Essais de cytotoxicité avec des lignées cellulaires de poisson zèbre

Résumé

Ce protocole présente des tests de cytotoxicité couramment utilisés (tests Alamar Blue [AB], CFDA-AM, Neutral Red et MTT) adaptés à l’évaluation de la cytotoxicité dans des lignées cellulaires d’embryons de poisson zèbre (ZEM2S) et de foie (ZFL) dans des plaques à 96 puits.

Résumé

Les lignées cellulaires de poissons sont de plus en plus utilisées dans les études d’écotoxicité, et des essais de cytotoxicité ont été proposés comme méthodes pour prédire la toxicité aiguë des poissons. Ainsi, ce protocole présente des tests de cytotoxicité modifiés pour évaluer la viabilité cellulaire dans des lignées cellulaires embryonnaires de poisson zèbre (Danio rerio) (ZEM2S) et de foie (ZFL) dans des plaques à 96 puits. Les paramètres de cytotoxicité évalués sont l’intégrité mitochondriale (tests Alamar Blue [AB] et MTT), l’intégrité de la membrane via l’activité estérase (test CFDA-AM) et l’intégrité de la membrane lysosomale (test rouge neutre [NR]). Après l’exposition des substances d’essai dans une plaque de 96 puits, les essais de cytotoxicité sont effectués; ici, AB et CFDA-AM sont effectués simultanément, suivis de NR sur la même plaque, tandis que le test MTT est effectué sur une plaque séparée. Les lectures de ces tests sont prises par fluorescence pour AB et CFDA-AM, et absorbance pour MTT et NR. Les essais de cytotoxicité effectués avec ces lignées cellulaires de poissons peuvent être utilisés pour étudier la toxicité aiguë des substances chimiques sur les poissons.

Introduction

Les substances chimiques doivent être testées en ce qui concerne leur sécurité pour la santé humaine et l’environnement. Les biomarqueurs moléculaires et cellulaires sont de plus en plus pris en compte dans les évaluations de l’innocuité pour prédire les effets sur les organismes vivants par les organismes de réglementation et/ou les lois (p. ex. REACH, OCDE, US EPA)^1,2, car ils peuvent précéder le résultat indésirable in vivo (p. ex. perturbation endocrinienne, réponse immunologique, toxicité aiguë, phototoxicité)3,4,5,6,7 . Dans ce contexte, la cytotoxicité a été prise comme mesure pour prédire la toxicité aiguë chez les poissons ^5,8; Cependant, il peut avoir de nombreuses autres applications dans les études d’écotoxicité, telles que la définition des concentrations sous-cytotoxiques de substances chimiques pour étudier leur ensemble le plus diversifié d’effets sur les poissons (par exemple, les effets perturbateurs endocriniens).

Dans les systèmes de culture cellulaire (systèmes in vitro ), la cytotoxicité des substances chimiques peut être déterminée par des méthodes différentes selon les types de paramètres. Par exemple, une méthode de cytotoxicité peut être basée sur un paramètre lié à la morphologie spécifique observée au cours du processus de mort cellulaire, tandis qu’une autre peut déterminer la cytotoxicité par la mesure de la mort, de la viabilité et de la fonctionnalité cellulaires, de la morphologie, du métabolisme énergétique et de la fixation et de la prolifération cellulaires. Les substances chimiques peuvent affecter la viabilité cellulaire par différents mécanismes, de sorte qu’une évaluation de la cytotoxicité couvrant différents paramètres de viabilité cellulaire est nécessaire pour prédire les effets chimiques⁹.

MTT et Alamar Blue (AB) sont des tests qui déterminent les effets sur la viabilité cellulaire en fonction de l’activité métabolique cellulaire. Le test MTT évalue l’activité de l’enzyme mitochondriale succinate déshydrogénase¹⁰. La réduction du bromure jaunâtre de 3-[4,5-diméthylthiazol-2yl]-2,5-diphényltétrazolium (MTT) en bleu de formazan ne se produit que dans les cellules viables, et sa densité optique est directement proportionnelle au nombre de cellules viables¹⁰. Le test AB est un indicateur sensible d’oxydoréduction médié par des enzymes mitochondriales qui deviennent fluorescentes et changent de couleur lors de la réduction de la résazurine en résorunine par les cellules vivantes¹¹; cependant, les enzymes cytosoliques et microsomiques contribuent également à la réduction de AB et MTT¹². Ces enzymes peuvent inclure plusieurs réductases, telles que l’alcool et l’aldéhyde oxydoréductases, la NAD(P)H: quinone oxydoréductase, la flavine réductase, la NADH déshydrogénase et les cytochromes¹¹.

