Methanol-basiertes Whole-Mount-Präparat zur Untersuchung retinaler Ganglienzellen

Zusammenfassung

Methanol kann als fixes Hilfsmedium für retinale Whole-Mount-Präparate und die Langzeitlagerung verwendet werden, was für die Untersuchung von retinalen Ganglienzellen nützlich ist.

Zusammenfassung

Retinale Ganglienzellen (RGCs), die Projektionsneuronen der Netzhaut, leiten externe visuelle Informationen an das Gehirn weiter. Pathologische Veränderungen der RGCs stehen in engem Zusammenhang mit zahlreichen degenerativen Erkrankungen der Netzhaut. Die Whole-Mount-Immunfärbung der Netzhaut wird häufig in experimentellen Studien an RGCs eingesetzt, um die Entwicklungs- und pathologischen Bedingungen der Netzhaut zu bewerten. Unter bestimmten Umständen müssen einige wertvolle Netzhautproben, z. B. von transgenen Mäusen, über einen langen Zeitraum aufbewahrt werden, ohne die Morphologie oder Anzahl der RGCs zu beeinträchtigen. Für glaubwürdige und reproduzierbare experimentelle Ergebnisse ist die Verwendung eines effektiven Konservierungsmediums unerlässlich. Hier beschreiben wir die Wirkung von Methanol als fixes Hilfsmedium für retinale Whole-Mount-Präparate und die Langzeitlagerung. Kurz gesagt, während des Isolationsprozesses wird kaltes Methanol (−20 °C) auf die Oberfläche der Netzhaut pipettiert, um das Gewebe zu fixieren und seine Durchlässigkeit zu erleichtern, und dann kann die Netzhaut in kaltem Methanol (−20 °C) gelagert werden, bevor sie immungefärbt wird. Dieses Protokoll beschreibt den Arbeitsablauf für die Netzhautisolierung und die Lagerung von Gewebeproben, die für die Untersuchung von RGCs nützlich und praktisch sind.

Einleitung

Retinale Ganglienzellen (RGCs) sind die einzigen Projektionsneuronen in der Netzhaut, und sie integrieren und übertragen visuelle Informationen von außen an das Gehirn¹. Viele neurodegenerative Erkrankungen wie das Glaukom und die traumatische Optikusneuropathie sind durch irreversible Schädigung und Verlust von RGCs gekennzeichnet ^2,3. Die Analyse der morphologischen und quantitativen Veränderungen von RGCs ist ein entscheidender Schritt, um zu bestimmen, wie neurodegenerative Erkrankungen entstehen und fortschreiten ^4,5.

Der indirekte Immunfluoreszenz-Assay ist eine weithin anerkannte Methode zur Überwachung der Verteilung von Proteinen und der Zellzählung. Im Labor wird die Whole-Mount-Immunfärbung der Netzhaut häufig in experimentellen Studien an RGCs verwendet, um die physiologischen und pathologischen Bedingungen der Netzhaut zu bewerten⁶. Zu den gebräuchlichsten Markern, die für die RGC-Quantifizierung in der gesamten Netzhaut verwendet werden, gehören Brn3a, RNA-bindendes Protein mit multiplem Spleißen (RBPMS) usw. ^7,8. Die Charakterisierung der Menge und Verteilung von RGCs erfordert eine qualitativ hochwertige Immunfärbung der gesamten Netzhaut. Im Allgemeinen wird die Netzhaut bei Immunfärbeprotokollen in chemische Fixiermittel getaucht, bevor sie in Antikörpern inkubiert wird. Ideale Fixiermittel sollten die Form der Zellen, die Zugänglichkeit oder Affinität der Epitope für Antikörper oder die linearen Abmessungen des Gewebes nicht verändern ^9,10.

Aufgrund der komplexen Struktur der Netzhaut treten bei der Herstellung eines Whole-Mount-Netzhautpflasters häufig Probleme wie Fragilität und Faltung der Netzhaut sowie einige häufige Schwierigkeiten wie Zellschrumpfung und unklare Zellkerne auf, was sich negativ auf die experimentelle Forschung auswirkt. Darüber hinaus werden nicht alle Netzhäute sofort immungefärbt, insbesondere wenn es sich um die Netzhaut von transgenen Mäusen handelt, die zu teuren Preisen wertvoller Herkunft sind, was die Konservierung der zusätzlichen Netzhautproben für die weitere Verwendung erforderlich macht.

