Studio prospettico, randomizzato e controllato di un'iniezione di cellule staminali mesenchimali del cordone ombelicale umano per il trattamento delle ulcere del piede diabetico

Riepilogo

Il presente protocollo descrive uno studio clinico prospettico, randomizzato e controllato che valuta un'iniezione di cellule staminali mesenchimali del cordone ombelicale umano per il trattamento delle ulcere croniche del piede diabetico.

Abstract

Con lo sviluppo della società e dell'economia, l'incidenza delle ulcere del piede diabetico continua ad aumentare. Attualmente, lo sbrigliamento convenzionale con cambi di medicazione, ossigeno iperbarico e drenaggio sottovuoto sono i principali trattamenti conservativi nella pratica clinica e le ferite di grandi dimensioni spesso richiedono innesti cutanei o innesti di lembo cutaneo. Tuttavia, gli effetti del trattamento non sono ideali e esistono molte complicazioni. A causa della sua complessa patogenesi, dei lunghi tempi di trattamento, delle significative difficoltà associate e dell'alto tasso di disabilità, le ulcere del piede diabetico causano un pesante onere per i pazienti, la società e le cure mediche. Secondo il nostro studio precedente, gli effetti farmacologici delle cellule staminali del sangue del cordone ombelicale umano includono la regolazione immunitaria non specifica; aumento della secrezione di fattori di crescita, fattori vasoattivi e fattori antinfiammatori; maggiore capacità anti-infettiva del corpo umano; eliminazione dell'infiammazione; e promozione dell'angiogenesi e della guarigione delle ulcere. Questi effetti suggeriscono che le cellule staminali possono essere utili come trattamento autologo o allogenico per ferite refrattarie. Pertanto, stiamo conducendo una sperimentazione clinica per il trattamento di ferite diabetiche refrattarie con cellule staminali del cordone ombelicale umano nella nostra clinica per pazienti con ulcera del piede diabetico che soddisfano i criteri di inclusione.

Introduzione

Il diabete mellito è una malattia che colpisce individui in tutto il mondo e l'Organizzazione Mondiale della Sanità (OMS) prevede che il numero di persone con diabete mellito aumenterà da 285 milioni nel 2010 a 439 milioni nel 2030¹. Le ulcere del piede diabetico (DFU) sono una delle complicanze più gravi del diabete e sono i principali contributori alle amputazioni non traumatiche degli arti inferiori in tutto il mondo 2,3,4,5.

Recentemente, le cellule staminali sono fiorite come terapia grazie alla loro pluripotenza, auto-rinnovamento e capacità di promuovere la secrezione di citochine rigenerative ^6,7. Un precedente esperimento clinico ha dimostrato che i gel di cellule staminali derivate dal grasso hanno avuto un effetto positivo sul trattamento delle ulcere del piede nel diabete cronico⁸. Gli autori hanno verificato l'efficacia dell'uso di cellule staminali per trattare le ferite diabetiche in 59 pazienti. Alla settimana 12, il tasso di chiusura completa della ferita nei gruppi di trattamento e di controllo era rispettivamente dell'82% e del 53%, il che indica che le cellule staminali sono efficaci per il trattamento delle ferite diabetiche refrattarie. Nel complesso, la capacità delle cellule staminali di rigenerarsi, sostituire, riparare e differenziare ha dato infinite speranze alla comunità delle scienze della vita⁹.

Nel 2008, Dulchavsky et ^al.10 hanno utilizzato innesti contenenti cellule stromali autologhe del midollo osseo (BMSC) per trattare 20 casi di ferite non cicatrizzanti di diverse cause. Gli esami istologici hanno mostrato che le ferite cutanee di 18 pazienti erano completamente riepitelizzate. Allo stesso modo, l'uso di cellule staminali mesenchimali (MSC) allogeniche non diabetiche negli scaffold di gelatina per il trattamento di ferite diabetiche non unionali può promuovere l'angiogenesi, aumentare la riepitelizzazione e ridurre l'area dell'ulcera¹¹. Tuttavia, ci sono pochi casi di trattamento con cellule staminali di ferite del piede diabetico in studi di ricerca clinica nazionali ed esteri; La maggior parte sono solo casi clinici o ricerche cliniche esplorative prive di un rigoroso disegno sperimentale, e ci sono pochi campioni di grandi dimensioni con un buon disegno o studi clinici randomizzati controllati. Poiché le cellule staminali non sono farmaci o prodotti biologici comuni, i metodi di preparazione e i controlli di qualità differiscono tra gli studi. I dati di uno studio potrebbero non riflettere pienamente la sicurezza di tutte le cellule staminali della stessa specie. Pertanto, abbiamo ulteriormente riassunto la ricerca di base pertinente e gli esperimenti preclinici con cellule staminali mesenchimali del cordone ombelicale umano (HUCMSC) e valutato sistematicamente la sicurezza e l'efficacia della loro applicazione clinica. Su questa base, l'iniezione di cellule staminali mesenchimali dal cordone ombelicale umano per riparare le ferite del piede diabetico è stata sviluppata come trattamento. Questo studio mira a verificare l'efficacia e la sicurezza della riparazione con cellule staminali delle ferite del piede diabetico in uso clinico.

