斑马鱼细胞系的细胞毒性测定

摘要

该协议介绍了常用的细胞毒性测定（阿拉马尔蓝 [AB]、CFDA-AM、中性红和 MTT 测定），适用于评估斑马鱼胚胎 （ZEM2S） 和肝脏 （ZFL） 细胞系的细胞毒性 96 孔板。

摘要

鱼细胞系越来越多地用于生态毒性研究，细胞毒性测定已被提出作为预测鱼类急性毒性的方法。因此，该协议提出了修改的细胞毒性测定，以评估斑马鱼（Danio rerio）胚胎（ZEM2S）和肝脏（ZFL）细胞系中的细胞活力，该板在96孔板中。评估的细胞毒性终点是线粒体完整性（Alamar Blue [AB] 和 MTT 测定）、通过酯酶活性 的 膜完整性（CFDA-AM 测定）和溶酶体膜完整性（中性红 [NR] 测定）。在96孔板中暴露测试物质后，进行细胞毒性测定;在这里，AB和CFDA-AM同时进行，然后在同一板上进行NR，而MTT测定在单独的板上进行。这些测定的读数通过AB和CFDA-AM的荧光以及MTT和NR的吸光度获取。用这些鱼细胞系进行的细胞毒性测定可用于研究化学物质对鱼的急性毒性。

引言

需要对化学物质进行人体健康和环境安全性测试。监管机构和/或立法（例如，REACH、OECD、US EPA）在安全性评估中越来越多地考虑分子和细胞生物标志物来预测对生物体的影响1，²，因为它们可以先于体内不良结果（例如，内分泌干扰、免疫反应、急性毒性、光^毒性）3，⁴，⁵，^6，7.在这种情况下，细胞毒性已被作为预测鱼类急性毒性的测量方法^5，8;然而，它可以在生态毒性研究中有许多其他应用，例如定义化学物质的亚细胞毒性浓度，以研究它们对鱼类最多样化的影响（例如，内分泌干扰效应）。

在细胞培养系统（体外 系统）中，化学物质的细胞毒性可以通过终点类型的不同方法确定。例如，一种细胞毒性方法可以基于与细胞死亡过程中观察到的特定形态相关的终点，而另一种方法可以通过测量细胞死亡、活力和功能、形态、能量代谢以及细胞附着和增殖来确定细胞毒性。化学物质可以通过不同的机制影响细胞活力，因此覆盖不同细胞活力终点的细胞毒性评估对于预测化学效应是必要的⁹。

MTT和Alamar Blue（AB）是根据细胞代谢活性确定对细胞活力影响的测定。MTT测定评估线粒体酶琥珀酸脱氢酶¹⁰的活性。淡黄色的3-[4，5-二甲基噻唑-2基]-2，5-二苯基四唑溴化物（MTT）还原为甲臜蓝仅发生在活细胞中，其光密度与活细胞的数量成正比¹⁰。AB测定是一种灵敏的氧化还原指示剂，由线粒体酶介导，线粒体酶在活细胞将刃天青还原为试卤灵时发出荧光并改变颜色¹¹;然而，胞质和微粒体酶也有助于减少AB和MTT¹²。这些酶可能包括几种还原酶，例如醇和醛氧化还原酶、NAD（P）H:醌氧化还原酶、黄素还原酶、NADH脱氢酶和细胞色素¹¹。

中性红（NR）测定是基于将该染料掺入活细胞的溶酶体中的细胞活力测定¹³。NR的摄取取决于细胞维持pH梯度的能力。溶酶体内的质子梯度保持低于细胞质的pH值。在正常的生理pH值下，NR呈现的净电荷约为零，这使其能够穿透细胞膜。因此，染料带电并保留在溶酶体内。因此，保留NR的量越大，活细胞的数量就越多¹⁴。破坏细胞表面或溶酶体膜的化学物质会损害这种染料的摄取。

CFDA-AM测定是基于保留5-羧基荧光素二乙酸乙酰氧基甲酯（CFDA-AM）的荧光细胞活力测定¹⁵。5-CFDA-AM是一种酯酶底物，被转化为羧基荧光素，羧基荧光素是一种极性且不可被活细胞膜渗透的荧光物质¹⁵;因此，它保留在完整细胞膜的内侧，表明活细胞。

