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Resumo

Este protocolo apresenta ensaios de citotoxicidade comumente utilizados (ensaios de Alamar Blue [AB], CFDA-AM, Neutral Red e MTT) adaptados para a avaliação da citotoxicidade em linhagens celulares de embrião de peixe-zebra (ZEM2S) e fígado (ZFL) em placas de 96 poços.

Resumo

As linhagens celulares de peixes têm se tornado cada vez mais utilizadas em estudos de ecotoxicidade, e ensaios de citotoxicidade têm sido propostos como métodos para prever a toxicidade aguda de peixes. Assim, este protocolo apresenta ensaios de citotoxicidade modificados para avaliar a viabilidade celular em linhagens celulares de peixe-zebra (Danio rerio) embrionário (ZEM2S) e fígado (ZFL) em placas de 96 poços. Os desfechos de citotoxicidade avaliados são a integridade mitocondrial (ensaios de Alamar Blue [AB] e MTT), a integridade da membrana via atividade da esterase (ensaio CFDA-AM) e a integridade da membrana lisossômica (ensaio Vermelho Neutro [NR]). Após a exposição das substâncias em estudo numa placa de 96 poços, são realizados os ensaios de citotoxicidade; aqui, AB e CFDA-AM são realizados simultaneamente, seguidos de NR na mesma placa, enquanto o ensaio MTT é realizado em uma placa separada. As leituras para esses ensaios são tomadas por fluorescência para AB e CFDA-AM, e absorbância para MTT e NR. Os ensaios de citotoxicidade realizados com estas linhagens celulares de peixes podem ser utilizados para estudar a toxicidade aguda de substâncias químicas em peixes.

Introdução

As substâncias químicas têm de ser testadas quanto à sua segurança para a saúde humana e para o ambiente. Biomarcadores moleculares e celulares têm sido cada vez mais considerados em avaliações de segurança para predizer efeitos em organismos vivos por agências reguladoras e/ou legislações (por exemplo, REACH, OCDE, EUA EPA)1,2, uma vez que podem preceder o desfecho adverso in vivo (por exemplo, desregulação endócrina, resposta imunológica, toxicidade aguda, fototoxicidade)3,4,5,6,7 . Nesse contexto, a citotoxicidade tem sido tomada como medida para predizer a toxicidade aguda dos peixes 5,8; no entanto, pode ter muitas outras aplicações em estudos de ecotoxicidade, como a definição de concentrações subcitotóxicas de substâncias químicas para estudar seu conjunto mais diversificado de efeitos em peixes (por exemplo, efeitos desreguladores endócrinos).

Em sistemas de cultura celular (sistemas in vitro ), a citotoxicidade de substâncias químicas pode ser determinada por métodos diferentes nos tipos de parâmetros. Por exemplo, um método de citotoxicidade pode ser baseado em um desfecho relacionado à morfologia específica observada durante o processo de morte celular, enquanto outro pode determinar a citotoxicidade pela medição da morte celular, viabilidade e funcionalidade, morfologia, metabolismo energético e fixação e proliferação celular. As substâncias químicas podem afetar a viabilidade celular por meio de diferentes mecanismos, portanto, a avaliação da citotoxicidade abrangendo diferentes desfechos de viabilidade celular é necessária para predizer os efeitos químicos9.

MTT e Alamar Blue (AB) são ensaios que determinam os efeitos sobre a viabilidade celular com base na atividade metabólica celular. O ensaio MTT avalia a atividade da enzima mitocondrial succinato desidrogenase10. A redução do brometo amarelado de 3-[4,5-dimetiltiazol-2il]-2,5-difeniltetrazólio (MTT) para o azul formazano ocorre apenas em células viáveis, e sua densidade óptica é diretamente proporcional ao número de células viáveis10. O ensaio AB é um indicador sensível de oxidação-redução, mediado por enzimas mitocondriais que fluorescem e mudam de cor ao reduzir a resazurina a resorufina por células vivas11; no entanto, enzimas citosólicas e microssômicas também contribuem para a redução de AB e MTT12. Essas enzimas podem incluir várias redutases, como álcool e aldeído oxidorredutases, NAD(P)H: quinona oxidorredutase, flavina redutase, NADH desidrogenase e citocromos11.

