人脐带间充质干细胞注射治疗糖尿病足溃疡的前瞻性、随机和对照研究

摘要

本协议描述了一项前瞻性、随机、对照的临床研究，该研究评估了人脐带间充质干细胞注射液治疗慢性糖尿病足溃疡的效果。

摘要

随着社会经济的发展，糖尿病足溃疡的发病率不断增加。目前，常规换药清创、高压氧、真空密封引流是临床上主要的保守治疗，大伤口常需植皮或皮瓣移植。但治疗效果并不理想，并发症多。糖尿病足溃疡发病机制复杂、治疗时间长、伴生困难大、致残率高，给患者、社会、医疗造成沉重负担。根据我们之前的研究，人脐带血干细胞的药理作用包括非特异性免疫调节;生长因子、血管活性因子和抗炎因子分泌增加;增强人体抗感染能力;消除炎症;促进血管生成和溃疡愈合。这些效应表明干细胞可能可用于难治性伤口的自体或同种异体治疗。因此，我们正在我们的诊所进行一项临床试验，用人脐带干细胞治疗难治性糖尿病伤口，用于符合纳入标准的糖尿病足溃疡患者。

引言

糖尿病是一种影响全球个人的疾病，世界卫生组织（WHO）预测，糖尿病患者人数将从2010年的2.85亿增加到2030年的4.39^亿1。糖尿病足溃疡（DFU）是糖尿病最严重的并发症之一，也是全世界非创伤性下肢截肢的主要原因²，³，^4，5。

最近，干细胞因其多能性、自我更新和促进再生细胞因子分泌的能力而作为一种疗法蓬勃发展6^，7。先前的临床实验表明，脂肪来源的干细胞凝胶对治疗慢性糖尿病足部溃疡有积极作用⁸。作者验证了使用干细胞治疗59名糖尿病伤口的有效性。在第12周，治疗组和对照组的完全伤口闭合率分别为82%和53%，这表明干细胞对难治性糖尿病伤口的治疗有效。总体而言，干细胞再生、替换、修复和分化的能力给生命科学界带来了无限的希望⁹。

2008年，Dulchavsky等人10使用含有自体骨髓基质细胞（BMSC）的移植物治疗了²⁰ 例不同原因的不愈合伤口。组织学检查显示，18例患者的皮肤伤口完全再上皮化。同样，在明胶支架中使用同种异体非糖尿病间充质干细胞（MSCs）治疗非愈合糖尿病伤口可以促进血管生成，增加再上皮化，并减少溃疡面积¹¹。然而，国内外临床研究中干细胞治疗糖尿病足创面的病例很少;大多数只是病例报告或探索性临床研究，缺乏严格的实验设计，很少有设计好的大样本或随机对照临床试验。由于干细胞不是常见的药物或生物制品，因此不同研究的制备方法和质量控制不同。一项研究的数据可能无法完全反映来自同一物种的所有干细胞的安全性。因此，我们进一步总结了人脐带间充质干细胞（HUCMSC）的相关基础研究和临床前实验，并系统评价了其临床应用的安全性和有效性。在此基础上，开发了从人脐带注射间充质干细胞以修复糖尿病足部伤口的治疗方法。本研究旨在验证干细胞修复糖尿病足创面在临床应用中的有效性和安全性。

综上所述，干细胞治疗应用广泛，潜力巨大，是一种很有前途的新型医学治疗方法。在国家自然科学基金（第81571901、第81501671、第82172224）的持续支持下，我们开展了一系列关于用HUCMSCs治疗糖尿病伤口的研究。在《皮肤病学研究》、《干细胞研究与治疗》、《细胞死亡与疾病》杂志上发表相关文章20余篇，申请国家发明专利3项，积累了较大的研究基础^12，13。在这里，我们提供了一种标准方法来评估注射HUCMSCs用于糖尿病足伤口修复。该标准程序已获中药临床试验批准（试验注册号:中药临床试验:MR-32-21-015759，[初始发布:2021年10月20日]）。

研究方案

这项前瞻性、单中心、随机、对照的临床研究获得了徐州医科大学附属医院伦理委员会（XYFY2021-KL124-02）的批准。该研究于 2021 年 7 月开始，将持续到 2023 年 7 月;本实验招募了60名患者。所有患者都签署了知情同意书，允许研究人员使用他们的临床材料和生物数据。

