando-se em pró-fármaco²¹. Assim, esperava-se que a co-montagem do pró-fármaco BC e do corante IR-783 formasse um nanossistema de liberação estável e eficaz de fármacos (Figura 1A). Esta nanomontagem de pró-fármaco-corante melhora a dispersibilidade e estabilidade das moléculas de pró-fármaco, sugerindo seu potencial para aplicação na liberação de fármacos controláveis por luz. A fotoclivagem do pró-fármaco BC possibilita a desmontagem das nanopartículas e a liberação de Cb nas lesões controlada pela luz (Figura 1 suplementar).

Protocolo

1. Síntese do pró-fármaco boro-dipirrometeno-clorambucil (BC) (Figura 2)²²

1. Síntese de BODIPY-OAc
   1. Pesar 1,903 g de 2,4-dimetilpirrol e dissolvê-lo em 20 ml de diclorometano anidro (DCM) num balão de fundo redondo sob atmosfera de azoto. Pesar 1,638 g de cloreto de acetila acetóxi e adicioná-lo gota a gota na solução. Continuar a mexer durante 10 minutos à temperatura ambiente e, em seguida, refluir a solução durante 1 h a 40 °C.
   2. Arrefecer a mistura até à temperatura ambiente. Pesar 5,170 g de N,N-diisopropiletilamina (DIPEA) e adicioná-lo gota a gota na mistura sob agitação. Após 30 min, pesar 5,677 g de trifluoreto de boro dietiléter (BF₃· OEt₂), adicione-o gota na solução e continue mexendo por mais 30 min.
   3. Adicionar 10 g de sílica gel (200-400 mesh) à mistura e remover o solvente por evaporação rotativa a 45 °C. Pare a evaporação quando o gel de sílica retornar ao pó seco.
   4. Adicione uma frita na parte inferior de um cartucho (consulte a Tabela de Materiais). Encha o gel de sílica (do passo 1.1.3) no cartucho e, em seguida, adicione outra frita no cartucho na parte superior do gel cheio.
   5. Fixe o cartucho no colar conectado com o sistema de cromatografia flash (consulte Tabela de Materiais) e vire-o para travá-lo. Instale o cartucho na parte superior da válvula de seis vias no sistema de cromatografia flash e instale uma coluna de flash (consulte Tabela de Materiais) sob a válvula.
   6. Inicie o instrumento de cromatografia e defina 515 nm e 365 nm como comprimentos de onda de detecção. Realizar eluição com 4/3 (v/v) hexano/DCM. Colete as frações eluentes quando o sinal de 515 nm aparecer.
   7. Remover o solvente das fracções recolhidas por evaporação rotativa a 40 °C até que não seja recolhido mais solvente no balão de recolha de solvente. Coloque o produto sólido em uma câmara de secagem a vácuo durante a noite para remover o restante do solvente.
2. Síntese de BODIPY-OH
   1. Pesar 1,120 g de BODIPY-OAc (sintetizado no passo 1.1) e dissolvê-lo em 70 ml de tetraidrofurano (THF) à temperatura ambiente, totalmente coberto com papel alumínio. Adicionar 70 mL de solução aquosa de LiOH 0,1 M gota a gota na solução de BODIPY-OAc.
   2. Agitar a mistura durante 30 min e remover o solvente a 40 °C por evaporação rotativa até que não seja recolhido mais solvente no balão de recolha de solventes. Coloque o resíduo em uma câmara de secagem a vácuo durante a noite para remover a água.
   3. Dissolva o resíduo seco em 30 mL de CMD e adicione 10 g de sílica gel na solução. Retire o solvente por evaporação rotativa a 40 °C. Pare a evaporação quando o gel de sílica retornar ao pó seco.
   4. Purificar o produto BODIPY-OH por cromatografia em coluna, seguindo os passos 1.1.4 a 1.1.6, tendo como eluente apenas DCM.
   5. Comparar frações coletadas em diferentes momentos de eluição com uma solução de THF de BODIPY-OAc em cromatografia em camada delgada (CCD) e identificar o produto²³.
      1. Spot 3-4 μL da fração eluída e a solução de BODIPY-OAc separadamente em uma borda de uma placa de CCD na mesma altura. Coloque a placa de CCD em uma câmara de vidro contendo 1 mL de CMD, submergindo a borda manchada no solvente de MDC, mas com os dois pontos fora do solvente.
      2. Retire a placa TLC quando o solvente DCM atingir mais da metade da altura da placa. Selecione a fração eluída com um ponto TLC a uma altura diferente do ponto BODIPY-OAc.
