Estudo Prospectivo, Randomizado e Controlado de uma Injeção de Células-Tronco Mesenquimais do Cordão Umbilical Humano no Tratamento de Úlceras do Pé Diabético

Resumo

O presente protocolo descreve um estudo clínico prospectivo, randomizado e controlado que avalia a injeção de células-tronco mesenquimais de cordão umbilical humano para o tratamento de úlceras crônicas de pé diabético.

Resumo

Com o desenvolvimento da sociedade e da economia, a incidência de úlceras de pé diabético continua a aumentar. Atualmente, o desbridamento convencional com troca de curativo, oxigênio hiperbárico e drenagem em selo a vácuo são os principais tratamentos conservadores na prática clínica, e grandes feridas frequentemente requerem enxertos de pele ou retalhos cutâneos. No entanto, os efeitos do tratamento não são ideais, e muitas complicações existem. Devido à sua complexa patogênese, longo tempo de tratamento, dificuldades associadas significativas e alta taxa de incapacidade, as úlceras do pé diabético causam um fardo pesado para os pacientes, a sociedade e os cuidados médicos. De acordo com nosso estudo anterior, os efeitos farmacológicos das células-tronco do sangue do cordão umbilical humano incluem regulação imune inespecífica; aumento da secreção de fatores de crescimento, fatores vasoativos e fatores anti-inflamatórios; capacidade anti-infecciosa reforçada do corpo humano; eliminação da inflamação; e promoção da angiogênese e cicatrização de úlceras. Esses efeitos sugerem que as células-tronco podem ser úteis como tratamento autólogo ou alogênico para feridas refratárias. Portanto, estamos conduzindo um ensaio clínico para tratar feridas diabéticas refratárias com células-tronco do cordão umbilical humano em nosso serviço para pacientes com úlcera de pé diabético que preenchem os critérios de inclusão.

Introdução

O diabetes mellitus é uma doença que afeta indivíduos em todo o mundo, e a Organização Mundial da Saúde (OMS) prevê que o número de pessoas com diabetes mellitus aumentará de 285 milhões em 2010 para 439 milhões em 2030¹. As úlceras do pé diabético (DFUs) são uma das complicações mais graves do diabetes e são as principais contribuintes para amputações não traumáticas de membros inferiores em todo o mundo 2,3,4,5.

Recentemente, as células-tronco têm florescido como terapia devido à sua pluripotência, auto-renovação e capacidade de promover a secreção de citocinas regenerativas ^6,7. Um experimento clínico anterior mostrou que géis de células-tronco derivadas de gordura tiveram um efeito positivo no tratamento de úlceras de pé no diabetes crônico⁸. Os autores verificaram a eficácia do uso de células-tronco no tratamento de feridas diabéticas em 59 pacientes. Na semana 12, a taxa de fechamento completo da ferida nos grupos tratamento e controle foi de 82% e 53%, respectivamente, o que indica que as células-tronco são eficazes no tratamento de feridas diabéticas refratárias. Em geral, a capacidade das células-tronco de regenerar, substituir, reparar e diferenciar deu esperança infinita à comunidade de ciências da vida⁹.

Em 2008, Dulchavsky et ^al.10 utilizaram enxertos contendo células estromais autólogas da medula óssea (BMSCs) para tratar 20 casos de feridas não cicatrizantes de diferentes causas. Os exames histológicos mostraram que as feridas cutâneas de 18 pacientes foram completamente reepitelizadas. Da mesma forma, o uso de células-tronco mesenquimais (CTMs) alogênicas não diabéticas em arcabouços gelatinosos para o tratamento de feridas diabéticas não encenadas pode promover angiogênese, aumentar a reepitelização e reduzir a área da úlcera¹¹. No entanto, há poucos casos de tratamento com células-tronco de feridas do pé diabético em estudos de pesquisa clínica nacionais e estrangeiros; A maioria são apenas relatos de caso ou pesquisa clínica exploratória sem um desenho experimental rigoroso, e há poucas amostras grandes com bom desenho ou ensaios clínicos randomizados controlados. Como as células-tronco não são drogas comuns ou produtos biológicos, os métodos de preparação e os controles de qualidade diferem entre os estudos. Os dados de um estudo podem não refletir totalmente a segurança de todas as células-tronco da mesma espécie. Portanto, resumimos ainda mais a pesquisa básica relevante e os experimentos pré-clínicos com células-tronco mesenquimais do cordão umbilical humano (HUCMSCs) e avaliamos sistematicamente a segurança e eficácia de sua aplicação clínica. Com base nisso, a injeção de células-tronco mesenquimais do cordão umbilical humano para reparar feridas do pé diabético foi desenvolvida como tratamento. Este estudo tem como objetivo verificar a eficácia e segurança do reparo com células-tronco de feridas do pé diabético em uso clínico.