O ensaio de Vermelho Neutro (NR) é um ensaio de viabilidade celular baseado na incorporação desse corante nos lisossomos de células viáveis13. A absorção de NR depende da capacidade das células de manter gradientes de pH. O gradiente de prótons dentro dos lisossomos mantém um pH inferior ao citoplasma. Em pH fisiológico normal, o NR apresenta uma carga líquida de aproximadamente zero, o que lhe permite penetrar nas membranas celulares. Assim, o corante torna-se carregado e é retido dentro dos lisossomos. Consequentemente, quanto maior a quantidade de NR retido, maior o número de células viáveis14. Substâncias químicas que danificam a superfície celular ou membranas lisossômicas prejudicam a absorção desse corante.

O ensaio CFDA-AM é um ensaio de viabilidade celular fluorométrico baseado na retenção de éster acetato de acetato de 5-carboxifluoresceína acetoximetílico (CFDA-AM)15. A 5-CFDA-AM, substrato da esterase, é convertida em carboxifluoresceína, substância fluorescente polar e não permeável por membranas de células vivas15; assim, é retido no lado interno de uma membrana celular intacta, indicando células viáveis.

Recentemente, três ensaios de citotoxicidade (ensaios CFDA-AM, NR e AB) foram combinados em uma diretriz ISO (International Organization for Standardization) validada (ISO 21115:2019)16 e método de teste da OCDE (Organização para a Cooperação e Desenvolvimento Econômico) (OCDE TG 249) para avaliar a toxicidade aguda de peixes usando a linhagem celular RTgill-W1 (linhagem celular permanente da guelra da truta arco-íris [Oncorhynchus mykiss]) em placas de 24 poços17 . Embora exista um método baseado em células para prever a toxicidade aguda dos peixes, esforços têm sido investidos no desenvolvimento de métodos semelhantes com outras espécies de peixes e no aumento do rendimento do método. Alguns exemplos incluem o desenvolvimento de linhagens celulares ZFL transfectadas com genes repórteres para vias de toxicidade específicas18,19, testes de fototoxicidade na linhagem celular RTgill-W1 20 e o uso de linhagens celulares ZFL e ZF4 (fibroblásticos de peixe-zebra derivados de embriões de 1 dia de idade) para avaliar a toxicidade por vários ensaios de citotoxicidade21.

Danio rerio (peixe-zebra) é uma das principais espécies de peixes utilizadas em estudos de toxicidade aquática; assim, métodos baseados em células com linhagens celulares de peixe-zebra para testes de toxicidade de peixes podem ser extremamente úteis. A linhagem celular ZFL é uma linhagem celular epitelial de hepatócitos zebrafish que apresenta as principais características das células parenquimatosas hepáticas e pode metabolizar xenobióticos 7,22,23,24,25. Enquanto isso, a linhagem celular ZEM2S é uma linhagem celular fibroblástica embrionária de peixe-zebra derivada do estágio de blástula que pode ser usada para investigar os efeitos do desenvolvimento em peixes26,27. Assim, este protocolo descreve quatro ensaios de citotoxicidade (ensaios de MTT, AB, NR e CFDA-AM), com modificações a serem realizadas com linhagens celulares ZFL e ZEM2S em placas de 96 poços.

Protocolo

NOTA: Consulte a Tabela de Materiais para a lista de materiais utilizados neste protocolo e a Tabela 1 para a composição das soluções e meios utilizados neste protocolo.

1. Preparação das células ZFL e ZEM2S

  1. Comece por um balão T75 de células ZFL ou ZEM2S com 80% de confluência, cultivadas no respectivo meio completo a 28 °C sem CO2.
  2. Retirar o meio de cultura do balão e lavar as células adicionando 10 ml de solução salina tamponada com fosfato (PBS) 1x (0,01 M). Adicionar 3 mL de tripsina 1x (0,05% v/v; tripsina-EDTA 0,5 mM) aos frascos de cultura. Incubar a 28 °C durante 3 min.
  3. Bater suavemente no balão para libertar as células e, em seguida, parar a digestão da tripsina adicionando 3 ml de meio de cultura completo ao balão.
  4. Transfira a suspensão celular para um tubo de centrífuga cônico de 15 mL e centrífuga a 100 × g por 5 min.
  5. Após a centrifugação, remova cuidadosamente o sobrenadante, adicione 1 mL de meio completo para as células ZFL ou ZEM2S e ressuspenda o pellet usando uma micropipeta.