   6. Remover o solvente por evaporação rotativa a 40 °C (passo 1.1.7) para obter o produto BODIPY-OH.
3. Síntese de BODIPY-(Me)_2-OH
   1. Pesar 313 mg de BODIPY-OH e dissolvê-lo em 35 mL de éter dietílico anidro no escuro sob atmosfera de nitrogênio. Adicionar 3,75 ml de iodeto de metilmagnésio (3 M em éter dietílico) gota a gota na solução e continuar a mexer durante 3 h à temperatura ambiente.
   2. Atenuar a reação adicionando 3,5 mL de água gotas.
   3. Extraia a mistura com DCM e água.
      1. Transfira a mistura para um funil separador de 125 mL. Adicionar 20 mL de CMD à mistura.
      2. Feche a tampa do funil separador. Incline o funil em torno de 45° e agite levemente o funil. Abra a tampa para desinflar. Repita este passo 3 vezes e deixe repousar durante 3 minutos.
      3. Abra a válvula inferior e colete a fase orgânica inferior em um béquer.
      4. Adicionar 30 mL de CMD à fase aquosa. Repetir a extracção (passos 1.3.3.2 e 1.3.3.3) 3 vezes com 30 ml de CMD de cada vez.
   4. Adicionar 10 g de Na₂SO₄ sólido na fase orgânica coletada para secar a fase orgânica durante a noite.
   5. Ligue um frasco filtrante a uma bomba de vácuo com um tubo de borracha. Coloque um pedaço de papel filtro no funil de Büchner e insira o funil na parte superior do frasco. Molhe o papel de filtro com 1 mL de DCM, transfira a mistura para o funil e ligue a bomba de vácuo. Recolher a solução orgânica no balão.
   6. Adicione 10 g de sílica gel à solução orgânica. Remover o solvente orgânico por evaporação rotativa a 40 °C até que o gel de sílica volte ao pó seco. Purificar o produto BODIPY-(Me)_2-OH por cromatografia em coluna (passos 1.1.4 a 1.1.6) com hexano/DCM = 1/1 (v/v) como eluente.
   7. Seleccionar as fracções eluídas que contêm o produto utilizando a análise de CCD descrita no passo 1.2.5 (ponto de CCD a uma altura diferente da BODIPY-OH). Remover o solvente por evaporação rotativa a 40 °C para obter o produto conforme descrito no passo 1.1.7.
4. Síntese de BODIPY-(Me)2-I _2-OH
   1. Pesar 41 mg de BODIPY-(Me)_2-OH e dissolvê-lo em 2,5 mL de THF anidro no escuro sob atmosfera de nitrogênio. Pesar 74 mg de N-iodosuccinimida e dissolvê-lo em 1 ml de THF anidro.
   2. Adicionar a solução de N-iodosuccinimida gota a gota na solução de BODIPY-(Me)_2-OH. Depois de agitar durante 3,5 h à temperatura ambiente, remover o solvente por evaporação rotativa a 40 °C até que não seja recolhido mais solvente no balão de recolha de solvente no evaporador rotativo.
   3. Dissolver o resíduo em 10 mL de CMD e lavá-lo 3 vezes com 30 mL de água de cada vez, conforme descrito na etapa 1.3.3. Secar a fase orgânica com Na₂SO 4 (passos 1.3.4 e 1.3.5). Remover o solvente por evaporação rotativa a 40 °C (passo 1.1.7) para obter o produto BODIPY-(Me)2-I _2-OH.
5. Síntese de BODIPY-Cb
   1. Pesar 85 mg de clorambucil e dissolvê-lo em 2 ml de CMD anidro no escuro sob atmosfera de azoto. Pesar 69 mg de N,N'-diciclohexilcarbodiimida e dissolvê-lo em 1 ml de CMD anidra. Adicione gota a gota na solução de clorambucil com agitação por 10 min.
   2. Dissolver 1,7 mg de 4-dimetilaminopiridina em 0,5 mL de CMD anidra. Adicione esta solução à mistura e continue a mexer durante 10 minutos à temperatura ambiente. Em seguida, adicione 73 mg de BODIPY-(Me)2-I 2-OH dissolvido em 2 mL de DCM anidro e continue mexendo por₂ h.
   3. Adicionar 10 g de sílica gel à mistura e remover o solvente por evaporação rotativa a 40 °C. Pare a evaporação quando o gel de sílica retornar ao pó seco. Purificar o produto BODIPY-Cb por cromatografia em coluna (passos 1.1.4 a 1.1.6, comprimento de onda de sinal de 540 nm e 365 nm) com hexano/DCM = 7/3 (v/v) como eluente.
   4. Selecionar as frações eluídas contendo o produto diferente de BODIPY-(Me)2-I 2-OH usando a análise de CCD (etapa _1.2.5). Remover o solvente por evaporação rotativa a 40 °C (passo 1.1.7) para obter o produto BODIPY-Cb.