Die geeignete Fixierlösung kann das Gewebe schnell fixieren, eine Gewebeautolyse vermeiden, die normale Morphologie und Struktur der Gewebezellen erhalten und die Antigenität von Proteinen und anderen Substanzen erhalten¹⁰. Gegenwärtig wird die Fixierung auf Formaldehydbasis häufig in verschiedenen Geweben eingesetzt, darunter getrennte Netzhaut, halbgeschnittene Augenmuscheln und ganze Augäpfel¹⁰. Die Schrumpfung des Gewebes und die morphologische Veränderung von Zellen sind die beiden entscheidenden Herausforderungen, die nach dem Eintauchen in Formaldehyd^{auftreten 11}. Darüber hinaus werden zunehmend modifizierte Fixierungsformulierungen entwickelt, um die Erhaltung der ursprünglichen Eigenschaften der Netzhaut und der Zielzellen zu maximieren ^9,10. Verschiedene Netzhautfixationsbehandlungen können die Netzhautstruktur, die Proteinimmunogenität, die Fluoreszenzanregung und den Abschwächungslöschzyklus unterschiedlich beeinflussen^12,13. Netzhäute, die mit Davidson-Lösung fixiert wurden, sind morphologisch intakter als solche, die mit Formalin fixiert wurden, aber Davidsons Lösung ist weniger kompatibel mit einigen Antikörpern, wie z. B. dem Mikroglia-Marker-ionisierten Kalzium-bindenden Adaptermolekül 1¹². Angesichts der Zerbrechlichkeit der Netzhaut würden sich die Forscher natürlich fragen, ob sich die Integrität der Netzhaut sowie die Eigenschaften und die Morphologie der Zielzellen nach längerer Lagerung verändern werden. Über die möglichen Auswirkungen der Fixierlösung auf die Morphologie der Netzhaut und der RGC-Zellen nach mehrmonatiger Lagerung wurde jedoch nur selten berichtet. Die Optimierung der Netzhautfixierung ist entscheidend für die Beurteilung und Erhaltung von RGCs.

Wir bieten eine detaillierte Beschreibung einer zuverlässigen und technisch unkomplizierten Methode, die wir für die Total-Mount-Färbung der murinen Netzhaut verwenden. Unsere Methode legt den Schwerpunkt auf die richtige Präparation und Lagerung von Netzhäuten für die RGC-Untersuchung, wobei die Notwendigkeit der Langzeitlagerung von Netzhautgewebe sowie spezifische Aspekte der Fluorophorbildung oder des Fluorophorabbaus berücksichtigt werden.

Protokoll

Alle Schritte werden bei Raumtemperatur durchgeführt, sofern nicht anders angegeben. Alle verwendeten C57BL/6J-Mäuse stammen aus dem Versuchstierzentrum der Universität Wuhan, und alle damit verbundenen Experimente wurden vom Komitee für die Ethik von Tierversuchen der Universität Wuhan genehmigt. Es wurden alle Anstrengungen unternommen, um das Leiden der Mäuse zu minimieren.

1. Enukleation und Fixierung der Augen

1. Einschläfern Sie die Mäuse mit Kohlendioxid-Erstickung ein und entkernen Sie den Augapfel sanft mit einer zahnlosen Pinzette.
2. Spülen Sie den Augapfel einmal in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) aus.
3. Punktieren Sie den Augapfel mit einer Spritzennadel an der Hornhaut unter dem Mikroskop (Okular WF: 10x/22; kontinuierliches Vergrößerungsobjektiv: 0,67x-4,5x), um die Fixierung in den Augapfel zu beschleunigen und die Fixiereffizienz zu verbessern.
4. Transfer auf eine 24-Well-Platte mit 4 % Paraformaldehyd (PFA).
5. Fixieren Sie den Augapfel 45 Minuten lang in 4% PFA und übertragen Sie ihn dann auf 1x PBS, um überschüssiges PFA (dreimal waschen, 5 min/Zeit) sofort zu entfernen.