2. Contagem de células por exclusão de corante azul de tripano

  1. Adicionar 10 μL da suspensão celular e 10 μL de corante azul de tripano a um microtubo para contar as células e avaliar a sua viabilidade. Misture a suspensão celular e o corante usando uma pipeta.
  2. Em seguida, transfira 10 μL dessa mistura (suspensão celular + azul de tripano) para uma câmara de Neubauer e conte as células nos quatro grandes quadrados (Quadrantes Q) colocados nos cantos da câmara, considerando que as células viáveis são aquelas que não ocupam azul tripano. Determine o número de células viáveis usando a equação (1):
    figure-protocol-1876 (1)
  3. Calcular o número final de células na suspensão celular multiplicando o número de células determinado utilizando a equação (1) por dois (o factor de diluição devido à utilização de azul de tripano).
    NOTA: Alternativamente, um sistema automatizado de contagem de células (por exemplo, um citômero com função de contagem de células e viabilidade) pode ser usado.

3. Revestimento de células em placas de 96 poços

  1. Calcular o volume de suspensão celular necessário para obter o número de células necessárias para realizar os ensaios de citotoxicidade. O número de células viáveis para cada linhagem celular é indicado abaixo:
    1. Placa 60.000 células ZEM2S viáveis por poço; assim, para toda a placa, utilizar seis milhões de células em 20 mL de meio completo (200 μL/poço, placa de 96 poços).
    2. Placa 40.000 células ZFL viáveis por poço; assim, para toda a placa, utilizar quatro milhões de células em 20 mL de meio completo (200 μL/poço, placa de 96 poços).
  2. Depois disso, transferir o respectivo volume da suspensão celular para um reservatório reagente (estéril) e encher com o meio de cultura completo para ZFL ou ZEM2S até 20 mL. Usando uma pipeta multicanal, misture a solução suavemente para cima e para baixo.
    NOTA: Tome cuidado para não formar espuma ou bolhas.
  3. Adicionar 200 μL da suspensão celular a cada poço de uma placa transparente de poliestireno de 96 poços usando a micropipeta multicanal. Incubar as placas a 28 °C durante 24 h.
    NOTA: A placa deve ter pelo menos três poços sem células para o controle em branco, e apenas meios completos devem ser adicionados a esses poços. O efeito de borda (causado por maior evaporação nos poços de borda) geralmente ocorre em ensaios de placas de 96 poços e pode afetar a viabilidade das células nos poços de borda da placa28. Esse efeito pode ser maior ou menor, dependendo da marca e do design da placa de 96 poços28. Embora não tenhamos notado nenhum distúrbio de crescimento/viabilidade celular para ZFL e ZEM2S nos poços de borda, sugerimos selar a placa com parafilme ou folha de vedação adesiva para evitar esse efeito, ou cultivar as células apenas nos 60 poços internos e encher os poços de borda com PBS.

4. Exposição das células ao produto químico em estudo

  1. Descarte cuidadosamente a mídia gasta dos poços usando uma micropipeta multicanal.
  2. Expor as células a produtos químicos de teste em diferentes concentrações. Preparar as soluções das concentrações químicas em estudo nos meios de cultura para ZFL ou ZEM2S sem soro fetal bovino (FBS) (meio de exposição). Em seguida, adicione 100 μL por poço dessas soluções em triplicado técnico (ou seja, três poços/concentração química de teste).
  3. Para os controlos, colocar os grupos de controlo na mesma placa que o produto químico em estudo em triplicados técnicos (três alvéolos/grupo de controlo). Assim, para o controle em branco (B), adicione 100 μL do meio de exposição nos poços livres de células, para o controle negativo (NC), adicione 100 μL do meio de exposição aos poços com células e, para o controle positivo (PC), exponha as células a uma solução de 1% de Triton X-100 preparada no meio de exposição. Em alguns casos, um controle de solvente (SC) deve ser incluído na placa, considerando uma concentração claramente não citotóxica como uma concentração final de solvente.
    NOTA: Recomenda-se o uso de DMSO a 0,5% como solvente; O DMSO pode ser usado até 1% como solvente nessas linhagens celulares sem exceder o limiar de citotoxicidade de 10% relacionado ao controle negativo.
  4. Incubar as placas a 28 °C durante 24 h. Sele as placas com parafilme ou folha de vedação adesiva para evitar a evaporação do meio de cultura.
    NOTA: Certos produtos químicos podem ter absorvância de fundo intrínseca ou fluorescência que podem interferir com a absorvância ou fluorescência do(s) corante(s) indicador(es) (por exemplo, compostos com cor podem influenciar a absorvência, albumina sérica29 e compostos que interferem com enzimas de redução30,31). Neste caso, a placa deve incluir um controlo adicional, adicionando soluções químicas de ensaio nos poços sem células. Isto é para verificar a possível interferência da auto-absorvência/autofluorescência química com os corantes. Se a interferência for detectada, deve-se avaliar se ela pode ser excluída para obter uma previsão correta da citotoxicidade.