Em resumo, a terapia com células-tronco tem um amplo espectro de aplicações e grande potencial e representa um novo método de tratamento médico promissor. Com o apoio contínuo da Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (nº 81571901, nº 81501671 e nº 82172224), realizamos uma série de estudos sobre o tratamento de feridas diabéticas com HUCMSCs. Publicamos mais de 20 artigos relacionados no Journal of Investigative Dermatology, Stem Cell Research and Therapy e Cell Death and Disease e solicitamos três patentes nacionais de invenção, acumulando assim uma grande base de pesquisa^12,13. Aqui, fornecemos uma abordagem padrão para avaliar a injeção de HUCMSCs para reparo de feridas no pé diabético. Este procedimento padrão foi aprovado por ensaios clínicos de medicamentos chineses (Número de registro do ensaio: Ensaios clínicos de medicamentos chineses: MR-32-21-015759, [Lançamento inicial: 20/10/2021]).

Protocolo

Este estudo clínico prospectivo, unicêntrico, randomizado e controlado foi aprovado pelo Comitê de Ética do Hospital Afiliado da Universidade Médica de Xuzhou (XYFY2021-KL124-02). O estudo teve início em julho de 2021 e segue até julho de 2023; 60 pacientes foram recrutados neste experimento. Todos os pacientes assinaram um termo de consentimento livre e esclarecido que permitiu aos pesquisadores utilizar seus materiais clínicos e dados biológicos.

1. Recrutamento de pacientes

1. Critérios de inclusão:
   1. Garantir que as idades dos pacientes estejam entre 18 anos e 80 anos (inclusive), independentemente do sexo.
   2. Garantir que os pacientes com diabetes tipo 2 e úlceras de pé diabético atendam aos critérios diagnósticos da OMS de^{1999 14} e tenham um nível de hemoglobina glicada (HbA1c) ≤10%, conforme detectado durante o período de triagem ou dentro de 3 meses antes da randomização.
   3. Confirmar se o índice tornozelo-braço¹⁵ do membro alvo é de pelo menos 0,8 sem claudicação intermitente.
   4. Certifique-se de que a úlcera de cada paciente tenha as seguintes características:
      Grau 1 ou grau 2 de acordo com o sistema de classificação Wagner¹⁶ para úlceras.
      Localização no pé, tornozelo ou canela dianteira.
      Área de secção transversa após desbridamento de 2-5^cm2.
      Sem pus ou substância necrótica visível a olho nu pelo menos 4 semanas antes da randomização.
   5. Não incluir no estudo pacientes submetidos ao tratamento rotineiro de outras feridas.
      1. Se houver múltiplas feridas, selecione a ferida que atenda aos critérios de inclusão e tenha a maior área de intervenção e avaliação.
      2. Se duas ou mais feridas forem igualmente grandes, selecione aquela com o grau mais grave.
      3. Se houver duas ou mais feridas com a mesma área e grau, selecione aquela com a maior duração da ferida.
   6. A participação neste estudo clínico é voluntária. Garantir que os pacientes cooperem com os médicos que conduzem o estudo e assinem um termo de consentimento informado.
2. Critérios de exclusão:
   1. Excluir pacientes com indicações cirúrgicas claras: oclusão vascular, exposição óssea, abscesso, osteomielite.
   2. Excluir pacientes com revascularização ou angioplastia nos 3 meses anteriores à inclusão no estudo.
   3. Excluir doentes com compromisso hepático; especificamente, excluir pacientes com níveis de ALT (aspartato aminotransferase) e AST (alanina aminotransferase) três vezes maiores do que o limite superior do normal.
   4. Excluir pacientes com níveis de creatinina no sangue mais de duas vezes acima do limite superior do normal; albumina sérica <2,0 g/dL; tratamento medicamentoso imunossupressor; vários tumores malignos; e gravidez, amamentação ou plano de parto recente.
   5. Excluir pacientes com contraindicações, alergias ou alergias conhecidas a qualquer componente de produtos de preparação de células-tronco.
   6. Excluir pacientes em outras situações que levem o investigador a acreditar que o paciente não deve participar deste estudo:
      1. Excluir pacientes se for descoberto após a admissão que eles não preenchem os critérios de admissão mais importantes.
      2. Excluir pacientes com reações adversas graves, pacientes que solicitarem a retirada do estudo e pacientes cujo responsável legal solicitar a retirada do estudo.
      3. Excluir pacientes com falta de medicação ou dados observacionais pós-inclusão efetivos.
3. Randomização e cegamento
   1. Randomizar os pacientes recrutados do departamento ambulatorial do Hospital Afiliado da Universidade Médica de Xuzhou em uma base 1:1 no grupo de terapia com células-tronco e no grupo de tratamento de feridas convencionais.
   2. Realizar um ensaio clínico duplo-cego para o tratamento. Certifique-se de que um terceiro mede a área da ferida de cada paciente.