2. Preparação de NPs IR783/BC pelo método de precipitação instantânea

1. Pesar 10 mg do pró-fármaco BC (BODIPY-Cb) e dissolvê-lo em 1 mL de DMSO em um microtubo de 1,5 mL para obter uma solução-estoque de 10 mg/mL. Cubra a solução BC com papel alumínio.
2. Preparar 300 μL de 0,4 mg/mL IR-783 em água deionizada filtrada em um microtubo de 1,5 mL. Coloque este microtubo em um misturador de vórtices a 1.500 rpm.
3. Adicionar 20 μL da solução BC em DMSO à solução IR-783 durante 10 s a uma taxa constante utilizando uma pipeta de 20 μL. A extremidade da ponta da pipeta deve tocar a parede interna do microtubo (Figura 1B).
4. Mantenha o microtubo no misturador de vórtice por mais 30 s para obter a solução IR783/BC NP. Em seguida, coloque a solução de nanopartículas em um rack totalmente coberto com papel alumínio.
5. Centrifugar a solução IR783/BC NP resultante por 10 min a 2.000 x g e 4 °C para remover agregados. Recolher o sobrenadante, deixando ~20 μL no tubo para evitar perturbar o pellet. Descarte o pellet.
6. Centrifugar o sobrenadante duas vezes por 30 min a 30.000 x g e 4 °C e coletar o precipitado de nanopartículas de ambas as centrifugações. Ressuspender as nanopartículas em 300 μL de 1x PBS.
   NOTA: Quando o pró-fármaco BC hidrofóbico em DMSO é disperso em água com vórtice, o DMSO é dissolvido por água, e as moléculas de pró-fármaco tendem a formar conjuntos nanométricos para se manterem estáveis sob a situação de supersaturação local²⁴.
7. Quantificar o conteúdo de IR-783 e BC por cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC), usando o método de eluição mostrado na Tabela 1.
   NOTA: A amostra de HPLC é preparada misturando volumes iguais de solução de nanopartículas e acetonitrila. O volume de injeção é de 20 μL. O comprimento de onda de detecção para clorambucil e pró-fármaco BC é de 260 nm, e o comprimento de onda de detecção para IR783 é de 783 nm. A coluna HPLC é uma coluna analítica C18 de 4,6 mm (diâmetro interno) x 100 mm (comprimento), com tamanho de partícula de 2,7 μm e tamanho de poro de 120 Å.
8. Calcular a eficiência de encapsulação de pró-fármacos (EE%) e a capacidade de carga (CL%) de acordo com as seguintes equações:
   