5. Ensaios de citotoxicidade

NOTA: Prepare todas as soluções de acordo com a Tabela 1. Todas as etapas descritas abaixo (Figura 1) são realizadas em condições estéreis. O uso de uma pipeta para descartar o meio de exposição não é recomendado, porque as células podem facilmente se desprender dos poços após o tratamento químico.

  1. Ensaios AB e CFDA-AM
    1. Após 24 h de exposição ao produto químico em estudo, deitar cuidadosamente fora o meio de exposição, despejando o conteúdo numa bandeja de recolha.
    2. Lave a placa com 200 μL de PBS. Remova cuidadosamente o PBS despejando-o em uma bandeja de coleta para evitar a perda de células.
    3. Adicionar 100 μL por poço de solução AB/CFDA-AM. Incubar a placa durante 30 min no escuro a 28 °C.
    4. Meça a fluorescência em um leitor de placas de fluorescência a 530 nm (excitação) e 595 nm (emissão) para AB, e a 493 nm (excitação) e 541 nm (emissão) para CFDA-AM.
  2. Ensaio NR
    NOTA: As etapas para o ensaio de NR são realizadas imediatamente após os ensaios AB e CFDA-AM (Figura 1).
    1. Centrifugar a solução de trabalho NR (40 μg/mL) a 600 × g por 10 min.
      NOTA: A precipitação de NR no tubo não deve ser transferida para as placas. Assim, após a centrifugação da solução de trabalho NR, coletar o sobrenadante usando uma pipeta sem aspirar os precipitados NR. Transfira o sobrenadante para um reservatório de reagente.
    2. Remova cuidadosamente a solução AB/CFDA-AM despejando o conteúdo em uma bandeja de coleta.
    3. Adicione 100 μL por poço da solução de trabalho NR usando uma micropipeta multicanal. Incubar a placa a 28 °C durante 3 h.
      NOTA: Após a incubação de 3 h, observe se ocorreu precipitação de NR nas placas utilizando um microscópio. Os precipitados NR podem interferir na quantificação da viabilidade celular, portanto, não devem estar presentes.
    4. Remova cuidadosamente a solução NR despejando o conteúdo em uma bandeja de coleta. Lave os poços adicionando 150 μL de PBS por poço.
    5. Adicionar 150 μL por poço da solução de extração NR e incubar a placa em um agitador de placas por 10 minutos para agitar suavemente. Medir a absorvância a 540 nm num leitor de placas.
      NOTA: Deve ser efectuada uma segunda leitura a 690 nm para excluir qualquer absorvância de impressões digitais de fundo na placa.
  3. Ensaio MTT
    NOTA: O ensaio MTT deve ser efectuado separadamente dos ensaios acima descritos (numa nova placa) (figura 2).
    1. Remova cuidadosamente a mídia de exposição despejando o conteúdo em uma bandeja de coleta.
    2. Adicione 100 μL de solução de trabalho MTT por poço usando uma micropipeta multicanal. Incubar a placa a 28 °C durante 4 h.
    3. Descarte a solução de MTT despejando o conteúdo em uma bandeja de coleta.
    4. Adicionar 100 μL por poço de DMSO para extrair os cristais formazan, incubando a placa em um agitador de placas por 10 min. Medir a absorvância a 570 nm utilizando um leitor de placas.
      NOTA: Deve ser efectuada uma segunda leitura a 690 nm para excluir qualquer absorvância de impressões digitais de fundo na placa. É importante ressaltar que os produtos químicos em estudo podem interferir no MTT, que deve ser avaliado para garantir a qualidade dos dados gerados32. Para isso, poços livres de células contendo as concentrações de teste e MTT (0,5 mg/mL) devem ser expostos, seguidos de incubação para observar qualquer mudança de cor nos poços que possa aumentar a absorvância e levar a falsos resultados de viabilidade. Os produtos químicos que interagem com o MTT devem ser evitados neste ensaio.