Le test Neutral Red (NR) est un test de viabilité cellulaire basé sur l’incorporation de ce colorant dans les lysosomes de cellules viables¹³. L’absorption de NR dépend de la capacité des cellules à maintenir les gradients de pH. Le gradient de protons à l’intérieur des lysosomes maintient un pH inférieur à celui du cytoplasme. À pH physiologique normal, le NR présente une charge nette d’environ zéro, ce qui lui permet de pénétrer dans les membranes cellulaires. Ainsi, le colorant se charge et est retenu à l’intérieur des lysosomes. Par conséquent, plus la quantité de NR retenue est importante, plus le nombre de cellules viables¹⁴ est élevé. Les substances chimiques qui endommagent la surface cellulaire ou les membranes lysosomales nuisent à l’absorption de ce colorant.

Le test CFDA-AM est un test de viabilité cellulaire fluorométrique basé sur la rétention de l’ester d’acétoxyméthyle de diacétate de 5-carboxyfluorescéine (CFDA-AM)¹⁵. Le 5-CFDA-AM, un substrat d’estérase, est converti en carboxyfluorescéine, une substance fluorescente polaire et non perméable par les membranes des cellules vivantes¹⁵ ; Ainsi, il est retenu dans la face interne d’une membrane cellulaire intacte, indiquant des cellules viables.

Récemment, trois essais de cytotoxicité (essais CFDA-AM, NR et AB) ont été combinés dans une ligne directrice validée ISO (Organisation internationale de normalisation) (ISO 21115:2019)¹⁶ et une méthode d’essai de l’OCDE (OCDE TG 249) pour évaluer la toxicité aiguë des poissons à l’aide de la lignée cellulaire RTgill-W1 (lignée cellulaire permanente de truite arc-en-ciel [Oncorhynchus mykiss] branchie) dans des plaques à 24 puits¹⁷ . Bien qu’il existe une méthode cellulaire pour prédire la toxicité aiguë des poissons, des efforts ont été investis dans le développement de méthodes similaires avec d’autres espèces de poissons et l’augmentation du débit de la méthode. Quelques exemples incluent le développement de lignées cellulaires ZFL transfectées avec des gènes rapporteurs pour des voies de toxicité spécifiques^18,19, des tests de phototoxicité dans la lignée cellulaire RTgill-W1 20 et l’utilisation de lignées cellulaires ZFL et ZF4 (poisson zèbre fibroblastique dérivé d’embryons âgés de 1 jour) pour évaluer la toxicité par plusieurs tests de cytotoxicité²¹.

Danio rerio (poisson zèbre) est l’une des principales espèces de poissons utilisées dans les études de toxicité aquatique; Ainsi, les méthodes cellulaires avec des lignées cellulaires de poisson zèbre pour les tests de toxicité des poissons peuvent être extrêmement utiles. La lignée cellulaire ZFL est une lignée cellulaire hépatocytes épithéliales de poisson zèbre qui présente les principales caractéristiques des cellules parenchymateuses du foie et peut métaboliser les xénobiotiques 7,22,23,24,25. Pendant ce temps, la lignée cellulaire ZEM2S est une lignée cellulaire fibroblastique embryonnaire de poisson zèbre dérivée du stade blastula qui peut être utilisée pour étudier les effets sur le développement des poissons^26,27. Ainsi, ce protocole décrit quatre tests de cytotoxicité (tests MTT, AB, NR et CFDA-AM), avec des modifications à effectuer avec des lignées cellulaires ZFL et ZEM2S dans des plaques à 96 puits.

Protocole

REMARQUE : Voir le tableau des matériaux pour la liste des matériaux utilisés dans ce protocole et le tableau 1 pour la composition des solutions et des milieux utilisés dans ce protocole.

1. Préparation des cellules ZFL et ZEM2S

1. Commencer avec une fiole T75 de cellules ZFL ou ZEM2S avec 80% de confluence, cultivée dans le milieu complet respectif à 28 °C sans CO₂.
2. Retirer le milieu de culture de la fiole et laver les cellules en ajoutant 10 mL de 1x solution saline tamponnée au phosphate (PBS) (0,01 M). Ajouter 3 mL de 1x trypsine (0,05 % v/v; 0,5 mM trypsine-EDTA) dans les fioles de culture. Incuber à 28 °C pendant 3 min.
3. Tapoter doucement la fiole pour libérer les cellules, puis arrêter la digestion de la trypsine en ajoutant 3 mL de milieu de culture complet dans la fiole.
4. Transférer la suspension cellulaire dans un tube à centrifuger conique de 15 ml et centrifuger à 100 × g pendant 5 min.
5. Après la centrifugation, retirer délicatement le surnageant, ajouter 1 mL de milieu complet pour les cellules ZFL ou ZEM2S et remettre la pastille en suspension à l’aide d’une micropipette.