Tempo (min)	Acetonitrila (%)	Água (%)
0	20	80
5	20	80
30	95	5
35	95	5

Tabela 1: Método por HPLC para análise qualitativa e quantitativa do pró-fármaco BC e sua fotoclivagem. Reproduzido com permissão²⁵. Direitos autorais 2022, Wiley.

3. Caracterização dos NPs IR783/BC

1. Meça o tamanho médio dos NPs IR783/BC com um instrumento de espalhamento dinâmico de luz (DLS) (consulte a Tabela de Materiais). Adicionar 200 μL de solução IR783/BC NP numa cubeta e introduzir a cubeta no suporte para medição. Defina o tipo de medição como 'tamanho' e a temperatura de medição como 25 °C. Realizar três medições com duração de 20 s para cada medida.
2. Meça a carga superficial dos NPs IR783/BC com o instrumento DLS usando uma cubeta de teste de potencial zeta.
   1. Diluir 25 μL de solução de IR783/BC NP com 725 μL de água deionizada num microtubo de 1,5 ml e adicionar a solução a uma cubeta de teste de potencial zeta. Coloque a cubeta no sulco da amostra. Tampar o sulco da amostra.
   2. Defina o tipo de medição como «potencial zeta» e a temperatura de medição como 25 °C. Realize 10 medições.
3. Preparar as amostras para imagens de microscopia eletrônica de transmissão (MET). Adicionar 10 μL de solução de NP IR783/BC em um pedaço de filme de carbono holey em uma grade de cobre (300 mesh) e remover 7 μL. Deixe 3 μL de solução no filme durante a noite para autoevaporação.
   NOTA: A adição de 10 μL da solução NP seguida da remoção de 7 μL permite que a gotícula cubra uma área mais ampla no filme.

4. Fotoativação de NPs IR783/BC

1. Configure uma lâmpada LED (530 nm; ver Tabela de Materiais) com um suporte de ferro para que a luz esteja diretamente voltada para o piso de operação. Coloque um fotômetro de fotodiodo de esfera integradora (consulte Tabela de Materiais) diretamente sob a lâmpada LED.
   NOTA: Para evitar a influência da luz ambiente, todos os experimentos de irradiação de luz são realizados em uma câmara escura.
2. Ligue a lâmpada LED e abra a tampa do fotômetro. Registre a irradiância e defina os parâmetros da lâmpada usando o software associado (consulte a Tabela de Materiais). Ajuste a corrente de entrada (mA) para ajustar a irradiância como 50 mW/cm².
   NOTA: A irradiância também é afetada pela distância entre a lâmpada LED e o fotômetro. No arranjo aqui utilizado (Figura 3A,B), a distância é fixada em 5 cm.
3. Diluir a solução IR783/BC NP com água deionizada para 50 μM com base na concentração de BC. Adicionar 200 μL da solução IR783/BC NP num microtubo de 1,5 ml. Colocar o tubo sobre um bloco de espuma com um sulco de encaixe do tamanho do microtubo e a mesma altura do fotômetro no passo 4.1 (Figura 3C,D).
4. Abra a tampa do tubo. Ligue a lâmpada LED e irradie a solução de nanopartículas por 1, 2, 3, 5, 7 e 10 min.
5. Quantificar o consumo de BC e a liberação de Cb por HPLC após irradiação luminosa. Calcule a porcentagem de liberação BC e Cb restantes usando as seguintes equações:
   