2. Tratamento pré-operatório

1. Realizar exames de rotina pré-tratamento para os pacientes após a inscrição, incluindo um exame de sangue de rotina, urinálise, uma avaliação de fezes de rotina, uma avaliação da função bioquímica, uma avaliação da função de coagulação, virologia, etc. Garantir que os pacientes sejam acompanhados no mesmo hospital para garantir a precisão dos testes.
2. Incluir pacientes que preencham os critérios de inclusão e que tenham assinado o termo de consentimento livre e esclarecido. Atribua cada sujeito aleatoriamente ao grupo de terapia com células-tronco ou ao grupo de tratamento de feridas convencional em uma proporção de 1:1 usando uma técnica de amostragem proporcional.

3. Procedimentos de tratamento

OBS: Os pacientes de ambos os grupos recebem trocas sistemáticas rotineiras de curativos a cada 3 dias. Para o grupo de tratamento com células-tronco, os pacientes recebem injeções locais de células-tronco quatro vezes (no dia 1, dia 8, dia 15 e dia 22 após a inscrição). No grupo de tratamento convencional de feridas, os pacientes são tratados com curativo de íons de prata quatro vezes (no dia 1, no dia 8, no dia 15 e no dia 22 após a inclusão no estudo). As etapas específicas são as seguintes.

Figura 1: Processo de tratamento. Em cada grupo, 30 pacientes serão submetidos ao tratamento seguindo rigorosamente o protocolo descrito neste estudo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

1. Grupo de terapia com células-tronco
   1. Após desinfetar localmente a ferida com iodopovidona e remover o tecido necrótico da superfície da ferida com tesoura cirúrgica, use uma seringa para aspirar 50 mL de soro fisiológico para limpar a superfície da ferida por dentro e por fora.
   2. Medir a área da ferida usando o método do gancho de borda de folha estéril¹⁷. Aplique o curativo transparente de filme estéril com sua grade coordenada na superfície da ferida e contorne a forma da superfície da ferida ao longo de sua borda com um marcador. Calcular a área da ferida de acordo com a área de cada grade de coordenadas do filme.
   3. Injetar as células-tronco mesenquimais do cordão umbilical humano (2 x 10⁵ células/cm 2; 0,4 mL/cm²) na periferia e na base da ferida (espaçamento entre injeções: 0,75 cm; volume de injeção: 0,1 mL/local).
      NOTA: O número de injeções para cada paciente depende da área da ferida.
   4. Aparar o curativo estéril no tamanho adequado, cobri-lo sobre a superfície da ferida e, em seguida, enfaixar.
2. Grupo de tratamento de feridas convencionais
   1. Após desinfetar localmente a ferida com iodóforo e remover o tecido necrótico da superfície da ferida com tesoura cirúrgica, use uma seringa para aspirar 50 mL de soro fisiológico para limpar a superfície da ferida por dentro e por fora.
   2. Medir a área da ferida usando o método do gancho de borda de folha estéril¹⁷. Aplique o curativo transparente de filme estéril com sua grade coordenada na superfície da ferida e contorne a forma da superfície da ferida ao longo de sua borda com um marcador. Calcular a área da ferida de acordo com a área de cada grade de coordenadas do filme.
   3. Aparar o curativo de íons de prata em um tamanho apropriado, cobri-lo sobre a superfície da ferida e, em seguida, enfaixar.

Figura 2: Diagrama esquemático da medida da área da úlcera do pé. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: Esquema da injeção de células-tronco mesenquimais do cordão umbilical humano. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

4. Indicadores de observação

1. Obter os dados demográficos dos sujeitos.
2. Registrar os tratamentos concomitantes; Especificamente, registre o status da ferida (localização, área, profundidade, infecção e isquemia), a taxa de cicatrização da ferida, o tempo de cicatrização e as complicações.
3. Realizar exames laboratoriais. Tome a secreção da ferida para swabs e cultura bacteriológica. Realizar exames de sangue de rotina e testes para a função hepática e renal.