2. Comptage des cellules par exclusion du colorant bleu trypan

1. Ajouter 10 μL de suspension cellulaire et 10 μL de colorant bleu de trypan à un microtube pour compter les cellules et évaluer leur viabilité. Mélanger la suspension cellulaire et le colorant à l’aide d’une pipette.
2. Ensuite, transférer 10 μL de ce mélange (suspension cellulaire + bleu de trypan) dans une chambre de Neubauer et compter les cellules dans les quatre grands carrés (quadrants Q) placés aux coins de la chambre, en considérant les cellules viables comme celles qui n’absorbent pas le bleu de trypan. Déterminer le nombre de cellules viables à l’aide de l’équation (1) :
   (1)
3. Calculer le nombre final de cellules dans la suspension cellulaire en multipliant le nombre de cellules déterminé à l’aide de l’équation (1) par deux (le facteur de dilution dû à l’utilisation du bleu de trypan).
   REMARQUE : Alternativement, un système automatisé de comptage cellulaire (par exemple, un cytomère avec fonction de comptage cellulaire et de viabilité) peut être utilisé.

3. Placage cellulaire dans des plaques de 96 puits

1. Calculer le volume de suspension cellulaire nécessaire pour obtenir le nombre de cellules nécessaires pour effectuer les essais de cytotoxicité. Le nombre de cellules viables pour chaque lignée cellulaire est indiqué ci-dessous:
   1. Plaquer 60 000 cellules ZEM2S viables par puits; ainsi, pour la plaque entière, utiliser six millions de cellules dans 20 mL de milieu complet (200 μL/puits, plaque de 96 puits).
   2. Plaque 40 000 cellules ZFL viables par puits; ainsi, pour la plaque entière, utiliser quatre millions de cellules dans 20 mL de milieu complet (200 μL/puits, plaque de 96 puits).
2. Après cela, transférez le volume respectif de la suspension cellulaire dans un réservoir de réactif (stérile) et remplissez avec le milieu de culture complet pour ZFL ou ZEM2S à 20 mL. À l’aide d’une pipette multicanal, mélanger doucement la solution de haut en bas.
   REMARQUE: Veillez à ne pas former de mousse ou de bulles.
3. Ajouter 200 μL de la suspension cellulaire à chaque puits d’une plaque transparente de polystyrène à 96 puits à l’aide de la micropipette multicanal. Incuber les plaques à 28 °C pendant 24 h.
   NOTE: La plaque doit avoir au moins trois puits sans cellules pour le contrôle de l’ébauche, et seul un média complet doit être ajouté à ces puits. L’effet de bord (causé par une évaporation plus élevée dans les puits de bord) se produit couramment dans les essais sur plaque de 96 puits et peut affecter la viabilité des cellules dans les puits de bord de la plaque²⁸. Cet effet peut être supérieur ou inférieur selon la marque et la conception de la plaque à 96 puits²⁸. Bien que nous n’ayons pas remarqué de perturbation de la croissance et de la viabilité des cellules pour ZFL et ZEM2S dans les puits de bord, nous suggérons de sceller la plaque avec du parafilm ou une feuille d’étanchéité adhésive pour éviter cet effet, ou de cultiver les cellules uniquement dans les 60 puits intérieurs et de remplir les puits de bord avec du PBS.