5. Teste de citotoxicidade de NPs IR783/BC com e sem irradiação luminosa

1. Cultura de células HCT116 (linhagem de células tumorais colorretais humanas) em meio RPMI 1640 contendo 10% de soro fetal bovino e 1% de Penicilina-Estreptomicina (meio completo) em atmosfera de 5% de CO₂ a 37 °C (~2 x 10⁶ células por prato em uma placa de cultura celular de 90 mm). Subcultura rotineiramente as células a cada 2-3 dias.
   NOTA: HCT116 é uma linhagem celular de cólon humano. Em comparação com outras células cancerosas, como HeLa, MCF7 e A549, as células HCT-116 expressam um nível mais alto de caveolina-1²⁵, que pode ser alvo de IR783 e aumentar a captação celular de NPs IR783/BC.
2. Plaquear as células HCT116 em placas de 96 poços com meio completo RPMI 1640 a uma densidade de 10^{a 4} células por poço.
   1. Aspirar o meio da placa de cultura quando a confluência celular exceder 50%. Lave as células com 1x PBS e remova o PBS. Adicionar 1 mL de solução de tripsina a 0,25% e incubar a 37 °C em incubadora de CO₂ a 5%.
   2. Após 3 min, adicionar 2 mL de meio completo para extinguir a digestão de tripsina. Ressuspender as células, transferir a suspensão celular para um tubo de centrifugação de 15 mL e centrifugar a 300 x g por 3 min. Descarte o sobrenadante e ressuspenda o pellet celular em 1 mL de meio completo.
   3. Diluir 10 μL da suspensão celular para 200 μL com meio completo. Coloque 10 μL em um hemocitômetro e cubra com uma lamínula.
   4. Observar o hemocitômetro ao microscópio (ocular: 10x; objetiva: 4x). Conte e registre os números de célula nos quatro quadrados de canto e no centro. Calcule a concentração celular usando a fórmula:
      
      Onde n = a média dos números de células dos cinco quadrados.
   5. Diluir a suspensão celular para 1 x 10⁵ células/mL. Adicionar 100 μL da suspensão celular por poço em uma placa de 96 poços para semear as células. Adicionar 100 μL de PBS por poço nos poços não semeados.
3. Tratar as células com (1) 0,1-150 μM de BC livre, (2) 0,1-150 μM de NPs IR783/BC (com base na concentração de BC), (3) 0,1-150 μM de BC livre com irradiação de luz, ou (4) 0,1-150 μM de NPs IR783/BC (com base na concentração de BC) com irradiação de luz. Incubar as células a 37 °C numa estufa de CO₂ a 5% durante 6 horas.
   NOTA: As soluções livres BC e IR783/BC NP são diluídas a partir de suas respectivas soluções de estoque com meio completo.
4. Após 6 h de incubação, substituir o meio contendo pró-fármaco/nanopartículas por meio fresco completo. Incubar os Grupos 1 e 2 sem irradiação no escuro por 24 h. Para os Grupos 3 e 4, irradiar as células com lâmpada LED de 530 nm (50 mW/cm²) por 5 min e incubar por 24 h.
   NOTA: As placas celulares são colocadas sobre um bloco de espuma para garantir a mesma altura que o fotômetro na etapa 4.1.
5. Determinar a viabilidade celular com o ensaio de brometo de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difenil tetrazólio (MTT).
   1. Após o tratamento BC ou nanopartículas, adicionar 10 μL de MTT (10 mg/mL em PBS) a cada poço e incubar as placas a 37 °C por 3 h. Em seguida, retire o meio e adicione 100 μL de DMSO a cada poço. Leia a absorbância com um leitor de microplacas a 490 nm, 570 nm e 630 nm.
   2. Calcule a viabilidade celular usando a seguinte equação:
      
      NOTA: Quatro experimentos independentes (n = 4) de cada grupo são conduzidos para análise. OD₄₉₀ pode ser substituído por OD_{570-OD 630} no cálculo da viabilidade celular.

