Zytotoxizitäts-Assays mit Zebrafisch-Zelllinien

Zusammenfassung

Dieses Protokoll enthält häufig verwendete Zytotoxizitätstests (Alamar Blue [AB], CFDA-AM-, Neutral Red- und MTT-Assays), die für die Bewertung der Zytotoxizität in Zebrafischembryo- (ZEM2S) und Leberzelllinien (ZFL) in 96-Well-Platten geeignet sind.

Zusammenfassung

Fischzelllinien werden zunehmend in Ökotoxizitätsstudien verwendet, und Zytotoxizitätstests wurden als Methoden zur Vorhersage der akuten Toxizität von Fischen vorgeschlagen. Daher enthält dieses Protokoll Zytotoxizitätsassays, die modifiziert wurden, um die Zelllebensfähigkeit in Zebrafisch- (Danio rerio), Embryo- (ZEM2S) und Leber- (ZFL) Zelllinien in 96-Well-Platten zu bewerten. Die bewerteten Endpunkte der Zytotoxizität sind die mitochondriale Integrität (Alamar Blue [AB]- und MTT-Assays), die Membranintegrität über die Esteraseaktivität (CFDA-AM-Assay) und die lysosomale Membranintegrität (Neutral Red [NR]-Assay). Nach der Exposition der Testsubstanzen in einer 96-Well-Platte werden die Zytotoxizitätstests durchgeführt; Hier werden AB und CFDA-AM gleichzeitig durchgeführt, gefolgt von NR auf derselben Platte, während der MTT-Assay auf einer separaten Platte durchgeführt wird. Die Messwerte für diese Assays werden durch Fluoreszenz für AB und CFDA-AM und Absorption für MTT und NR ermittelt. Die mit diesen Fischzelllinien durchgeführten Zytotoxizitätstests können verwendet werden, um die akute Toxizität chemischer Substanzen an Fischen zu untersuchen.

Einleitung

Chemische Stoffe müssen auf ihre Sicherheit für die menschliche Gesundheit und die Umwelt geprüft werden. Molekulare und zelluläre Biomarker werden zunehmend in Sicherheitsbewertungen zur Vorhersage von Auswirkungen auf lebende Organismen durch Regulierungsbehörden und/oder Gesetzgebungen (z. B. REACH, OECD, US-EPA^)1,2 berücksichtigt, da sie dem unerwünschten In-vivo-Ergebnis (z. B. endokrine Störung, immunologische Reaktion, akute Toxizität, Phototoxizität^{) vorausgehen} können3,4,5,6,7 . In diesem Zusammenhang wurde die Zytotoxizität als Maß für die Vorhersage der akuten Toxizität von Fischen herangezogen ^5,8; Es kann jedoch viele andere Anwendungen in Ökotoxizitätsstudien haben, wie z. B. die Definition subzytotoxischer Konzentrationen chemischer Substanzen, um ihre unterschiedlichsten Auswirkungen auf Fische zu untersuchen (z. B. endokrine Disruptoren).

In Zellkultursystemen (In-vitro-Systemen ) kann die Zytotoxizität chemischer Substanzen durch Methoden bestimmt werden, die sich in der Art der Endpunkte unterscheiden. Zum Beispiel kann eine Zytotoxizitätsmethode auf einem Endpunkt basieren, der sich auf die spezifische Morphologie bezieht, die während des Zelltodprozesses beobachtet wird, während eine andere die Zytotoxizität durch Messung des Zelltods, der Lebensfähigkeit und Funktionalität, der Morphologie, des Energiestoffwechsels sowie der Zellanhaftung und -proliferation bestimmen kann. Chemische Substanzen können die Zelllebensfähigkeit durch verschiedene Mechanismen beeinflussen, daher ist eine Bewertung der Zytotoxizität erforderlich, die verschiedene Endpunkte der Zelllebensfähigkeit abdeckt, um chemische Wirkungen vorherzusagen⁹.