最近，三种细胞毒性测定（CFDA-AM、NR 和 AB 测定）在经过验证的 ISO（国际标准化组织）指南 （ISO 21115:2019）¹⁶ 和 OECD（经济合作与发展组织）测试方法 （OECD TG 249） 中合并，以使用 RTgill-W1 细胞系（虹鳟鱼 [Oncorhynchus mykiss] 鳃的永久性细胞系）在 24 孔板中评估鱼类急性毒性¹⁷.虽然有一种现有的基于细胞的方法来预测鱼类的急性毒性，但已经投入了努力开发与其他鱼类物种类似的方法，并提高该方法的通量。一些例子包括用特定毒性途径¹⁸，¹⁹的报告基因转染的ZFL细胞系的开发^，RTgill-W1细胞系²⁰中的光毒性测试，以及使用ZFL和ZF4细胞系（来自1天龄胚胎的斑马鱼成纤维细胞）通过几种细胞毒性测定来评估毒性²¹。

Danio rerio（斑马鱼）是水生毒性研究中使用的主要鱼类之一;因此，使用斑马鱼细胞系进行基于细胞的鱼类毒性测试方法可能非常有用。ZFL细胞系是一种斑马鱼上皮肝细胞系，具有肝实质细胞的主要特征，可代谢异生素⁷，22，^23，24，25。同时，ZEM2S细胞系是源自胚泡阶段的胚胎斑马鱼成纤维细胞系，可用于研究对鱼类^26，27的发育影响。因此，该协议描述了四种细胞毒性测定（MTT，AB，NR和CFDA-AM测定），并在96孔板中使用ZFL和ZEM2S细胞系进行修饰。

研究方案

注意:有关本协议中使用的材料列表，请参阅 材料 表，有关本协议中使用的溶液和介质的组成，请参阅 表1 。

1. 制备ZFL和ZEM2S细胞

1. 从具有80%汇合度的ZFL或ZEM2S细胞的T75烧瓶开始，在28°C的相应完全培养基中培养，不含CO₂。
2. 从烧瓶中取出培养基，并通过加入 10 mL 1x 磷酸盐缓冲盐水 （PBS） （0.01 M） 洗涤细胞。向培养瓶中加入 3 mL 1x 胰蛋白酶（0.05% v/v;0.5 mM 胰蛋白酶-EDTA）。在28°C孵育3分钟。
3. 轻轻敲击烧瓶以释放细胞，然后通过向烧瓶中加入 3 mL 完全培养基来停止胰蛋白酶消化。
4. 将细胞悬液转移到 15 mL 锥形离心管中，并以 100 × g 离心 5 分钟。
5. 离心后，小心地除去上清液，加入1mL完全培养基用于ZFL或ZEM2S细胞，并使用微量移液器重悬沉淀。

2. 台盼蓝染料排阻细胞计数

1. 向微管中加入 10 μL 细胞悬液和 10 μL 台盼蓝染料，以计数细胞并评估其活力。使用移液管混合细胞悬液和染料。
2. 然后，将 10 μL 该混合物（细胞悬液 + 台盼蓝）转移到 Neubauer 腔室中，并计数放置在腔室角落的四个大方块（象限 Q）中的细胞，认为活细胞是不吸收台盼蓝的细胞。使用公式（1）确定活细胞的数量:
   （1）
3. 通过使用公式（1）确定的细胞数乘以2（由于使用台盼蓝引起的稀释因子）来计算细胞悬液中的最终细胞数。
   注意:或者，可以使用自动细胞计数系统（例如， 具有细胞计数和活力功能的细胞器）。

3. 96孔板中的细胞镀层

1. 计算获得进行细胞毒性测定所需的细胞数量所需的细胞悬浮体积。每个细胞系的活细胞数量如下所示:
   1. 每孔板60，000个活的 ZEM2S细胞 ;因此，对于整个板，在 20 mL 完全培养基（200 μL/孔，96 孔板）中使用 600 万个细胞。
   2. 每孔板40，000个活 的ZFL细胞 ;因此，对于整个板，在 20 mL 完全培养基（200 μL/孔，96 孔板）中使用 400 万个细胞。
2. 之后，将相应体积的细胞悬液转移到试剂储液器（无菌）中，并用ZFL或ZEM2S的完整培养基填充至20mL。使用多通道移液器，轻轻上下混合溶液。
   注意:注意不要形成泡沫或气泡。
3. 使用多通道微量移液器将 200 μL 细胞悬液添加到透明聚苯乙烯 96 孔板的每个孔中。将板在28°C孵育24小时。
   注意:板必须至少有三个没有空白对照池的孔，并且只应将完整的培养基添加到这些孔中。边缘效应（由边缘孔中的较高蒸发引起）通常发生在96孔板测定中，并且会影响板²⁸边缘孔中细胞的活力。这种效果可以更高或更低，具体取决于96孔板品牌和设计²⁸。虽然我们没有注意到边缘孔中ZFL和ZEM2S的任何细胞生长/活力干扰，但我们建议用封口膜或粘合剂密封箔密封板以防止这种影响，或者仅在60个内部孔中培养细胞并用PBS填充边缘孔。

