Methanol-basiertes Whole-Mount-Präparat zur Untersuchung retinaler Ganglienzellen

Zusammenfassung

Methanol kann als fixes Hilfsmedium für retinale Whole-Mount-Präparate und die Langzeitlagerung verwendet werden, was für die Untersuchung von retinalen Ganglienzellen nützlich ist.

Zusammenfassung

Retinale Ganglienzellen (RGCs), die Projektionsneuronen der Netzhaut, leiten externe visuelle Informationen an das Gehirn weiter. Pathologische Veränderungen der RGCs stehen in engem Zusammenhang mit zahlreichen degenerativen Erkrankungen der Netzhaut. Die Whole-Mount-Immunfärbung der Netzhaut wird häufig in experimentellen Studien an RGCs eingesetzt, um die Entwicklungs- und pathologischen Bedingungen der Netzhaut zu bewerten. Unter bestimmten Umständen müssen einige wertvolle Netzhautproben, z. B. von transgenen Mäusen, über einen langen Zeitraum aufbewahrt werden, ohne die Morphologie oder Anzahl der RGCs zu beeinträchtigen. Für glaubwürdige und reproduzierbare experimentelle Ergebnisse ist die Verwendung eines effektiven Konservierungsmediums unerlässlich. Hier beschreiben wir die Wirkung von Methanol als fixes Hilfsmedium für retinale Whole-Mount-Präparate und die Langzeitlagerung. Kurz gesagt, während des Isolationsprozesses wird kaltes Methanol (−20 °C) auf die Oberfläche der Netzhaut pipettiert, um das Gewebe zu fixieren und seine Durchlässigkeit zu erleichtern, und dann kann die Netzhaut in kaltem Methanol (−20 °C) gelagert werden, bevor sie immungefärbt wird. Dieses Protokoll beschreibt den Arbeitsablauf für die Netzhautisolierung und die Lagerung von Gewebeproben, die für die Untersuchung von RGCs nützlich und praktisch sind.

Einleitung

Retinale Ganglienzellen (RGCs) sind die einzigen Projektionsneuronen in der Netzhaut, und sie integrieren und übertragen visuelle Informationen von außen an das Gehirn¹. Viele neurodegenerative Erkrankungen wie das Glaukom und die traumatische Optikusneuropathie sind durch irreversible Schädigung und Verlust von RGCs gekennzeichnet ^2,3. Die Analyse der morphologischen und quantitativen Veränderungen von RGCs ist ein entscheidender Schritt, um zu bestimmen, wie neurodegenerative Erkrankungen entstehen und fortschreiten ^4,5.

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Protokoll

Alle Schritte werden bei Raumtemperatur durchgeführt, sofern nicht anders angegeben. Alle verwendeten C57BL/6J-Mäuse stammen aus dem Versuchstierzentrum der Universität Wuhan, und alle damit verbundenen Experimente wurden vom Komitee für die Ethik von Tierversuchen der Universität Wuhan genehmigt. Es wurden alle Anstrengungen unternommen, um das Leiden der Mäuse zu minimieren.

1. Enukleation und Fixierung der Augen

1. Einschläfern Sie die Mäuse mit Kohlendioxid-Erstickung ein und entkernen Sie den Augapfel sanft mit einer zahnlosen Pinzette.
2. Spülen Sie den Augapfel einmal in phosphatgepufferter Kochsalzlösu....

Diskussion

Die Fixierung ist ein wesentlicher Schritt zur Erhaltung der Netzhaut, der sich auf nachfolgende RGC-Untersuchungen auf der Grundlage der Morphologie auswirken kann. Eine erfolgreiche Fixation erfasst schnell die Struktur und den Zustand der Netzhaut in dem Moment, in dem sie dem Fixiermedium ausgesetzt wird, was für die weitere Analyse entscheidend ist. Obwohl Formaldehyd als eines der gebräuchlichsten Fixiermittel für die Fixierung und Konservierung von Gewebe und Zellen angesehen wird, eignet sich Formaldehyd allei.......

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
24-well cell culture cluster	Costar		Eyeball fixation
24-well hemagglutination plate	Labedit Company		Incubation antibody
Adhesion microscope slides	Citotest		Or similar
Anti-fluorescent quenching mountant	Servicebio	G1401	Slow down fluorescence quenching
BSA (bovine serum albumin)	Servicebio	GC305010	Blocking reagent
Confocal microscope	OLYMPUS		Apply 40x objective lens
Curved scissors	Jiangsu Kanghua Medical Equipment Co., Ltd.		Dissecting tools
Dissecting microscope	RWD Life science Co.,LTD	77001S	Dissecting tools
Forceps	Jiangsu Kanghua Medical Equipment Co., Ltd.		Dissecting tools
Methanol	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.	20210624	GC≥99.5%
Nail polish	SecheVite		Sealing agent
Needles	Shanghai Kindly Enterprises Development Group Co., Ltd.		Accelerate the fixation
Paraformaldehyde solution	Servicebio	G1101	Eyeball fixation
PBS (phosphate buffered saline pH 7.4)	Servicebio	G0002	Rinse the eyeball
Primary antibody: guinea pig anti-RNA-binding protein with multiple splicing (RBPMS)	PhosphoSolutions	Cat. #1832-RBPMS	For immunofluorescence. Used at 1:400
Secondary antibody: Cy3 affiniPure donkey anti-guinea pig IgG (H+L)	Jackson ImmunoResearch	706-165-148	For immunofluorescence. Used at 1:400
Straight scissors	Jiangsu Kanghua Medical Equipment Co., Ltd.		Dissecting tools