MTT und Alamar Blue (AB) sind Assays, die die Auswirkungen auf die Zelllebensfähigkeit auf der Grundlage der Zellstoffwechselaktivität bestimmen. Der MTT-Assay bewertet die Aktivität des mitochondrialen Enzyms Succinat-Dehydrogenase¹⁰. Die Reduktion von gelblichem 3-[4,5-Dimethylthiazol-2yl]-2,5-diphenyltetrazoliumbromid (MTT) zu Formazanblau tritt nur in lebensfähigen Zellen auf, und seine optische Dichte ist direkt proportional zur Anzahl lebensfähiger Zellen¹⁰. Der AB-Assay ist ein empfindlicher Oxidations-Reduktions-Indikator, der durch mitochondriale Enzyme vermittelt wird, die fluoreszieren und ihre Farbe ändern, wenn Resazurin von lebenden Zellen zu Resorufin reduziert^{wird 11}; aber auch zytosolische und mikrosomale Enzyme tragen zur Reduktion von AB und MTT¹² bei. Diese Enzyme können mehrere Reduktasen umfassen, wie z. B. Alkohol- und Aldehydoxidoreduktasen, NAD(P)H: Chinonoxidoreduktase, Flavinreduktase, NADH-Dehydrogenase und Cytochrome¹¹.

Der Neutral Red (NR)-Assay ist ein Zellviabilitätstest, der auf dem Einbau dieses Farbstoffs in die Lysosomen lebensfähiger Zellen^{basiert 13}. Die Aufnahme von NR hängt von der Fähigkeit der Zellen ab, pH-Gradienten aufrechtzuerhalten. Der Protonengradient innerhalb der Lysosomen hält einen niedrigeren pH-Wert als das Zytoplasma aufrecht. Bei normalem physiologischen pH-Wert weist der NR eine Nettoladung von ungefähr Null auf, wodurch er die Zellmembranen durchdringen kann. Somit wird der Farbstoff geladen und bleibt in den Lysosomen zurück. Folglich ist die Anzahl der lebensfähigen Zellen¹⁴ umso größer, je größer die Menge an zurückgehaltenem NR ist. Chemische Substanzen, die die Zelloberfläche oder die lysosomalen Membranen schädigen, beeinträchtigen die Aufnahme dieses Farbstoffs.

Der CFDA-AM-Assay ist ein fluorometrischer Zellviabilitätstest, der auf der Retention von 5-Carboxyfluorescein-Diacetat-Acetoxymethylester (CFDA-AM)¹⁵ basiert. 5-CFDA-AM, ein Esterasesubstrat, wird in Carboxyfluorescein umgewandelt, eine fluoreszierende Substanz, die polar und durch Membranen lebender Zellen nicht durchlässig ist¹⁵; Somit wird es in der Innenseite einer intakten Zellmembran zurückgehalten, was auf lebensfähige Zellen hinweist.

Kürzlich wurden drei Zytotoxizitätstests (CFDA-AM-, NR- und AB-Assays) in einer validierten ISO-Richtlinie (International Organization for Standardization) (ISO 21115:2019)¹⁶ und einer OECD-Testmethode (OECD TG 249) kombiniert, um die akute Toxizität von Fischen unter Verwendung der RTgill-W1-Zelllinie (permanente Zelllinie aus der Kieme der Regenbogenforelle [Oncorhynchus mykiss]) in 24-Well-Platten^{zu bewerten 17} . Obwohl es eine bestehende zellbasierte Methode zur Vorhersage der akuten Toxizität von Fischen gibt, wurden Anstrengungen unternommen, um ähnliche Methoden mit anderen Fischarten zu entwickeln und den Durchsatz der Methode zu erhöhen. Einige Beispiele umfassen die Entwicklung von ZFL-Zelllinien, die mit Reportergenen für spezifische Toxizitätswege^18,19 transfiziert wurden^, Phototoxizitätstests in der RTgill-W1-Zelllinie 20 und die Verwendung von ZFL- und ZF4-Zelllinien (Zebrafisch-Fibroblasten, die aus 1 Tag alten Embryonen gewonnen wurden) zur Bewertung der Toxizität durch mehrere Zytotoxizitätstests²¹.

Danio rerio (Zebrafisch) ist eine der wichtigsten Fischarten, die in aquatischen Toxizitätsstudien verwendet werden. Daher können zellbasierte Methoden mit Zebrafisch-Zelllinien für die Toxizitätsprüfung von Fischen äußerst nützlich sein. Die ZFL-Zelllinie ist eine zebrafischepitheliale Hepatozytenzelllinie, die die Hauptmerkmale von Leberparenchymzellen aufweist und Xenobiotika 7,22,23,24,25 metabolisieren kann. Inzwischen ist die ZEM2S-Zelllinie eine embryonale Zebrafisch-Fibroblasten-Zelllinie, die aus dem Blastula-Stadium stammt und zur Untersuchung von Entwicklungseffekten auf Fische verwendet werden kann^26,27. Daher beschreibt dieses Protokoll vier Zytotoxizitäts-Assays (MTT-, AB-, NR- und CFDA-AM-Assays), deren Modifikationen mit ZFL- und ZEM2S-Zelllinien in 96-Well-Platten durchgeführt werden müssen.