4. 细胞暴露于测试化学品

1. 使用多通道微量移液器小心地从孔中丢弃用过的培养基。
2. 暴露细胞以测试不同浓度的化学物质。在没有胎牛血清（FBS）（暴露培养基）的情况下，为ZFL或ZEM2S制备培养基中测试化学浓度的溶液。然后，每孔加入 100 μL 这些溶液，一式三份（即三个孔/测试化学浓度）。
3. 对于对照，将对照组与测试化学品在同一板上，一式三份（三个孔/对照组）。因此，对于空白对照 （B），在无细胞孔中加入 100 μL 暴露培养基，对于阴性对照 （NC），向有细胞的孔中加入 100 μL 暴露培养基，对于阳性对照 （PC），将细胞暴露于暴露培养基中制备的 1% Triton X-100 溶液中。在某些情况下，应将溶剂对照（SC）包含在平板中，考虑明确无细胞毒性的浓度作为最终溶剂浓度。
   注意:建议使用0.5%DMSO作为溶剂;DMSO在这些细胞系中可用作高达1%的溶剂，而不会超过与阴性对照相关的10%的细胞毒性阈值。
4. 将板在28°C孵育24小时。用封口膜或粘合剂密封箔密封板，以防止培养基蒸发。
   注意:某些化学物质可能具有固有的背景吸光度或荧光，可能会干扰指示染料的吸光度或荧光（例如，具有颜色的化合物可能会影响吸光度，血清白蛋白²⁹和干扰还原酶的化合物^30，31）。在这种情况下，板必须包括一个额外的对照，方法是在没有细胞的孔中添加测试化学溶液。这是为了验证化学自动吸光度/自发荧光对染料的可能干扰。如果检测到干扰，应评估是否可以排除干扰，以获得正确的细胞毒性预测。

5. 细胞毒性测定

注意:根据 表1制备所有溶液。下面描述的所有步骤（图1）均在无菌条件下进行。不建议使用移液器丢弃暴露介质，因为化学处理后细胞很容易从孔中分离。

1. AB 和 CFDA-AM 检测
   1. 在测试化学品暴露24小时后，通过将内容物倒入收集盘中，小心地丢弃暴露介质。
   2. 用 200 μL PBS 清洗板。通过将PBS倒入收集托盘中来小心地将其取出，以避免丢失细胞。
   3. 每孔加入 100 μL AB/CFDA-AM 溶液。将板在28°C的黑暗中孵育30分钟。
   4. 在荧光板读数器中测量 AB 的 530 nm（激发）和 595 nm（发射）以及 CFDA-AM 的 493 nm（激发）和 541 nm（发射）的荧光。
2. NR 检测
   注意:NR测定的步骤在AB和CFDA-AM测定后立即进行（图1）。
   1. 将NR工作溶液（40μg/ mL）以600× g 离心10分钟。
      注意:管中NR的沉淀不得转移到板上。因此，在离心NR工作溶液后，使用移液管收集上清液而不吸出NR沉淀物。将上清液转移到试剂储液槽中。
   2. 通过将内容物倒入收集托盘中，小心地取出 AB/CFDA-AM 溶液。
   3. 使用多通道微量移液器每孔加入 100 μL NR 工作溶液。将板在28°C孵育3小时。
      注意:孵育3小时后，使用显微镜观察平板中是否发生NR沉淀。NR沉淀物可能会干扰细胞活力的定量，因此它们不应该存在。
   4. 通过将内容物倒入收集盘中，小心地取出NR溶液。通过每孔添加 150 μL PBS 来洗涤孔。
   5. 每孔加入 150 μL NR 提取溶液，并将板在摇床上孵育 10 分钟以轻轻摇动。在读板器中测量540nm处的吸光度。
      注意:应在690nm处进行第二次读数，以排除板中的任何背景指纹吸光度。
3. MTT 测定
   注意:MTT测定必须与上述测定分开进行（在新板中）（图2）。
   1. 通过将内容物倒入收集托盘中，小心地取出曝光介质。
   2. 使用多通道微量移液器每孔加入 100 μL MTT 工作溶液。将板在28°C孵育4小时。
   3. 通过将内容物倒入收集托盘来丢弃 MTT 溶液。
   4. 每孔加入 100 μL DMSO 以提取甲臜晶体，将板在平板振荡器上孵育 10 分钟。使用读板器测量570nm处的吸光度。
      注意:应在690nm处进行第二次读数，以排除板中的任何背景指纹吸光度。需要注意的是，测试化学品可能会干扰MTT，必须对其进行评估以确保生成数据的质量³²。为此，应暴露含有测试浓度和MTT（0.5mg / mL）的无细胞孔，然后孵育以观察孔中可能增加吸光度并导致假活力结果的任何颜色变化。在此测试中必须避免与MTT相互作用的化学物质。