In sintesi, la terapia con cellule staminali ha un ampio spettro di applicazioni e un grande potenziale e rappresenta un nuovo promettente metodo di trattamento medico. Con il continuo supporto della National Natural Science Foundation of China (n. 81571901, n. 81501671 e n. 82172224), abbiamo condotto una serie di studi sul trattamento delle ferite diabetiche con HUCMSC. Abbiamo pubblicato più di 20 articoli correlati nel Journal of Investigative Dermatology, Stem Cell Research and Therapy e Cell Death and Disease e abbiamo richiesto tre brevetti nazionali di invenzione, accumulando così una grande base di ricerca^12,13. Qui, forniamo un approccio standard per valutare l'iniezione di HUCMSC per la riparazione delle ferite del piede diabetico. Questa procedura standard è stata approvata dagli studi clinici cinesi sui farmaci (numero di registrazione dello studio: studi clinici sui farmaci cinesi: MR-32-21-015759, [Versione iniziale: 20/10/2021]).

Protocollo

Questo studio clinico prospettico, monocentrico, randomizzato e controllato è stato approvato dal Comitato etico dell'ospedale affiliato dell'Università di medicina di Xuzhou (XYFY2021-KL124-02). Lo studio è iniziato nel luglio 2021 e proseguirà fino a luglio 2023; 60 pazienti sono stati reclutati in questo esperimento. Tutti i pazienti hanno firmato un consenso informato che ha permesso ai ricercatori di utilizzare i loro materiali clinici e dati biologici.

1. Reclutamento dei pazienti

1. Criteri di inclusione:
   1. Assicurarsi che l'età dei pazienti sia compresa tra 18 anni e 80 anni (inclusi), indipendentemente dal sesso.
   2. Assicurarsi che i pazienti con diabete di tipo 2 e ulcere del piede diabetico soddisfino i criteri diagnostici¹⁴ dell'OMS del 1999 e abbiano un livello di emoglobina glicata (HbA1c) ≤10% come rilevato durante il periodo di screening o entro 3 mesi prima della randomizzazione.
   3. Confermare che l'indice caviglia-braccio¹⁵ dell'arto bersaglio sia almeno 0,8 senza claudicatio intermittente.
   4. Assicurarsi che l'ulcera di ciascun paziente abbia le seguenti caratteristiche:
      Grado 1 o grado 2 secondo il sistema di classificazione Wagner¹⁶ per le ulcere.
      Posizione nel piede, nella caviglia o nello stinco anteriore.
      Area della sezione trasversale dopo lo sbrigliamento di 2-5 cm².
      Nessun pus o sostanza necrotica visibile ad occhio nudo almeno 4 settimane prima della randomizzazione.
   5. Non includere nello studio pazienti sottoposti a trattamento di routine di altre ferite.
      1. Se sono presenti più ferite, selezionare la ferita che soddisfa i criteri di inclusione e ha l'area di intervento e valutazione più ampia.
      2. Se due o più ferite sono altrettanto grandi, selezionare quella con il grado più grave.
      3. Se ci sono due o più ferite con la stessa area e grado, selezionare quella con la durata della ferita più lunga.
   6. La partecipazione a questo studio clinico è volontaria. Assicurarsi che i pazienti collaborino con i medici che conducono lo studio e firmino un modulo di consenso informato.
2. Criteri di esclusione:
   1. Escludere pazienti con chiare indicazioni chirurgiche: occlusione vascolare, esposizione ossea, ascesso, osteomielite.
   2. Escludere i pazienti con rivascolarizzazione o angioplastica entro 3 mesi prima dell'arruolamento.
   3. Escludere i pazienti con insufficienza epatica; in particolare, escludere i pazienti con livelli di ALT (aspartato aminotransferasi) e AST (alanina aminotransferasi) tre volte superiori al limite superiore della norma.
   4. Escludere i pazienti con livelli di creatinina nel sangue più di due volte superiori al limite superiore della norma; albumina sierica <2,0 g/dL; trattamento farmacologico immunosoppressivo; vari tumori maligni; e gravidanza, allattamento al seno o un piano di nascita recente.
   5. Escludere i pazienti con controindicazioni, allergie o allergie note a qualsiasi componente dei prodotti di preparazione delle cellule staminali.
   6. Escludere i pazienti in altre situazioni che inducono lo sperimentatore a credere che il paziente non debba partecipare a questo studio:
      1. Escludere i pazienti se dopo il ricovero si scopre che non soddisfano i criteri di ammissione più importanti.
      2. Escludere i pazienti con reazioni avverse gravi, i pazienti che chiedono di ritirarsi dallo studio e i pazienti il cui tutore legale richiede loro di ritirarsi dallo studio.
      3. Escludere i pazienti con mancanza di farmaci o dati osservazionali post-arruolamento efficaci.
3. Randomizzazione e accecamento
   1. Randomizzare i pazienti reclutati dal reparto ambulatoriale dell'ospedale affiliato dell'Università di medicina di Xuzhou su base 1: 1 nel gruppo di terapia con cellule staminali e nel gruppo di trattamento convenzionale delle ferite.
   2. Condurre uno studio in doppio cieco per il trattamento. Assicurarsi che una terza parte misuri l'area della ferita di ciascun paziente.