1. 招募患者

1. 纳入标准:
   1. 确保患者的年龄在 18 岁至 80 岁（含）之间，不分性别。
   2. 确保 2 型糖尿病和糖尿病足溃疡患者符合 1999 年 WHO 诊断标准 14，并且在筛查期间或随机分组前 3 个月内检测到糖化血红蛋白 （HbA1c） 水平 ≤¹⁰ %。
   3. 确认目标肢体的踝肱指数¹⁵ 至少为 0.8，无间歇性跛行。
   4. 确保每个患者的溃疡具有以下特征:
      根据瓦格纳溃疡分级系统¹⁶ 的 1 级或 2 级。
      位于足部、脚踝或前胫骨。
      清创后的横截面积为2-5厘米²。
      随机分组前至少 4 周肉眼看不到脓液或坏死物质。
   5. 研究中不包括接受其他伤口常规治疗的患者。
      1. 如果存在多个伤口，请选择符合纳入标准且干预和评估区域最大的伤口。
      2. 如果两个或两个以上的伤口同样大，请选择等级最严重的伤口。
      3. 如果有两个或两个以上伤口的面积和等级相同，请选择伤口持续时间最长的伤口。
   6. 参与这项临床研究是自愿的。确保患者与进行研究的医生合作并签署知情同意书。
2. 排除标准:
   1. 排除有明确手术指征的患者:血管闭塞、骨暴露、脓肿、骨髓炎。
   2. 排除入组前 3 个月内行血运重建或血管成形术的患者。
   3. 排除肝损伤患者;具体而言，排除 ALT（天冬氨酸氨基转移酶）和 AST（丙氨酸氨基转移酶）水平高于正常上限 3 倍的患者。
   4. 排除血肌酐水平高于正常上限两倍以上的患者;血清白蛋白<2.0克/分升;免疫抑制药物治疗;各种恶性肿瘤;以及怀孕、母乳喂养或最近的分娩计划。
   5. 排除对干细胞制剂产品的任何成分有禁忌证、过敏或已知过敏的患者。
   6. 排除导致研究者认为患者不应参加本研究的其他情况下的患者:
      1. 如果入院后发现患者不符合最重要的入院标准，则排除患者。
      2. 排除有严重不良反应的患者、要求退出研究的患者以及法定监护人要求他们退出研究的患者。
      3. 排除缺乏药物或有效的入组后观察数据的患者。
3. 随机化和盲法
   1. 将徐州医科大学附属医院门诊招募的患者按1:1的比例随机分为干细胞治疗组和常规伤口治疗组。
   2. 进行双盲试验进行治疗。确保第三方测量每位患者的伤口区域。

2.术前治疗

1. 入组后对患者进行常规治疗前检查，包括常规血液检查、尿液分析、常规粪便评估、生化功能评估、凝血功能评估、病毒学等。确保患者在同一家医院接受随访，以确保测试的准确性。
2. 包括符合纳入标准并已签署书面知情同意书的患者。使用比例抽样技术以1:1的比例将每个受试者随机分配到干细胞治疗组或常规伤口治疗组。

3. 处理程序

注意:两组患者每3天接受一次系统的常规伤口敷料更换。对于干细胞治疗组，患者接受干细胞局部注射四次（入组后第 1 天、第 8 天、第 15 天和第 22 天）。在常规伤口治疗组中，患者用银离子敷料治疗四次（入组后第1天，第8天，第15天和第22天）。具体步骤如下。

图1:处理过程。 在每组中，30名患者将严格按照本研究中描述的方案接受治疗。 请点击此处查看此图的大图。

1. 干细胞治疗组
   1. 用聚维酮碘局部消毒伤口并用手术剪刀去除伤口表面的坏死组织后，使用注射器吸出50mL生理盐水，从里到外清洁伤口表面。
   2. 使用无菌箔边缘钩法¹⁷测量伤口区域。将无菌薄膜透明敷料及其坐标网格涂在伤口表面上，并用记号笔沿着其边缘勾勒伤口表面的形状。根据胶片每个坐标网格的面积计算伤口面积。
   3. 将人脐带间充质干细胞（2 x 10⁵ 细胞/cm 2;0.4 mL/cm²）注射到伤口的外围和底部（注射间隔:0.75 cm;注射量:0.1 mL/部位）。
      注意:每位患者的注射次数取决于伤口区域。
   4. 将无菌敷料修剪成合适的尺寸，将其覆盖在伤口表面，然后包扎。
2. 常规伤口治疗组
   1. 用碘伏对伤口进行局部消毒，用手术剪刀去除伤口表面的坏死组织后，用注射器吸出50mL生理盐水，从里到外清洁伤口表面。
   2. 使用无菌箔边缘钩法¹⁷测量伤口区域。将无菌薄膜透明敷料及其坐标网格涂在伤口表面上，并用记号笔沿着其边缘勾勒伤口表面的形状。根据胶片每个坐标网格的面积计算伤口面积。
   3. 将银离子敷料修剪成合适的尺寸，覆盖在伤口表面，然后包扎。