2. Isolierung und Abflachung der Netzhaut

1. Übertragen Sie den Augapfel auf einen Objektträger und legen Sie ihn unter ein Präpariermikroskop (Okular WF: 10x/22; Objektiv mit kontinuierlicher Vergrößerung: 0,67x-4,5x).
2. Halten Sie die Pinzette in einer Hand und klemmen Sie damit den Rand der Hornhaut ab, um eine Bewegung des Augapfels zu verhindern. Halten Sie die Präparierschere mit der anderen Hand fest und schneiden Sie in ca. 1 mm Tiefe um die Hornhaut herum durch den Hornhaut-Limbus. Entfernen Sie die Linse und den Glaskörper.
3. Halten Sie die Papille in der Mitte und schneiden Sie die Netzhaut mit einer Präparierschere radial entlang der vier Quadranten, wobei Sie etwa 2/3 des Radius der Netzhaut erreichen.
4. Klemmen Sie eine der Sklerakanten mit einer gezahnten Pinzette. Halten Sie mit der anderen Hand den Rand der Sklera mit einer unverzahnten Pinzette fest und bewegen Sie sich von der Stelle, an der die Sklera durch die gezahnte Zange fixiert ist, zur Basis der Sklera. Schälen Sie die Netzhaut vorsichtig.
5. Ziehen Sie PBS mit einer Pipette (200 μl) ab, um die Netzhaut zu spülen und zu befeuchten, und entfernen Sie dann überschüssiges PBS mit einem kleinen Stück saugfähigem Papier. Glätten Sie die Netzhaut bei Bedarf vorsichtig mit einer kleinen Borstenbürste.
6. Kaltes Methanol (vorgekühlt in einem −20°C Gefrierschrank) langsam tropfenweise auf die Innenfläche der Netzhaut pipettieren (das Methanolvolumen ist nicht fixiert, solange die Netzhaut vollständig vom Methanol bedeckt werden kann). Die Netzhaut verfärbt sich weiß und entwickelt eine erhöhte Zähigkeit.
7. Glätten Sie die Netzhaut sanft und entfernen Sie Verunreinigungen wie Restpigmentmembranen und den Glaskörper mit kleinen Borstenbürsten. Drehen Sie die Netzhaut mit kleinen Borstenbürsten um und wiederholen Sie den oben genannten Vorgang.
8. Übertragen Sie die mit Methanol behandelte Netzhaut in eine Vertiefung einer 24-Well-Platte und halten Sie sie in Methanol getränkt.
9. Lagern Sie es 1-2 h lang bei −20 °C für eine sofortige Immunfärbung oder lassen Sie die Netzhaut in Methanol und lagern Sie es zur Langzeitlagerung bei −20 °C.
10. Entfernen Sie das Methanol von der 24-Well-Platte und spülen Sie die Netzhaut mit 1x PBS.