Protokoll

ANMERKUNG: In der Materialtabelle finden Sie die Liste der in diesem Protokoll verwendeten Materialien und in Tabelle 1 die Zusammensetzung der in diesem Protokoll verwendeten Lösungen und Medien.

1. Vorbereitung von ZFL- und ZEM2S-Zellen

1. Beginnen Sie mit einem T75-Kolben aus ZFL- oder ZEM2S-Zellen mit 80% Konfluenz, kultiviert im jeweiligen vollständigen Medium bei 28 °C ohne CO₂.
2. Nehmen Sie das Nährmedium aus dem Kolben und waschen Sie die Zellen unter Zugabe von 10 ml 1x phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) (0,01 M). 3 ml 1x Trypsin (0,05% v/v; 0,5 mM Trypsin-EDTA) in die Kulturkolben geben. Bei 28 °C 3 min inkubieren.
3. Klopfen Sie vorsichtig auf den Kolben, um die Zellen freizusetzen, und stoppen Sie dann die Trypsinverdauung, indem Sie 3 ml vollständiges Nährmedium in den Kolben geben.
4. Die Zellsuspension wird in ein konisches 15-ml-Zentrifugenröhrchen überführt und 5 Minuten lang bei 100 × g zentrifugiert.
5. Entfernen Sie nach der Zentrifugation vorsichtig den Überstand, fügen Sie 1 ml vollständiges Medium für ZFL- oder ZEM2S-Zellen hinzu und resuspendieren Sie das Pellet mit einer Mikropipette.

2. Zellzählung durch Ausschluss von Trypanblau

1. Geben Sie 10 μl der Zellsuspension und 10 μl Trypanblau-Farbstoff in ein Mikroröhrchen, um die Zellen zu zählen und ihre Lebensfähigkeit zu bewerten. Mischen Sie die Zellsuspension und färben Sie sie mit einer Pipette.
2. Übertragen Sie dann 10 μl dieser Mischung (Zellsuspension + Trypanblau) in eine Neubauer-Kammer und zählen Sie die Zellen in den vier großen Quadraten (Quadranten Q), die an den Ecken der Kammer platziert sind, wobei lebensfähige Zellen als solche betrachtet werden, die kein Trypanblau aufnehmen. Bestimmen Sie die Anzahl der lebensfähigen Zellen mit Gleichung (1):
   Bewertungen (1)
3. Berechnen Sie die endgültige Zellzahl in der Zellsuspension, indem Sie die mit Gleichung (1) ermittelte Zellzahl mit zwei multiplizieren (der Verdünnungsfaktor aufgrund der Verwendung von Trypanblau).
   HINWEIS: Alternativ kann ein automatisiertes Zellzählsystem (z. B. ein Zytomer mit Zellzähl- und Viabilitätsfunktion) verwendet werden.

3. Zellplattierung in 96-Well-Platten

1. Berechnen Sie das Zellsuspensionsvolumen, das benötigt wird, um die Anzahl der Zellen zu erhalten, die zur Durchführung der Zytotoxizitätstests erforderlich sind. Die Anzahl der lebensfähigen Zellen für jede Zelllinie ist unten angegeben:
   1. Platte 60.000 lebensfähige ZEM2S-Zellen pro Well; Verwenden Sie daher für die gesamte Platte sechs Millionen Zellen in 20 ml vollständigem Medium (200 μl/Well, 96-Well-Platte).
   2. Platte 40.000 lebensfähige ZFL-Zellen pro Well; Verwenden Sie daher für die gesamte Platte vier Millionen Zellen in 20 ml vollständigem Medium (200 μl/Well, 96-Well-Platte).
2. Danach wird das jeweilige Volumen der Zellsuspension in ein Reagenzreservoir (steril) überführt und mit dem kompletten Nährmedium für ZFL oder ZEM2S auf 20 ml aufgefüllt. Mischen Sie die Lösung mit einer Mehrkanalpipette vorsichtig auf und ab.
   HINWEIS: Achten Sie darauf, keinen Schaum oder Blasen zu bilden.
3. Geben Sie 200 μl der Zellsuspension mit der Mehrkanal-Mikropipette in jede Vertiefung einer transparenten Polystyrol-96-Well-Platte. Die Platten werden 24 h lang bei 28 °C inkubiert.
   HINWEIS: Die Platte muss mindestens drei Vertiefungen ohne Zellen für die Blindkontrolle aufweisen, und diesen Vertiefungen sollten nur vollständige Medien zugesetzt werden. Der Randeffekt (verursacht durch eine höhere Verdunstung in den Randvertiefungen) tritt häufig bei 96-Well-Plattenassays auf und kann die Lebensfähigkeit der Zellen in den Randvertiefungen der Platte²⁸ beeinträchtigen. Dieser Effekt kann je nach Marke und Design der 96-Well-Platte höher oder niedriger sein²⁸. Obwohl wir in den Randvertiefungen keine Störung des Zellwachstums/der Lebensfähigkeit von ZFL und ZEM2S festgestellt haben, empfehlen wir, die Platte mit Parafilm oder Klebesiegelfolie zu versiegeln, um diesen Effekt zu verhindern, oder die Zellen nur in den 60 Innenvertiefungen zu kultivieren und die Randvertiefungen mit PBS zu füllen.