6. Cálculo da viabilidade/citotoxicidade celular

NOTA: A absorvância bruta ou a fluorescência adquirida é utilizada para calcular a viabilidade celular em percentagem relacionada com o controlo negativo (para produtos químicos de ensaio preparados directamente em meios de exposição) ou com o controlo de solventes (para produtos químicos de ensaio preparados com solventes, tais como DMSO). Antes de determinar a porcentagem de viabilidade da célula, os dados brutos devem ser normalizados pelo controle em branco.

  1. Calcular a absorvância ou fluorescência média para cada concentração química de ensaio e grupo de controlo (três alvéolos/tratamento).
  2. Para determinar a percentagem de viabilidade celular em relação ao controlo (negativo ou solvente), utilize a equação (2):
    figure-protocol-11473 (2)
    NOTA: As unidades de absorvância (abs) ou fluorescência (fluo) representam a média da absorbância ou fluorescência medida nos três poços por concentração; em branco representa poços sem células.

Resultados

A Figura 3 mostra as placas dos ensaios AB, CFDA-AM, NR e MTT. Para o ensaio AB (Figura 3A), os poços em branco e os poços com nenhum ou menor número de células viáveis apresentam coloração azul e baixa fluorescência, enquanto os poços com alto número de células viáveis são rosados e apresentam altos valores de fluorescência devido à transformação da resazurina (AB) em resorufina (substância rosada) pelas células viáveis. Para o ensaio CFDA-A...

Discussão

Os ensaios de citotoxicidade são amplamente utilizados para avaliação de toxicidade in vitro, e este artigo de protocolo apresenta quatro ensaios de citotoxicidade comumente utilizados modificados para serem realizados em linhagens celulares de peixe-zebra (ou seja, densidade celular para placa de 96 poços, tempo de incubação no ensaio MTT, depleção de FBS durante a condição de exposição química e concentração máxima aceitável para o SC). Como esses ensaios quantificam a citotoxicidade por difer...

Divulgações

Os autores declaram não haver conflito de interesses.

Agradecimentos

Em memória do Dr. Márcio Lorencini, coautor deste trabalho, excelente pesquisador na área de cosméticos e dedicado à promoção da pesquisa cosmética no Brasil. Os autores agradecem ao Laboratório Multiusuário do Departamento de Fisiologia (UFPR) pela disponibilidade de equipamentos e pelo apoio financeiro da Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES, Brasil) (Código Financeiro 001) e do Grupo Boticário.

Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
5-CFDA, AM (5-Carboxyfluorescein Diacetate, Acetoxymethyl Ester)InvitrogenC1345
Cell culture plate, 96 well plateSarstedt83.3924Surface: Standard, flat base
DMEMGibco12800-017Powder, high glucose, pyruvate
FBS - Fetal Bovine Serum, qualified, USDA-approved regionsGibco12657-029
Ham's F-12 Nutrient Mix, powderGibco21700026Powder
HEPES (1 M)Gibco15630080
Leibovitz's L-15 MediumGibco41300021Powder
Neutral red Sigma-AldrichN4638Powder, BioReagent, suitable for cell culture
Orbital shaker WarmnestKLD-350-BI22 mm rotation diameter
Dulbeccos PBS (10X) with calcium and magnesiumInvitrogen14080055
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)Gibco15140122
Resazurin sodium salt Sigma-AldrichR7017Powder, BioReagent, suitable for cell culture
RPMI 1640 MediumGibco31800-014Powder
Sodium bicarbonateSigma-AldrichS5761Powder,  bioreagent for molecular biology
Thiazolyl Blue Tetrazolium Bromide  98%Sigma-AldrichM2128
Trypan blue stain (0.4%)Gibco15250-061
Trypsin-EDTA (0.5%), no phenol redGibco15400054
ZEM2S cell lineATCCCRL-2147This cell line was kindly donated by Professor Dr. Michael J.
Carvan (University of Wisconsin, Milwaukee, USA)
ZFL cell lineBCRJ256

Referências

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