2. Trattamento preoperatorio

1. Eseguire esami di routine pretrattamento per i pazienti dopo l'arruolamento, tra cui un esame del sangue di routine, analisi delle urine, una valutazione di routine delle feci, una valutazione della funzione biochimica, una valutazione della funzione di coagulazione, virologia, ecc. Assicurarsi che i pazienti siano seguiti nello stesso ospedale per garantire l'accuratezza dei test.
2. Includere pazienti che soddisfano i criteri di inclusione e hanno firmato il consenso informato scritto. Assegnare ogni soggetto in modo casuale al gruppo di terapia con cellule staminali o al gruppo convenzionale di trattamento delle ferite in un rapporto 1: 1 utilizzando una tecnica di campionamento proporzionata.

3. Modalità del trattamento

NOTA: I pazienti di entrambi i gruppi ricevono sistematicamente cambi di routine della medicazione delle ferite ogni 3 giorni. Per il gruppo di trattamento con cellule staminali, i pazienti ricevono iniezioni locali di cellule staminali quattro volte (il giorno 1, il giorno 8, il giorno 15 e il giorno 22 dopo l'arruolamento). Nel gruppo convenzionale di trattamento della ferita, i pazienti vengono trattati con la medicazione agli ioni d'argento quattro volte (il giorno 1, il giorno 8, il giorno 15 e il giorno 22 dopo l'arruolamento). I passaggi specifici sono i seguenti.

Figura 1: Processo di trattamento. In ogni gruppo, 30 pazienti saranno sottoposti a trattamento seguendo rigorosamente il protocollo descritto in questo studio. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

1. Gruppo di terapia con cellule staminali
   1. Dopo aver disinfettato localmente la ferita con povidone-iodio e rimosso il tessuto necrotico dalla superficie della ferita con forbici chirurgiche, utilizzare una siringa per aspirare 50 ml di soluzione fisiologica salina per pulire la superficie della ferita dentro e fuori.
   2. Misurare l'area della ferita utilizzando il metodo del gancio del bordo sterile¹⁷. Applicare la medicazione trasparente con pellicola sterile con la sua griglia di coordinate sulla superficie della ferita e delineare la forma della superficie della ferita lungo il bordo con un pennarello. Calcolare l'area della ferita in base all'area di ciascuna griglia di coordinate del film.
   3. Iniettare le cellule staminali mesenchimali del cordone ombelicale umano (2 x 10⁵ cellule/cm 2; 0,4 ml/cm²) nella periferia e alla base della ferita (distanza tra le iniezioni: 0,75 cm; volume di iniezione: 0,1 ml/sito).
      NOTA: Il numero di iniezioni per ciascun paziente dipende dall'area della ferita.
   4. Tagliare la medicazione sterile alla dimensione appropriata, coprirla sulla superficie della ferita e quindi fasciarla.
2. Gruppo convenzionale per il trattamento delle ferite
   1. Dopo aver disinfettato localmente la ferita con iodoforo e rimosso il tessuto necrotico dalla superficie della ferita con forbici chirurgiche, utilizzare una siringa per aspirare 50 ml di soluzione salina fisiologica per pulire la superficie della ferita dentro e fuori.
   2. Misurare l'area della ferita utilizzando il metodo del gancio del bordo sterile¹⁷. Applicare la medicazione trasparente con pellicola sterile con la sua griglia di coordinate sulla superficie della ferita e delineare la forma della superficie della ferita lungo il bordo con un pennarello. Calcolare l'area della ferita in base all'area di ciascuna griglia di coordinate del film.
   3. Tagliare la medicazione agli ioni d'argento ad una dimensione appropriata, coprirla sulla superficie della ferita e quindi fasciarla.