4. Exposition von Zellen gegenüber Prüfchemikalien

1. Entsorgen Sie das verbrauchte Medium vorsichtig mit einer Mehrkanal-Mikropipette aus den Vertiefungen.
2. Setzen Sie die Zellen Testchemikalien in unterschiedlichen Konzentrationen aus. Bereiten Sie die Lösungen der Prüfchemikalienkonzentrationen in den Nährmedien für ZFL oder ZEM2S ohne fötales Rinderserum (FBS) (Expositionsmedien) vor. Fügen Sie dann 100 μl dieser Lösungen pro Vertiefung in technischer Verdreifachung hinzu (d. h. drei Vertiefungen/Testchemikalienkonzentration).
3. Für Kontrollen werden die Kontrollgruppen in technischen Dreifachteilen (drei Vertiefungen/Kontrollgruppe) auf die gleiche Platte wie die Prüfchemikalie gelegt. So werden für die Blindkontrolle (B) 100 μl des Belichtungsmediums in die zellfreien Vertiefungen gegeben, für die Negativkontrolle (NC) 100 μl des Belichtungsmediums in Vertiefungen mit Zellen gegeben und für die Positivkontrolle (PC) die Zellen einer Lösung von 1% Triton X-100 ausgesetzt, die in den Belichtungsmedien hergestellt wurde. In einigen Fällen sollte eine Lösungsmittelkontrolle (SC) in die Platte aufgenommen werden, wobei eine eindeutig nicht-zytotoxische Konzentration als endgültige Lösungsmittelkonzentration berücksichtigt wird.
   HINWEIS: Es wird empfohlen, 0,5% DMSO als Lösungsmittel zu verwenden; DMSO kann in diesen Zelllinien bis zu 1% als Lösungsmittel verwendet werden, ohne die Zytotoxizitätsschwelle von 10% in Bezug auf die Negativkontrolle zu überschreiten.
4. Die Platten werden 24 h lang bei 28 °C inkubiert. Versiegeln Sie die Platten mit Parafilm oder selbstklebender Siegelfolie, um die Verdunstung des Nährmediums zu verhindern.
   ANMERKUNG: Bestimmte Chemikalien können eine intrinsische Hintergrundabsorption oder Fluoreszenz aufweisen, die die Absorption oder Fluoreszenz des/der Indikatorfarbstoff(e) beeinträchtigen kann (z. B. können Verbindungen mit Farbe die Absorption, das Serumalbumin²⁹ und Verbindungen, die die Reduktionsenzyme^{stören 30,31}). In diesem Fall muss die Platte eine zusätzliche Kontrolle enthalten, indem Testchemikalienlösungen in die Vertiefungen ohne Zellen gegeben werden. Damit soll die mögliche Interferenz der chemischen Autoabsorption/Autofluoreszenz mit den Farbstoffen überprüft werden. Wenn eine Interferenz festgestellt wird, sollte bewertet werden, ob sie ausgeschlossen werden kann, um eine korrekte Vorhersage der Zytotoxizität zu erhalten.

5. Zytotoxizitäts-Assays

HINWEIS: Bereiten Sie alle Lösungen gemäß Tabelle 1 vor. Alle unten beschriebenen Schritte (Abbildung 1) werden unter sterilen Bedingungen durchgeführt. Die Verwendung einer Pipette zum Verwerfen des Expositionsmediums wird nicht empfohlen, da sich die Zellen nach einer chemischen Behandlung leicht von den Vertiefungen lösen können.