4. Exposition des cellules à la substance d’essai

1. Jetez soigneusement les milieux usés des puits à l’aide d’une micropipette multicanaux.
2. Exposer les cellules à tester des produits chimiques à différentes concentrations. Préparer les solutions des concentrations chimiques d’essai dans les milieux de culture pour ZFL ou ZEM2S sans sérum fœtal bovin (FBS) (milieux d’exposition). Ensuite, ajouter 100 μL par puits de ces solutions en triple technique (c.-à-d. concentration de trois puits/produit chimique d’essai).
3. Pour les témoins, placer les groupes témoins sur la même plaque que la substance d’essai en triple technique (trois puits/groupe témoin). Ainsi, pour le témoin blanc (B), ajouter 100 μL du milieu d’exposition dans les puits sans cellules, pour le témoin négatif (NC), ajouter 100 μL du milieu d’exposition dans des puits avec cellules, et pour le témoin positif (PC), exposer les cellules à une solution de Triton X-100 à 1% préparée dans le milieu d’exposition. Dans certains cas, un témoin de solvant (SC) doit être inclus dans la plaque, en considérant une concentration clairement non cytotoxique comme concentration finale de solvant.
   REMARQUE: Il est recommandé d’utiliser 0,5% de DMSO comme solvant; Le DMSO peut être utilisé jusqu’à 1% comme solvant dans ces lignées cellulaires sans dépasser le seuil de cytotoxicité de 10% lié au témoin négatif.
4. Incuber les plaques à 28 °C pendant 24 h. Scellez les plaques avec un parafilm ou une feuille d’étanchéité adhésive pour empêcher l’évaporation du milieu de culture.
   REMARQUE : Certains produits chimiques peuvent avoir une absorbance de fond intrinsèque ou une fluorescence qui peut interférer avec l’absorbance ou la fluorescence du ou des colorants indicateurs (p. ex., les composés colorés peuvent influencer l’absorbance, l’albumine sérique²⁹ et les composés interférant avec les enzymes de réduction^30,31). Dans ce cas, la plaque doit comporter un contrôle supplémentaire en ajoutant des solutions chimiques d’essai dans les puits sans cellules. Il s’agit de vérifier l’interférence possible de l’auto-absorbance/autofluorescence chimique avec les colorants. Si une interférence est détectée, il convient d’évaluer si elle peut être exclue pour obtenir une prédiction correcte de la cytotoxicité.

5. Essais de cytotoxicité

REMARQUE : Préparez toutes les solutions conformément au tableau 1. Toutes les étapes décrites ci-dessous (Figure 1) sont réalisées dans des conditions stériles. L’utilisation d’une pipette pour jeter le milieu d’exposition n’est pas recommandée, car les cellules peuvent facilement se détacher des puits après traitement chimique.

1. Tests AB et CFDA-AM
   1. Après 24 heures d’exposition au produit chimique d’essai, jeter soigneusement le milieu d’exposition en versant le contenu dans un bac de collecte.
   2. Lavez la plaque avec 200 μL de PBS. Retirez soigneusement le PBS en le versant dans un bac de collecte pour éviter de perdre des cellules.
   3. Ajouter 100 μL par puits de solution AB/CFDA-AM. Incuber la plaque pendant 30 min dans l’obscurité à 28 °C.
   4. Mesurer la fluorescence dans un lecteur de plaque de fluorescence à 530 nm (excitation) et 595 nm (émission) pour AB, et à 493 nm (excitation) et 541 nm (émission) pour CFDA-AM.
2. Essai NR
   REMARQUE : Les étapes du test NR sont effectuées immédiatement après les tests AB et CFDA-AM (Figure 1).
   1. Centrifuger la solution de travail NR (40 μg/mL) à 600 × g pendant 10 min.
      NOTE: La précipitation de NR dans le tube ne doit pas être transférée aux plaques. Ainsi, après centrifugation de la solution de travail NR, recueillir le surnageant à l’aide d’une pipette sans aspirer les précipités NR. Transférer le surnageant dans un réservoir de réactif.
   2. Retirez délicatement la solution AB/CFDA-AM en versant le contenu dans un bac de collecte.
   3. Ajouter 100 μL par puits de la solution de travail NR à l’aide d’une micropipette multicanal. Incuber la plaque à 28 °C pendant 3 h.
      NOTE: Après l’incubation de 3 heures, observez si des précipitations NR se sont produites dans les plaques à l’aide d’un microscope. Les précipités NR peuvent interférer avec la quantification de la viabilité cellulaire, ils ne doivent donc pas être présents.
   4. Retirez délicatement la solution NR en versant le contenu dans un bac de collecte. Lavez les puits en ajoutant 150 μL de PBS par puits.
   5. Ajouter 150 μL par puits de la solution d’extraction NR et incuber la plaque sur un agitateur à plaques pendant 10 min pour agiter doucement. Mesurer l’absorbance à 540 nm dans un lecteur de plaques.
      NOTA: Une deuxième lecture à 690 nm doit être effectuée pour exclure toute absorbance des empreintes digitales de fond dans la plaque.
3. Dosage MTT
   NOTE: Le test MTT doit être effectué séparément des tests décrits ci-dessus (dans une nouvelle plaque) (Figure 2).
   1. Retirez délicatement le milieu d’exposition en versant le contenu dans un bac de collecte.
   2. Ajouter 100 μL de solution de travail MTT par puits à l’aide d’une micropipette multicanal. Incuber la plaque à 28 °C pendant 4 h.
   3. Jetez la solution MTT en versant le contenu dans un bac de collecte.
   4. Ajouter 100 μL par puits de DMSO pour extraire les cristaux de formazan, en incubant la plaque sur un agitateur à plaques pendant 10 min. Mesurer l’absorbance à 570 nm à l’aide d’un lecteur de plaques.
      NOTA: Une deuxième lecture à 690 nm doit être effectuée pour exclure toute absorbance des empreintes digitales de fond dans la plaque. Il est important de noter que les produits chimiques d’essai peuvent interférer avec le MTT, qui doit être évalué pour assurer la qualité des données générées³². Pour cela, les puits acellulaires contenant les concentrations d’essai et le MTT (0,5 mg / mL) doivent être exposés, suivis d’une incubation pour observer tout changement de couleur dans les puits qui pourrait augmenter l’absorbance et conduire à de faux résultats de viabilité. Les produits chimiques qui interagissent avec le MTT doivent être évités dans ce test.