Resultados

NPs IR783/BC foram fabricados com sucesso neste estudo usando um método de precipitação flash. As NPs IR783/BC sintetizadas apresentaram-se como solução roxa, enquanto a solução aquosa de IR783 foi azul (Figura 4A). Como mostrado na Figura 4B, os NPs IR783/BC exibiram um tamanho médio de aproximadamente 87,22 nm com um índice de polidispersidade (PDI) de 0,089, demonstrando uma distribuição de tamanho estreita. A carga superficial das IR783/NPs foi de...

Discussão

Este protocolo descreve um método fácil de precipitação por flash para a fabricação de nanopartículas de corante pró-fármaco, que oferece uma abordagem simples e conveniente para a formação de nanopartículas. Há várias etapas críticas nesse método. Em primeiro lugar, para todas as etapas de síntese, fabricação e caracterização, recipientes como microtubos devem ser cobertos com papel alumínio para evitar fotoclivagem desnecessária do pró-fármaco BC pela luz ambiental. Além disso, na etapa de pre...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
1260 Infinity II HPLC	Agilent Technologies
2,4-Dimethyl pyrrole	J&K Scientific	315305
3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide(MTT)	Gibco	M6494
4-Dimethylaminopyridine (4-DMAP)	J&K Scientific	212279
90 mm Petri Dish Clear Treated Sterile	SPL	11090
96-well Tissue Culture Plate Clear Treated Sterile	SPL	30096
Acetoxyacetyl chloride	J&K Scientific	192001
Boron trifluoride diethyl etherate	J&K Scientific	921076
Büchner funnel	AS ONE	3-6466-01
Chlorambucil	J&K Scientific	321407-1G
CM100 Transmission Electron Microscope	Philips
CombiFlash RF chromatography system	Teledyne ISCO
Dichloromethane	DUKSAN Pure Chemicals	JT9315-88
Dimethyl sulfoxide	DUKSAN Pure Chemicals	2762
Disposable cuvette	Malvern Panalytical	DTS1070	Zeta potential measurement
Disposable cuvette	Malvern Panalytical	ZEN0040
Empty Disposable Sample Load Cartridges	Teledyne ISCO	693873225	can hold up to 65 g
Fetal bovine serum	Gibco	10270106
Filtering flask	AS ONE	3-7089-03
Hexane	DUKSAN Pure Chemicals	4198
Holey carbon film on copper grid	Beijing Zhongjingkeyi Technology Co.,Ltd	BZ10023a
HPLC column (InfinityLab Poroshell 120)	Agilent Technologies	695975-902T
Integrating sphere photodiode power sensor	Thorlabs	S142C
IR783	Tokyo Chemical Industry (TCI) Co., Ltd	I1031
LED	Mightex	LCS-0530-15-11
LED Driver Control Panel V3.2.0 (Software)	Mightex
Lithium Hydroxide Anhydrous	TCI	L0225
Methylmagnesium iodide, 3M solution in diethyl ether	Aladdin	M140783
N,N-Diisopropyl ethyl amine (DIPEA)	J&K Scientific	203402
N,N'-Dicyclohexylcarbodiimide (DCC)	J&K Scientific	275928
penicillin–streptomycin	Gibco	15140122
Phosphate-buffered saline (10×)	Sigma-Aldrich	P5493
Power and energy meter	Thorlabs	PM100 USB
Rotavapor	BUCHI Rotavapor R300
RMPI 1640	Gibco	21870076
Separatory funnel (125 mL)	Synthware	F474125L
Silver Silica Gel Disposable Flash Columns, 40 g	Teledyne ISCO	692203340
Sodium sulfate, anhydrous	Alfa Aesar	A19890
SpectraMax M4	Molecular Devices LLC
Tetrahydrofuran (THF), anhydrous	J&K Scientific	943616
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red	Gibco	25200056
Vortex	DLAB Scientific Co., Ltd	MX-S
Zetasizer Nano ZS90	Malvern Instrument