1. AB- und CFDA-AM-Assays
   1. Entsorgen Sie das Expositionsmedium nach 24 Stunden Exposition gegenüber der Prüfchemikalie vorsichtig, indem Sie den Inhalt in eine Auffangschale gießen.
   2. Waschen Sie den Teller mit 200 μl PBS. Entfernen Sie das PBS vorsichtig, indem Sie es in eine Auffangschale gießen, um den Verlust von Zellen zu vermeiden.
   3. Fügen Sie 100 μl AB/CFDA-AM-Lösung pro Vertiefung hinzu. Inkubieren Sie die Platte 30 Minuten lang im Dunkeln bei 28 °C.
   4. Messen Sie die Fluoreszenz in einem Fluoreszenzplatten-Reader bei 530 nm (Anregung) und 595 nm (Emission) für AB und bei 493 nm (Anregung) und 541 nm (Emission) für CFDA-AM.
2. NR-Assay
   ANMERKUNG: Die Schritte für den NR-Assay werden unmittelbar nach den AB- und CFDA-AM-Assays durchgeführt (Abbildung 1).
   1. Zentrifugieren Sie die NR-Arbeitslösung (40 μg/ml) bei 600 × g für 10 min.
      HINWEIS: Die Ausfällung von NR im Röhrchen darf nicht auf die Platten übertragen werden. Sammeln Sie daher nach dem Zentrifugieren der NR-Arbeitslösung den Überstand mit einer Pipette, ohne die NR-Ausfällungen abzusaugen. Übertragen Sie den Überstand in ein Reagenzreservoir.
   2. Entfernen Sie die AB/CFDA-AM-Lösung vorsichtig, indem Sie den Inhalt in eine Auffangschale gießen.
   3. 100 μl der NR-Arbeitslösung pro Well mit einer Mehrkanal-Mikropipette zugeben. Die Platte wird 3 h bei 28 °C inkubiert.
      HINWEIS: Beobachten Sie nach der 3-stündigen Inkubation mit einem Mikroskop, ob in den Platten NR-Niederschlag aufgetreten ist. NR-Ausfällungen können die Quantifizierung der Zelllebensfähigkeit beeinträchtigen und sollten daher nicht vorhanden sein.
   4. Entfernen Sie die NR-Lösung vorsichtig, indem Sie den Inhalt in eine Auffangschale gießen. Waschen Sie die Vertiefungen, indem Sie 150 μl PBS pro Vertiefung hinzufügen.
   5. Fügen Sie 150 μl der NR-Extraktionslösung pro Vertiefung hinzu und inkubieren Sie die Platte 10 Minuten lang auf einem Tellerschüttler zum sanften Schütteln. Messen Sie die Absorption bei 540 nm in einem Plattenleser.
      HINWEIS: Eine zweite Anzeige bei 690 nm sollte durchgeführt werden, um eine Absorption von Fingerabdrücken im Hintergrund in der Platte auszuschließen.
3. MTT-Assay
   ANMERKUNG: Der MTT-Test muss getrennt von den oben beschriebenen Assays (in einer neuen Platte) durchgeführt werden (Abbildung 2).
   1. Entfernen Sie das Belichtungsmedium vorsichtig, indem Sie den Inhalt in ein Auffangfach gießen.
   2. 100 μl MTT-Arbeitslösung pro Well mit einer Mehrkanal-Mikropipette zugeben. Inkubieren Sie die Platte bei 28 °C für 4 h.
   3. Entsorgen Sie die MTT-Lösung, indem Sie den Inhalt in eine Auffangschale gießen.
   4. Fügen Sie 100 μl DMSO pro Vertiefung hinzu, um die Formazankristalle zu extrahieren, und inkubieren Sie die Platte 10 Minuten lang auf einem Tellerschüttler. Messen Sie die Absorption bei 570 nm mit einem Plattenleser.
      HINWEIS: Eine zweite Anzeige bei 690 nm sollte durchgeführt werden, um eine Absorption von Fingerabdrücken im Hintergrund in der Platte auszuschließen. Es ist wichtig zu beachten, dass Prüfchemikalien die MTT stören können, die bewertet werden muss, um die Qualität der erzeugten Daten^{zu gewährleisten 32}. Dazu sollten zellfreie Vertiefungen, die die Testkonzentrationen und MTT (0,5 mg/ml) enthalten, exponiert werden, gefolgt von einer Inkubation, um jede Farbveränderung in den Vertiefungen zu beobachten, die die Absorption erhöhen und zu falschen Viabilitätsergebnissen führen kann. Chemikalien, die mit MTT interagieren, müssen bei diesem Test vermieden werden.