图2:足部溃疡面积测量示意图。 请点击此处查看此图的大图。

图3:人脐带间充质干细胞注射示意图。 请点击此处查看此图的大图。

4. 观察指标

1. 获取受试者的人口统计数据。
2. 记录伴随的治疗;具体来说，记录伤口状态（位置、面积、深度、感染和缺血）、伤口愈合率、愈合时间和并发症。
3. 进行实验室测试。取伤口分泌物进行拭子和细菌学培养。进行常规血液检查和肝肾功能检查。

5. 跟进

1. 在治疗的第一天和最后一次治疗后15天和30天的随访期间检查患者。
2. 通过门诊和电话预约进行随访，记录治疗效果、病情变化、康复情况和当前生活状况。

6. 结局疗效评估

1. 根据以下标准进行临床评估。
   1. 计算主要结局指数:
      30天伤口愈合率=（原始伤口面积-30天未愈合伤口面积）/原始伤口面积×100%。
   2. 计算次要结局指数
      1. 伤口愈合时间:将伤口闭合时间定义为伤口完全重新上皮化的时间。
      2. 计算完整的愈合率:
         完全愈合率=完全愈合病例数/病例总数×100%
   3. 计算手术干预率:
      手术干预率=手术干预次数/病例总数×100%。
      注意:接受以下程序之一的受试者被记录为手术干预患者:清创和引流，皮肤移植，邻近皮肤皮瓣，远端皮瓣，非吻合口皮瓣和截肢。
   4. 根据标准临床检查程序进行细菌培养¹⁸ ，并将≥1病原体的细菌培养结果记录为阳性。计算病原体阳性率:
      病原体阳性率=检测到病原体阳性的病例数/病例总数×100%。

7. 安全程序

1. 在发生不良事件（干细胞临床研究期间发生的任何疾病、新症状、体征或实验室检查异常或原始症状和体征恶化，无论该事件是否与临床研究药物有关），采取必要的治疗和抢救措施。
2. 跟踪和调查所有不良事件和治疗过程，并详细记录结果，直到正确解决或病情稳定。如果检查异常且具有临床意义，请随访直至恢复正常。

结果

目前，我们的研究仍处于患者招募阶段，目前已完成HUCMSCs治疗组3例患者和对照组3例银离子敷料，共6例慢性糖尿病足部伤口患者。HUCMSCs治疗组患者溃疡区域的平均大小为3.5 cm 2，在用HUCMSC治疗后第8天，第15天和第22天分别减小到2.6 cm 2，1.8 cm 2和1.25 cm ²（图4A-D）。用银离子敷料治疗前对照组患者溃疡的平均大小为1.25c...

讨论

DFU是一个重大的全球公共卫生问题，也是下肢截肢和健康相关生活质量差的主要原因^19，20。目前临床管理仍以常规清创、高压氧治疗、真空密封引流（VSD）和保守治疗为主。较大的伤口通常需要移植皮肤和皮瓣。许多患者患有长期和反复的疾病，造成严重的身心痛苦，并严重限制了他们的生活质量²¹。这意味着迫切需要对DFU更有效的?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Silver Iin Wound Dressing	Shandong Cheerain Medical Co.,Ltd.	20152640521	Sterile silver ion dressing for medical use (Type F) 10 cm x 10 cm
Human Umbilical Cord Mesenchymal Stem Cells Injection	Shandong Qilu Cell Therapy Engineering Technology Co., Ltd.	32183185-X	Main components: human umbilical cord mesenchymal stem cells. Pharmacological effect: non-specific immunomodulator can enhance the secretion of growth factor, vasoactive factor and anti-inflammatory factor, improve the anti infection ability of human body, eliminate inflammation, promote angiogenesis and ulcer healing.
Sterile mesh film transparent dressing	Smith & Nephew	20162644490	Sterile mesh film transparent dressing (used for wound area measurement) 6 cm x 7 cm