Retinal ganglion hücrelerinin araştırılması için metanol bazlı tam montajlı preparat

Özet

Metanol, retinal ganglion hücrelerinin araştırılması için yararlı olan retinal tüm montaj preparatları ve uzun süreli depolama için yardımcı bir sabit ortam olarak kullanılabilir.

Özet

Retinanın projeksiyon nöronları olan retinal ganglion hücreleri (RGC'ler), dış görsel bilgiyi beyne yayar. RGC'lerdeki patolojik değişiklikler çok sayıda retinal dejeneratif hastalık ile yakın ilişki içindedir. Tam montajlı retinal immün boyama, retinanın gelişimsel ve patolojik durumlarını değerlendirmek için RGC'ler üzerine yapılan deneysel çalışmalarda sıklıkla kullanılmaktadır. Bazı koşullar altında, transgenik farelerden alınanlar gibi bazı değerli retina örneklerinin, RGC'lerin morfolojisini veya sayısını etkilemeden uzun süre tutulması gerekebilir. Güvenilir ve tekrarlanabilir deneysel sonuçlar için, etkili bir koruma ortamı kullanmak esastır. Burada, metanolün retinal tüm montaj preparatları ve uzun süreli depolama için yardımcı bir sabit ortam olarak etkisini açıklıyoruz. Kısacası, izolasyon işlemi sırasında, dokuların sabitlenmesine ve geçirgenliklerinin kolaylaştırılmasına yardımcı olmak için retina yüzeyine soğuk metanol (-20 ° C) pipetlenir ve daha sonra retinalar immün boyanmadan önce soğuk metanol (-20 ° C) içinde saklanabilir. Bu protokol, RGC'lerin araştırılması için yararlı ve pratik olan retina izolasyon iş akışını ve doku örneği depolama protokolünü açıklar.

Giriş

Retinal ganglion hücreleri (RGC'ler) retinadaki tek projeksiyon nöronlarıdır ve dış görsel bilgileri beyne entegre eder ve iletirler¹. Glokom ve travmatik optik nöropati gibi birçok nörodejeneratif hastalık, geri dönüşümsüz hasar ve RGC ^2,3 kaybı ile karakterizedir. RGC'lerin morfolojik ve kantitatif değişikliklerinin analiz edilmesi, nörodejeneratif hastalıkların nasıl geliştiğini ve ilerlediğini belirlemede çok önemli bir adımdır ^4,5.

Dolaylı immünofloresan testi, proteinlerin dağılımını ve hücre sa....

Protokol

Aksi belirtilmedikçe tüm adımlar oda sıcaklığında gerçekleştirilir. Kullanılan tüm C57BL / 6J fareleri, Wuhan Üniversitesi Laboratuvar Hayvanları Merkezi'nden elde edildi ve ilgili tüm deneyler Wuhan Üniversitesi Hayvan Deneyleri Etiği Komitesi tarafından onaylandı. Farelerin acısını en aza indirmek için tüm çabalar gösterildi.

1. Gözlerin enükleasyonu ve sabitlenmesi

1. Fareleri karbondioksit boğulması ile ötenazi yapın ve dişsiz cımbız kullanarak göz küresini nazikçe süklee edin.
2. Göz küresini fosfat tamponlu salin (PBS) içinde bir kez durulayın.
3. Göz küresine fiksasyonu hızlandırmak ve sabitleme ....

Tartışmalar

Fiksasyon, retinayı korumak için önemli bir adımdır ve morfolojiye dayalı sonraki RGC araştırmalarını etkileyebilir. Başarılı fiksasyon, retinaların yapısını ve durumunu, daha fazla analiz için kritik olan sabitleme ortamına maruz bıraktıkları anda hızla yakalar. Formaldehit, doku ve hücre fiksasyonu ve korunması için en yaygın sabitleme ajanlarından biri olarak kabul edilmesine rağmen, formaldehit tek başına bazı araştırmalar için en uygun kimyasal fiksatif olarak her zaman iyi çalı?.......

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
24-well cell culture cluster	Costar		Eyeball fixation
24-well hemagglutination plate	Labedit Company		Incubation antibody
Adhesion microscope slides	Citotest		Or similar
Anti-fluorescent quenching mountant	Servicebio	G1401	Slow down fluorescence quenching
BSA (bovine serum albumin)	Servicebio	GC305010	Blocking reagent
Confocal microscope	OLYMPUS		Apply 40x objective lens
Curved scissors	Jiangsu Kanghua Medical Equipment Co., Ltd.		Dissecting tools
Dissecting microscope	RWD Life science Co.,LTD	77001S	Dissecting tools
Forceps	Jiangsu Kanghua Medical Equipment Co., Ltd.		Dissecting tools
Methanol	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.	20210624	GC≥99.5%
Nail polish	SecheVite		Sealing agent
Needles	Shanghai Kindly Enterprises Development Group Co., Ltd.		Accelerate the fixation
Paraformaldehyde solution	Servicebio	G1101	Eyeball fixation
PBS (phosphate buffered saline pH 7.4)	Servicebio	G0002	Rinse the eyeball
Primary antibody: guinea pig anti-RNA-binding protein with multiple splicing (RBPMS)	PhosphoSolutions	Cat. #1832-RBPMS	For immunofluorescence. Used at 1:400
Secondary antibody: Cy3 affiniPure donkey anti-guinea pig IgG (H+L)	Jackson ImmunoResearch	706-165-148	For immunofluorescence. Used at 1:400
Straight scissors	Jiangsu Kanghua Medical Equipment Co., Ltd.		Dissecting tools