6. Berechnung der Zelllebensfähigkeit/Zytotoxizität

ANMERKUNG: Die erfasste Rohabsorption oder -fluoreszenz wird verwendet, um die Zellviabilität als Prozentsatz in Bezug auf die Negativkontrolle (für Prüfchemikalien, die direkt in Expositionsmedien hergestellt werden) oder die Lösungsmittelkontrolle (für Prüfchemikalien, die mit Lösungsmitteln hergestellt werden, wie z. B. DMSO) zu berechnen. Vor dem Bestimmen des Prozentsatzes der Zellviabilität müssen die Rohdaten durch das leere Steuerelement normalisiert werden.

1. Berechnen Sie die durchschnittliche Absorption oder Fluoreszenz für jede Prüfchemikalienkonzentration und Kontrollgruppe (drei Vertiefungen/Behandlung).
2. Um den Prozentsatz der Zellviabilität relativ zur Kontrolle (negativ oder Lösungsmittel) zu bestimmen, verwenden Sie Gleichung (2):
   Bewertungen (2)
   ANMERKUNG: Die Einheiten Absorption (abs) oder Fluoreszenz (Fluo) stellen den Mittelwert der Absorption oder Fluoreszenz dar, der in den drei Vertiefungen pro Konzentration gemessen wird. blank steht für Vertiefungen ohne Zellen.

Ergebnisse

Abbildung 3 zeigt die Platten der AB-, CFDA-AM-, NR- und MTT-Assays. Für den AB-Assay (Abbildung 3A) zeigen die Blindvertiefungen und Vertiefungen ohne oder mit einer reduzierten Anzahl lebensfähiger Zellen eine blaue Farbe und eine geringe Fluoreszenz, während die Vertiefungen mit einer hohen Anzahl lebensfähiger Zellen rosa sind und aufgrund der Umwandlung von Resazurin (AB) in Resorufin (rosafarbene Substanz) durch die lebensfähigen Zellen hohe Fluoresze...

Diskussion

Zytotoxizitätstests werden häufig für die In-vitro-Toxizitätsbewertung verwendet, und in diesem Protokollartikel werden vier häufig verwendete Zytotoxizitätstests vorgestellt, die für die Durchführung in Zebrafischzelllinien modifiziert wurden (d. h. Zelldichte für 96-Well-Platten, Inkubationszeit im MTT-Assay, FBS-Erschöpfung während der chemischen Expositionsbedingungen und maximal akzeptable Konzentration für die SC). Da diese Assays die Zytotoxizität anhand verschiedener Endpunkte der Zellleben...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
5-CFDA, AM (5-Carboxyfluorescein Diacetate, Acetoxymethyl Ester)	Invitrogen	C1345
Cell culture plate, 96 well plate	Sarstedt	83.3924	Surface: Standard, flat base
DMEM	Gibco	12800-017	Powder, high glucose, pyruvate
Ham's F-12 Nutrient Mix, powder	Gibco	21700026	Powder
HEPES (1 M)	Gibco	15630080
Leibovitz's L-15 Medium	Gibco	41300021	Powder
Neutral red	Sigma-Aldrich	N4638	Powder, BioReagent, suitable for cell culture
Orbital shaker	Warmnest	KLD-350-BI	22 mm rotation diameter
Dulbeccos PBS (10X) with calcium and magnesium	Invitrogen	14080055
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)	Gibco	15140122
Resazurin sodium salt	Sigma-Aldrich	R7017	Powder, BioReagent, suitable for cell culture
RPMI 1640 Medium	Gibco	31800-014	Powder
SFB - Fetal Bovine Serum, qualified, USDA-approved regions	Gibco	12657-029
Sodium bicarbonate	Sigma-Aldrich	S5761	Powder,  bioreagent for molecular biology
Thiazolyl Blue Tetrazolium Bromide  98%	Sigma-Aldrich	M2128
Trypan blue stain (0.4%)	Gibco	15250-061
Trypsin-EDTA (0.5%), no phenol red	Gibco	15400054
ZEM2S cell line	ATCC	CRL-2147	This cell line was kindly donated by Professor Dr. Michael J. Carvan (University of Wisconsin, Milwaukee, USA)
ZFL cell line	BCRJ	256