3. Immunfluoreszenzfärbung der RGCs

1. Übertragen Sie die Netzhaut vorsichtig mit einer Pasteurpipette aus Kunststoff auf eine 24-Well-Hämagglutinationsplatte und blockieren Sie sie in 5 % PBS-TX-BSA (5 g Rinderserumalbuminpulver, gelöst in 100 ml 1x PBST-Lösung; das PBST wird durch Zugabe von 10 ml Triton X-100 zu 2.000 ml 1 x PBS) bei Raumtemperatur für 4 h oder über Nacht bei 4 °C. Halte das Ganglion mit der Seite nach oben.
2. Entfernen Sie das PBS-TX-BSA und inkubieren Sie die Netzhaut bei 4 °C für 48-96 h, wobei 100 μl des ausgewählten Primärantikörpers (Meerschweinchen-Anti-RBPMS-Antikörper) in einer Verdünnung von 1:400 hinzugefügt werden.
3. Entfernen Sie den primären Antikörper und spülen Sie die Netzhaut dreimal (jeweils 20 Minuten) mit 1x PBS unter Schütteln bei Raumtemperatur.
4. Inkubation der Netzhaut unter leichtem Schütteln über Nacht bei 4 °C mit 100 μL des entsprechenden Sekundärantikörpers (siehe Materialtabelle), Cyanin Cy3 affiniPure Esel Anti-Meerschweinchen IgG (H+L), in einer Verdünnung von 1:400.
5. Spülen Sie die Netzhaut dreimal (je 20 min) mit 1x PBS.
6. Legen Sie die Netzhaut flach mit der Ganglienzellschicht nach oben auf den Objektträger, tropfen Sie mit einer Pipette eine angemessene Menge Antifluoreszenzlöschmittel um die Netzhaut und decken Sie den Objektträger mit einem Deckglas ab (achten Sie darauf, dass keine Blasen entstehen).
   Anmerkungen: Um die geeignete Menge an Anti-Fluoreszenz-Quencher zu bestimmen, stellen Sie sicher, dass sie die gesamte Netzhaut bedeckt. Decken Sie danach den Objektträger ab, ohne dass die Netzhaut schweben und sich leicht bewegen kann.
7. Versiegeln Sie den Objektträger rundum mit einem Dichtungsmittel, um ein Verrutschen zu verhindern. Lagern Sie die Proben bei −20 °C und schützen Sie sie vor Licht.
8. Stellen Sie die Netzhaut mit einem Fluoreszenz-/Konfokalmikroskop dar.

Ergebnisse

Nach der Präparation sollte die Netzhaut wie ein flaches vierblättriges Kleeblatt aussehen. In dieser Studie wurde die Netzhaut nach der Zugabe von Methanol nach Anwendung des oben beschriebenen Protokolls weiß (Abbildung 1). Währenddessen veränderte sich die Netzhaut von weich zu biegsam und flach. Als nächstes wurden die RGCs mit Anti-RBPMS⁸ gekennzeichnet. Vier Bildfelder wurden in der Whole-Mount-Netzhaut (n = 3) mit einem konfokalen Mikroskop (Okular: 10x; ...

Diskussion

Die Fixierung ist ein wesentlicher Schritt zur Erhaltung der Netzhaut, der sich auf nachfolgende RGC-Untersuchungen auf der Grundlage der Morphologie auswirken kann. Eine erfolgreiche Fixation erfasst schnell die Struktur und den Zustand der Netzhaut in dem Moment, in dem sie dem Fixiermedium ausgesetzt wird, was für die weitere Analyse entscheidend ist. Obwohl Formaldehyd als eines der gebräuchlichsten Fixiermittel für die Fixierung und Konservierung von Gewebe und Zellen angesehen wird, eignet sich Formaldehyd allei...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
24-well cell culture cluster	Costar		Eyeball fixation
24-well hemagglutination plate	Labedit Company		Incubation antibody
Adhesion microscope slides	Citotest		Or similar
Anti-fluorescent quenching mountant	Servicebio	G1401	Slow down fluorescence quenching
BSA (bovine serum albumin)	Servicebio	GC305010	Blocking reagent
Confocal microscope	OLYMPUS		Apply 40x objective lens
Curved scissors	Jiangsu Kanghua Medical Equipment Co., Ltd.		Dissecting tools
Dissecting microscope	RWD Life science Co.,LTD	77001S	Dissecting tools
Forceps	Jiangsu Kanghua Medical Equipment Co., Ltd.		Dissecting tools
Methanol	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.	20210624	GC≥99.5%
Nail polish	SecheVite		Sealing agent
Needles	Shanghai Kindly Enterprises Development Group Co., Ltd.		Accelerate the fixation
Paraformaldehyde solution	Servicebio	G1101	Eyeball fixation
PBS (phosphate buffered saline pH 7.4)	Servicebio	G0002	Rinse the eyeball
Primary antibody: guinea pig anti-RNA-binding protein with multiple splicing (RBPMS)	PhosphoSolutions	Cat. #1832-RBPMS	For immunofluorescence. Used at 1:400
Secondary antibody: Cy3 affiniPure donkey anti-guinea pig IgG (H+L)	Jackson ImmunoResearch	706-165-148	For immunofluorescence. Used at 1:400
Straight scissors	Jiangsu Kanghua Medical Equipment Co., Ltd.		Dissecting tools