6. Calcul de la viabilité cellulaire/cytotoxicité

NOTA: L’absorbance brute ou la fluorescence acquise est utilisée pour calculer la viabilité cellulaire en pourcentage lié au témoin négatif (pour les produits chimiques d’essai préparés directement dans les milieux d’exposition) ou au contrôle du solvant (pour les produits chimiques d’essai préparés à l’aide de solvants, tels que le DMSO). Avant de déterminer le pourcentage de viabilité de la cellule, les données brutes doivent être normalisées par le contrôle vide.

1. Calculer l’absorbance ou la fluorescence moyenne pour chaque concentration de la substance d’essai et groupe témoin (trois puits/traitement).
2. Pour déterminer le pourcentage de viabilité cellulaire par rapport au témoin (négatif ou solvant), utilisez l’équation (2) :
   (2)
   NOTA : Les unités d’absorbance (abs) ou de fluorescence (fluo) représentent la moyenne d’absorbance ou de fluorescence mesurée dans les trois puits par concentration; Blank représente des puits sans cellules.

Résultats

La figure 3 montre les plaques des tests AB, CFDA-AM, NR et MTT. Pour le test AB (figure 3A), les puits blancs et les puits sans cellules viables ou avec un nombre réduit de cellules viables présentent une couleur bleue et une faible fluorescence, tandis que les puits avec un nombre élevé de cellules viables sont rosâtres et présentent des valeurs de fluorescence élevées en raison de la transformation de la résazurine (AB) en résorunine (substance ros?...

Discussion

Les essais de cytotoxicité sont largement utilisés pour l’évaluation de la toxicité in vitro, et cet article de protocole présente quatre tests de cytotoxicité couramment utilisés modifiés pour être effectués dans des lignées cellulaires de poisson zèbre (c.-à-d. densité cellulaire pour la plaque de 96 puits, temps d’incubation dans le test MTT, déplétion FBS pendant les conditions d’exposition chimique et concentration maximale acceptable pour le SC). Comme ces tests quantifient la cytotox...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
5-CFDA, AM (5-Carboxyfluorescein Diacetate, Acetoxymethyl Ester)	Invitrogen	C1345
Cell culture plate, 96 well plate	Sarstedt	83.3924	Surface: Standard, flat base
DMEM	Gibco	12800-017	Powder, high glucose, pyruvate
Ham's F-12 Nutrient Mix, powder	Gibco	21700026	Powder
HEPES (1 M)	Gibco	15630080
Leibovitz's L-15 Medium	Gibco	41300021	Powder
Neutral red	Sigma-Aldrich	N4638	Powder, BioReagent, suitable for cell culture
Orbital shaker	Warmnest	KLD-350-BI	22 mm rotation diameter
Dulbeccos PBS (10X) with calcium and magnesium	Invitrogen	14080055
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)	Gibco	15140122
Resazurin sodium salt	Sigma-Aldrich	R7017	Powder, BioReagent, suitable for cell culture
RPMI 1640 Medium	Gibco	31800-014	Powder
SFB - Fetal Bovine Serum, qualified, USDA-approved regions	Gibco	12657-029
Sodium bicarbonate	Sigma-Aldrich	S5761	Powder,  bioreagent for molecular biology
Thiazolyl Blue Tetrazolium Bromide  98%	Sigma-Aldrich	M2128
Trypan blue stain (0.4%)	Gibco	15250-061
Trypsin-EDTA (0.5%), no phenol red	Gibco	15400054
ZEM2S cell line	ATCC	CRL-2147	This cell line was kindly donated by Professor Dr. Michael J. Carvan (University of Wisconsin, Milwaukee, USA)
ZFL cell line	BCRJ	256