망막 신경절 세포 조사를 위한 메탄올 기반 전체 마운트 준비

요약

메탄올은 망막 전체 마운트 제제 및 장기 보관을 위한 보조 고정 배지로 사용할 수 있으며, 이는 망막 신경절 세포의 조사에 유용합니다.

초록

망막의 투영 뉴런인 망막 신경절 세포(RGC)는 외부 시각 정보를 뇌로 전파합니다. RGC의 병리학 적 변화는 수많은 망막 퇴행성 질환과 밀접한 관련이 있습니다. 전체 마운트 망막 면역염색은 망막의 발달 및 병리학적 상태를 평가하기 위해 RGC에 대한 실험적 연구에서 자주 사용됩니다. 어떤 상황에서는 형질전환 마우스의 샘플과 같은 일부 귀중한 망막 샘플을 RGC의 형태나 수에 영향을 미치지 않고 장기간 보관해야 할 수도 있습니다. 신뢰할 수 있고 재현 가능한 실험 결과를 위해서는 효과적인 보존 배지를 사용하는 것이 필수적입니다. 여기에서 우리는 망막 전체 장착 준비 및 장기 보관을 위한 보조 고정 배지로서의 메탄올의 효과를 설명합니다. 간단히 말해서, 분리 과정에서 차가운 메탄올(-20°C)을 망막 표면에 피펫팅하여 조직을 고정하고 투과성을 촉진한 다음 망막을 면역염색하기 전에 차가운 메탄올(-20°C)에 보관할 수 있습니다. 이 프로토콜은 RGC 조사에 유용하고 실용적인 망막 분리 워크플로 및 조직 샘플 보관 프로토콜을 설명합니다.

서문

망막 신경절 세포(Retinal ganglion cell, RGC)는 망막에 있는 유일한 투영 뉴런으로, 외부 시각 정보를 통합하여 뇌에 전달한다¹. 녹내장 및 외상성 시신경병증과 같은 많은 신경퇴행성 질환은 비가역적 손상과 RGC의 손실을 특징으로 한다 ^2,3. RGC의 형태학적 및 정량적 변화를 분석하는 것은 신경퇴행성 질환이 어떻게 발생하고 진행되는지를 결정하는 중요한 단계입니다 ^4,5.

간접 면역형광 분석은 단백질 분포 및 세포 계수를 모니터링하는 데 널리 사용되는 방법입니다. 실험실에서 망막의 생리학적 및 병리학적 상태를 평가하기 위해 RGC에 대한 실험적 연구에서 전체 마운트 망막 면역염색법이 일반적으로 사용됩니다⁶. 전체 망막에서 RGC 정량화에 사용되는 가장 일반적인 마커는 Brn3a, 다중 스플라이싱을 갖는 RNA 결합 단백질(RBPMS) 등을 포함합니다 ^7,8

프로토콜

모든 단계는 달리 지시되지 않는 한 실온에서 수행됩니다. 사용된 모든 C57BL/6J 마우스는 우한대학교 동물실험센터에서 입수하였으며, 모든 관련 실험은 우한대학교 동물실험윤리위원회의 승인을 받았다. 생쥐의 고통을 최소화하기 위해 모든 노력을 기울였습니다.

1. 눈의 적출 및 고정

1. 생쥐를 이산화탄소 질식으로 안락사시키고 이빨이 없는 핀셋을 사용하여 안구를 부드럽게 적출합니다.
2. 인산염 완충 식염수(PBS)로 안구를 한 번 헹굽니다.
3. 현미경으로 각막에 주사기 바늘로 안구를 뚫습니다(접안렌즈 WF: 10x/22, 연속 배율 대물렌즈: 0.67x-4.5x) 안구로의 고정을 가속화하고 고정 효율을 향상시킵니다.
4. 4% 파라포름알데히드(PFA)를 함유한 24웰 플레이트로 옮깁니다.
5. 안구를 4% PFA에 45분 동안 고정한 다음 1x PBS로 옮겨 과잉 PFA를 즉시 제거합니다(3회 세척, 5분/회).

2. 망막 분리 및 평탄화

1. 안구를 유리 슬라이드로 옮기고 해부 현미경(접안렌즈 WF: 10x/22, 연속 배율 대물렌즈: 0.67x....

토론

고정은 망막을 보존하기 위한 필수 단계이며, 이는 형태학을 기반으로 한 후속 RGC 조사에 영향을 미칠 수 있습니다. 성공적인 고정은 망막을 고정 매체에 노출시키는 순간 망막의 구조와 상태를 빠르게 포착하며, 이는 추가 분석에 중요합니다. 포름 알데히드는 조직 및 세포 고정 및 보존을위한 가장 일반적인 고정제 중 하나로 간주되어 왔지만, 포름 알데히드만으로는 일부 조사에서 최적의 화학.......

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
24-well cell culture cluster	Costar		Eyeball fixation
24-well hemagglutination plate	Labedit Company		Incubation antibody
Adhesion microscope slides	Citotest		Or similar
Anti-fluorescent quenching mountant	Servicebio	G1401	Slow down fluorescence quenching
BSA (bovine serum albumin)	Servicebio	GC305010	Blocking reagent
Confocal microscope	OLYMPUS		Apply 40x objective lens
Curved scissors	Jiangsu Kanghua Medical Equipment Co., Ltd.		Dissecting tools
Dissecting microscope	RWD Life science Co.,LTD	77001S	Dissecting tools
Forceps	Jiangsu Kanghua Medical Equipment Co., Ltd.		Dissecting tools
Methanol	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.	20210624	GC≥99.5%
Nail polish	SecheVite		Sealing agent
Needles	Shanghai Kindly Enterprises Development Group Co., Ltd.		Accelerate the fixation
Paraformaldehyde solution	Servicebio	G1101	Eyeball fixation
PBS (phosphate buffered saline pH 7.4)	Servicebio	G0002	Rinse the eyeball
Primary antibody: guinea pig anti-RNA-binding protein with multiple splicing (RBPMS)	PhosphoSolutions	Cat. #1832-RBPMS	For immunofluorescence. Used at 1:400
Secondary antibody: Cy3 affiniPure donkey anti-guinea pig IgG (H+L)	Jackson ImmunoResearch	706-165-148	For immunofluorescence. Used at 1:400
Straight scissors	Jiangsu Kanghua Medical Equipment Co., Ltd.		Dissecting tools