5. Acompanhamento

1. Examinar os pacientes no primeiro dia de terapia e durante as visitas de acompanhamento 15 dias e 30 dias após a última terapia.
2. Realizar acompanhamentos usando consultas ambulatoriais e telefônicas para registrar os efeitos do tratamento, mudanças de condição, situação de recuperação e status de vida atual.

6. Avaliação da eficácia dos desfechos

1. Realizar a avaliação clínica de acordo com os seguintes critérios.
   1. Calcule o índice de desfecho primário:
      A taxa de cicatrização da ferida em 30 dias = (área original da ferida − área da ferida não cicatrizada aos 30 dias)/área da ferida original × 100%.
   2. Calcular o índice de desfecho secundário
      1. Tempo de cicatrização de feridas: Defina o tempo de fechamento da ferida como o momento em que a ferida é completamente reepitelizada.
      2. Calcule a taxa de cura completa:
         A taxa de cicatrização completa = o número de casos curados completos/o número total de casos × 100%
   3. Calcule a taxa de intervenção cirúrgica:
      Taxa de intervenção cirúrgica = número de intervenções cirúrgicas/número total de casos × 100%.
      OBS: Os indivíduos submetidos a um dos seguintes procedimentos são registrados como pacientes com intervenções cirúrgicas: desbridamento e drenagem, enxerto de pele, retalho cutâneo adjacente, retalho cutâneo distal, retalho cutâneo não anastomótico e amputação.
   4. Realizar a cultura bacteriana¹⁸ de acordo com os procedimentos de inspeção clínica padrão e registrar os resultados da cultura bacteriana do patógeno ≥1 como positivos. Calcule a taxa de positividade do patógeno:
      Taxa de patógenos positivos = número de casos detectados positivos para patógenos/o número total de casos × 100%.

7. Procedimentos de segurança

1. No caso de um evento adverso (qualquer doença, novos sintomas, sinais ou anormalidades no exame laboratorial ou a deterioração dos sintomas e sinais originais que ocorrem durante a pesquisa clínica com células-tronco, independentemente de o evento estar relacionado ao medicamento de pesquisa clínica ou não), tomar as medidas necessárias para o tratamento e resgate.
2. Acompanhe e investigue todos os eventos adversos e o processo de tratamento, e registre os resultados em detalhes até que a condição seja devidamente resolvida ou até que a condição esteja estável. Se um teste for anormal e tiver significado clínico, acompanhe-o até que ele volte ao normal.

Resultados

No momento, nossa pesquisa ainda está em fase de recrutamento de pacientes, e já completamos três pacientes no grupo tratamento do HUCMSCs e três pacientes no grupo controle com curativos de íons de prata, totalizando seis pacientes com feridas crônicas no pé diabético. O tamanho médio da área da úlcera de um paciente do grupo de tratamento do HUCMSCs foi de 3,5 cm 2, sendo reduzido para 2,6 cm 2, 1,8 cm 2 e 1,25 cm ² no 8º, 15º e 22º dias após o tratamento com HUCMSCs (

Discussão

As DFUs são um importante problema de saúde pública mundial e uma das principais causas de amputações de membros inferiores e má qualidade de vida relacionada à saúde^19,20. Atualmente, o manejo clínico ainda é dominado por desbridamento convencional, oxigenoterapia hiperbárica, drenagem em selamento a vácuo (CIV) e tratamento conservador. Feridas maiores geralmente requerem o transplante de pele e retalhos cutâneos. Muitos pacientes sofrem de doença...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Silver Iin Wound Dressing	Shandong Cheerain Medical Co.,Ltd.	20152640521	Sterile silver ion dressing for medical use (Type F) 10 cm x 10 cm
Human Umbilical Cord Mesenchymal Stem Cells Injection	Shandong Qilu Cell Therapy Engineering Technology Co., Ltd.	32183185-X	Main components: human umbilical cord mesenchymal stem cells. Pharmacological effect: non-specific immunomodulator can enhance the secretion of growth factor, vasoactive factor and anti-inflammatory factor, improve the anti infection ability of human body, eliminate inflammation, promote angiogenesis and ulcer healing.
Sterile mesh film transparent dressing	Smith & Nephew	20162644490	Sterile mesh film transparent dressing (used for wound area measurement) 6 cm x 7 cm