6. 计算细胞活力/细胞毒性

注意:获得的原始吸光度或荧光用于计算与阴性对照（对于直接在暴露介质中制备的测试化学品）或溶剂对照（对于使用溶剂（例如DMSO）制备的测试化学品）相关的百分比。在确定细胞活力百分比之前，必须通过空白对照对原始数据进行归一化。

1. 计算每个测试化学浓度和对照组（三个孔/处理）的平均吸光度或荧光。
2. 要确定相对于对照（阴性或溶剂）的细胞活力百分比，请使用公式（2）:
   （二）
   注意:吸光度（abs）或荧光（fluo）单位表示每个浓度在三个孔中测量的吸光度或荧光的平均值;空白表示没有单元格的孔。

结果

图3显示了AB，CFDA-AM，NR和MTT测定的板。对于AB测定（图3A），空白孔和没有或减少活细胞数量的孔显示蓝色和低荧光，而具有大量活细胞的孔呈粉红色并呈现高荧光值，因为刃天青（AB）转化为试卤灵（粉红色物质）被活细胞。对于CFDA-AM测定，板上孔的颜色没有明显差异;然而，由于CFDA-AM的保留并随后转化为羧基荧光素（荧光物质），含有活细胞的孔中?...

讨论

细胞毒性测定广泛用于体外毒性评估，本协议文章介绍了四种常用的细胞毒性测定，修改后可在斑马鱼细胞系中进行（即，96孔板的细胞密度，MTT测定中的孵育时间，化学暴露条件下的FBS耗竭和SC的最大可接受浓度）。由于这些测定通过不同的细胞活力终点（代谢功能、溶酶体膜完整性和细胞膜完整性）量化细胞毒性，因此它们的组合提供了斑马鱼细胞系中化学细胞毒性的准确评估。该协议...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
5-CFDA, AM (5-Carboxyfluorescein Diacetate, Acetoxymethyl Ester)	Invitrogen	C1345
Cell culture plate, 96 well plate	Sarstedt	83.3924	Surface: Standard, flat base
DMEM	Gibco	12800-017	Powder, high glucose, pyruvate
FBS - Fetal Bovine Serum, qualified, USDA-approved regions	Gibco	12657-029
Ham's F-12 Nutrient Mix, powder	Gibco	21700026	Powder
HEPES (1 M)	Gibco	15630080
Leibovitz's L-15 Medium	Gibco	41300021	Powder
Neutral red	Sigma-Aldrich	N4638	Powder, BioReagent, suitable for cell culture
Orbital shaker	Warmnest	KLD-350-BI	22 mm rotation diameter
Dulbeccos PBS (10X) with calcium and magnesium	Invitrogen	14080055
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)	Gibco	15140122
Resazurin sodium salt	Sigma-Aldrich	R7017	Powder, BioReagent, suitable for cell culture
RPMI 1640 Medium	Gibco	31800-014	Powder
Sodium bicarbonate	Sigma-Aldrich	S5761	Powder,  bioreagent for molecular biology
Thiazolyl Blue Tetrazolium Bromide  98%	Sigma-Aldrich	M2128
Trypan blue stain (0.4%)	Gibco	15250-061
Trypsin-EDTA (0.5%), no phenol red	Gibco	15400054
ZEM2S cell line	ATCC	CRL-2147	This cell line was kindly donated by Professor Dr. Michael J. Carvan (University of Wisconsin, Milwaukee, USA)
ZFL cell line	BCRJ	256