Figura 2: Diagramma schematico della misurazione dell'area dell'ulcera del piede. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figura 3: Schema dell'iniezione di cellule staminali mesenchimali del cordone ombelicale umano. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

4. Indicatori di osservazione

1. Ottenere i dati demografici dei soggetti.
2. Registrare i trattamenti concomitanti; In particolare, registrare lo stato della ferita (posizione, area, profondità, infezione e ischemia), il tasso di guarigione della ferita, il tempo di guarigione e le complicanze.
3. Eseguire test di laboratorio. Prendi la secrezione della ferita per tamponi e coltura batteriologica. Condurre esami del sangue di routine e test per la funzionalità epatica e renale.

5. Follow-up

1. Esaminare i pazienti il primo giorno di terapia e durante le visite di follow-up 15 giorni e 30 giorni dopo l'ultima terapia.
2. Condurre follow-up utilizzando appuntamenti sia ambulatoriali che telefonici per registrare gli effetti del trattamento, i cambiamenti delle condizioni, la situazione di recupero e lo stato di vita attuale.

6. Valutazione dell'efficacia degli esiti

1. Condurre la valutazione clinica secondo i seguenti criteri.
   1. Calcola l'indice di risultato primario:
      Il tasso di guarigione della ferita a 30 giorni = (area della ferita originale − area della ferita non guarita a 30 giorni)/area della ferita originale × 100%.
   2. Calcolare l'indice di risultato secondario
      1. Tempo di guarigione della ferita: definire il tempo di chiusura della ferita come il momento in cui la ferita è completamente riepitelizzata.
      2. Calcola il tasso di guarigione completo:
         Il tasso di guarigione completo = il numero di casi guariti completi / il numero totale di casi × 100%
   3. Calcola il tasso di intervento chirurgico:
      Tasso di intervento chirurgico = il numero di interventi chirurgici / il numero totale di casi × 100%.
      NOTA: I soggetti sottoposti a una delle seguenti procedure sono registrati come pazienti con interventi chirurgici: sbrigliamento e drenaggio, innesto cutaneo, lembo cutaneo adiacente, lembo cutaneo distale, lembo cutaneo non anastomotico e amputazione.
   4. Eseguire la coltura batterica¹⁸ secondo le procedure di ispezione clinica standard e registrare i risultati della coltura batterica del patogeno ≥1 come positivi. Calcola il tasso di positività del patogeno:
      Tasso di positività al patogeno = numero di casi rilevati positivi al patogeno/il numero totale di casi × 100%.

7. Procedure di sicurezza

1. In caso di evento avverso (qualsiasi malattia, nuovi sintomi, segni o anomalie degli esami di laboratorio o deterioramento dei sintomi e dei segni originali che si verificano durante la ricerca clinica sulle cellule staminali, indipendentemente dal fatto che l'evento sia correlato o meno al farmaco di ricerca clinica), adottare le misure necessarie per il trattamento e il salvataggio.
2. Traccia e indaga su tutti gli eventi avversi e sul processo di trattamento e registra i risultati in dettaglio fino a quando non viene risolto correttamente o fino a quando la condizione non è stabile. Se un test è anormale e ha un significato clinico, seguirlo fino a quando non ritorna alla normalità.

Risultati

Al momento, la nostra ricerca è ancora nella fase di reclutamento dei pazienti e ora abbiamo completato tre pazienti nel gruppo di trattamento HUCMSCs e tre pazienti nel gruppo di controllo con medicazioni agli ioni d'argento, per un totale di sei pazienti con ferite croniche al piede diabetico. La dimensione media dell'area dell'ulcera di un paziente nel gruppo di trattamento con HUCMSCs è stata di 3,5 cm 2, e questa è stata ridotta a 2,6 cm 2, 1,8 cm 2 e 1,25 cm ² rispettivamente l'8...

Discussione

Le DFU sono un grave problema di salute pubblica globale e una delle principali cause di amputazioni degli arti inferiori e scarsa qualità della vita correlata alla salute^19,20. Attualmente, la gestione clinica è ancora dominata dallo sbrigliamento convenzionale, dall'ossigenoterapia iperbarica, dal drenaggio sottovuoto (VSD) e dalla gestione conservativa. Le ferite più grandi richiedono spesso il trapianto di pelle e lembi cutanei. Molti pazienti soffrono di ...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Silver Iin Wound Dressing	Shandong Cheerain Medical Co.,Ltd.	20152640521	Sterile silver ion dressing for medical use (Type F) 10 cm x 10 cm
Human Umbilical Cord Mesenchymal Stem Cells Injection	Shandong Qilu Cell Therapy Engineering Technology Co., Ltd.	32183185-X	Main components: human umbilical cord mesenchymal stem cells. Pharmacological effect: non-specific immunomodulator can enhance the secretion of growth factor, vasoactive factor and anti-inflammatory factor, improve the anti infection ability of human body, eliminate inflammation, promote angiogenesis and ulcer healing.
Sterile mesh film transparent dressing	Smith & Nephew	20162644490	Sterile mesh film transparent dressing (used for wound area measurement) 6 cm x 7 cm