基于甲醇的全支架制备用于视网膜神经节细胞的研究

摘要

甲醇可作为视网膜全膜制剂和长期储存的辅助固定培养基，可用于视网膜神经节细胞的研究。

摘要

视网膜神经节细胞（RGC）是视网膜的投射神经元，将外部视觉信息传播到大脑。RGCs的病理变化与许多视网膜退行性疾病密切相关。全卡口视网膜免疫染色经常用于RGC的实验研究，以评估视网膜的发育和病理状况。在某些情况下，一些有价值的视网膜样本，例如来自转基因小鼠的样本，可能需要长期保留，而不会影响RGC的形态或数量。为了获得可信和可重复的实验结果，使用有效的保存介质至关重要。在这里，我们描述了甲醇作为辅助固定培养基的作用，用于视网膜整体安装制备和长期储存。简而言之，在分离过程中，将冷甲醇（-20°C）移液到视网膜表面以帮助固定组织并促进其通透性，然后将视网膜储存在冷甲醇（-20°C）中，然后进行免疫染色。该协议描述了视网膜分离工作流程和组织样本储存协议，这对于RGC的研究是有用和实用的。

引言

视网膜神经节细胞（RGC）是视网膜中唯一的投射神经元，它们整合并将外部视觉信息传递给大脑¹。许多神经退行性疾病，如青光眼和创伤性视神经病变，其特征是^RGCs2，3的不可逆转的损伤和丧失。分析RGCs的形态和数量变化是确定神经退行性疾病如何发展和进展的关键步骤^4，5。

间接免疫荧光测定是一种广泛接受的监测蛋白质分布和细胞计数的方法。在实验室中，全卡口视网膜免疫染色通常用于RGCs的实验研究，以评估视网膜的生理和病理^状况6。用于整个视网膜中RGC定量的最常见标志物包括Brn3a，具有多次剪接的RNA结合蛋白（RBPMS）等7^，8。表征RGC的数量和分布需要高质量的全安装视网膜免疫染色。通常，在免疫染色方案中，视网膜在抗体中孵育之前浸入化学固定剂中。理想的固定剂不应改变细胞的形状、抗体表位的可及性或亲和力^{或组织的线性}尺寸9^，10

研究方案

除非另有说明，否则所有步骤均在室温下进行。所有使用的C57BL / 6J小鼠均从武汉大学实验动物中心获得，所有相关实验均由武汉大学动物实验伦理委员会批准。尽一切努力将小鼠的痛苦降到最低。

1. 眼球摘除和固定

1. 用二氧化碳窒息对小鼠实施安乐死，并使用无牙镊子轻轻地去除眼球。
2. 用磷酸盐缓冲盐水（PBS）冲洗眼球一次。
3. 在显微镜下用注射器针刺穿角膜处的眼球（目镜WF：10x/22;连续放大镜：0.67x-4.5x），以加速注视到眼球中并提高固定效率。
4. 转移到含有4%多聚甲醛（PFA）的24孔板中。
5. 将眼球固定在4%PFA中45分钟，然后将其转移到1x PBS中以立即去除多余的PFA（洗涤三次，每次5分钟）。

2. 视网膜隔离和扁平化

1. 将眼球转移到载玻片上，并将其置于解剖显微镜下（目镜WF：10x/22;连续放大镜：0.67x-4.5x）。
2. 一只手握住镊子，用它来夹住角膜的边缘，以防止眼球运动。用另一只手握住解剖剪刀，穿过角巩膜缘，在角膜周围切开约1毫米的深度。取下晶状体和玻璃体。
3. 将视盘保持在中心，并使用解剖剪刀沿四个象限放射状切割视网膜，达到视网膜半径的大约 2/3。
4. ....

讨论

固定是保护视网膜的重要步骤，这可能会影响任何基于形态的后续RGC研究。成功的固定可以快速捕获视网膜在暴露于固定介质时的结构和状态，这对于进一步分析至关重要。尽管甲醛被认为是组织和细胞固定和保存中最常见的固定剂之一，但对于某些研究而言，甲醛本身并不总是作为最佳化学固定剂起作用^10，14。不同种类的固定剂具有不同的沉淀氨基?.......

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
24-well cell culture cluster	Costar		Eyeball fixation
24-well hemagglutination plate	Labedit Company		Incubation antibody
Adhesion microscope slides	Citotest		Or similar
Anti-fluorescent quenching mountant	Servicebio	G1401	Slow down fluorescence quenching
BSA (bovine serum albumin)	Servicebio	GC305010	Blocking reagent
Confocal microscope	OLYMPUS		Apply 40x objective lens
Curved scissors	Jiangsu Kanghua Medical Equipment Co., Ltd.		Dissecting tools
Dissecting microscope	RWD Life science Co.,LTD	77001S	Dissecting tools
Forceps	Jiangsu Kanghua Medical Equipment Co., Ltd.		Dissecting tools
Methanol	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.	20210624	GC≥99.5%
Nail polish	SecheVite		Sealing agent
Needles	Shanghai Kindly Enterprises Development Group Co., Ltd.		Accelerate the fixation
Paraformaldehyde solution	Servicebio	G1101	Eyeball fixation
PBS (phosphate buffered saline pH 7.4)	Servicebio	G0002	Rinse the eyeball
Primary antibody: guinea pig anti-RNA-binding protein with multiple splicing (RBPMS)	PhosphoSolutions	Cat. #1832-RBPMS	For immunofluorescence. Used at 1:400
Secondary antibody: Cy3 affiniPure donkey anti-guinea pig IgG (H+L)	Jackson ImmunoResearch	706-165-148	For immunofluorescence. Used at 1:400
Straight scissors	Jiangsu Kanghua Medical Equipment Co., Ltd.		Dissecting tools