Preparação de montagem inteira à base de metanol para a investigação de células ganglionares da retina

Resumo

O metanol pode ser usado como um meio fixo auxiliar para preparações retinianas de montagem completa e armazenamento a longo prazo, o que é útil para a investigação de células ganglionares da retina.

Resumo

As células ganglionares da retina (RGCs), que são os neurônios de projeção da retina, propagam informações visuais externas para o cérebro. As alterações patológicas nos CGRs têm estreita relação com inúmeras doenças degenerativas da retina. A imunomarcação retiniana de montagem total é frequentemente usada em estudos experimentais em CGRs para avaliar as condições de desenvolvimento e patologias da retina. Em algumas circunstâncias, algumas amostras valiosas de retina, como as de camundongos transgênicos, podem precisar ser retidas por um longo período sem afetar a morfologia ou o número de RGCs. Para resultados experimentais confiáveis e reprodutíveis, o uso de um meio de preservação eficaz é essencial. Aqui, descrevemos o efeito do metanol como um meio fixo auxiliar para preparações retinianas de montagem completa e armazenamento a longo prazo. Em resumo, durante o processo de isolamento, o metanol frio (-20 °C) é pipetado na superfície da retina para ajudar a fixar os tecidos e facilitar sua permeabilidade, e então as retinas podem ser armazenadas em metanol frio (-20 °C) antes de serem imunomarcadas. Este protocolo descreve o fluxo de trabalho de isolamento da retina e o protocolo de armazenamento de amostras de tecido, que é útil e prático para a investigação de CGRs.

Introdução

As células ganglionares da retina (CGRs) são os únicos neurônios de projeção na retina, integrando-se e transmitindo informações visuais externas ao cérebro¹. Muitas doenças neurodegenerativas, como o glaucoma e a neuropatia óptica traumática, são caracterizadas por danos irreversíveis e perda de^{CGRs 2,3}. Analisar as alterações morfológicas e quantitativas dos CGRs é um passo crucial para determinar como as doenças neurodegenerativas se desenvolvem e avançam ^4,5.

O ensaio de imunofluorescência indireta é um método amplamente aceito para monitorar a distribuição de proteínas e contagem celular. Em laboratório, a imunomarcação retiniana de montagem total é comumente utilizada em estudos experimentais em CGRs para avaliar as condições fisiológicas e patológicas da^retina6. Os marcadores mais comuns utilizados para quantificação de RGC em toda a retina incluem Brn3a, RNA binding protein with multiple splicing (RBPMS), e assim por diante ^7,8. A caracterização da quantidade e distribuição dos RGCs requer imunomarcação retiniana de alta qualidade em toda a montagem. Geralmente, nos protocolos de imunomarcação, a retina é imersa em fixadores químicos antes de ser incubada em anticorpos. Os fixadores ideais não devem alterar a forma das células, a acessibilidade ou afinidade dos epítopos por anticorpos ou as dimensões lineares do tecido ^9,10.

Devido à estrutura complexa da retina, problemas como fragilidade e dobramento da retina, bem como algumas dificuldades comuns, incluindo encolhimento celular e núcleos obscuros, são propensos a ocorrer ao fazer um adesivo de retina de montagem inteira, o que tem um impacto negativo na pesquisa experimental. Além disso, nem todas as retinas são imunomarcadas imediatamente, especialmente quando se trata de retinas de camundongos transgênicos com preços caros e de origem preciosa, exigindo a preservação das amostras extras de retina para uso posterior.

A solução fixadora apropriada pode fixar o tecido rapidamente, evitar a autólise tecidual, preservar a morfologia e a estrutura normais das células teciduais e manter a antigenicidade de proteínas e outras substâncias¹⁰. Atualmente, a fixação à base de formaldeído tem sido amplamente utilizada em vários tecidos, incluindo retinas separadas, copos hemisseccionados e globos oculares inteiros¹⁰. A retração tecidual e a alteração morfológica das células são os dois desafios críticos encontrados após a imersão em formaldeído¹¹. Além disso, formulações de fixação modificadas estão surgindo cada vez mais para maximizar a retenção das propriedades originais da retina e das células-alvo ^9,10. Diferentes tratamentos de fixação retiniana podem afetar a estrutura retiniana, a imunogenicidade de proteínas, a excitação da fluorescência e o ciclo de têmpera da atenuação de forma diferente^12,13. As retinas fixadas com solução de Davidson são morfologicamente mais intactas quando comparadas àquelas fixadas com formalina, mas a solução de Davidson é menos compatível com alguns anticorpos, como a molécula adaptadora de ligação de cálcio ionizada a marcadores microgliais 1¹². Considerando a natureza frágil das retinas, os pesquisadores naturalmente se perguntariam se a integridade da retina, bem como as propriedades e a morfologia das células-alvo, mudarão após o armazenamento de longo prazo. No entanto, os possíveis efeitos da solução de fixação na morfologia das células retinianas e RGC após o armazenamento por vários meses foram raramente relatados. A otimização da fixação retiniana é fundamental para a avaliação e preservação dos CGRs.

Fornecemos uma descrição detalhada de um método confiável e tecnicamente simples que usamos para coloração de retina murina de montagem total. Nosso método enfatiza o preparo e armazenamento adequado de retinas para investigação de CGR, levando em consideração a necessidade de armazenamento em longo prazo do tecido retiniano, bem como aspectos específicos da formação ou degradação de fluoróforos.

Protocolo

Todas as etapas são realizadas à temperatura ambiente, salvo indicação em contrário. Todos os camundongos C57BL/6J utilizados foram obtidos do Centro de Animais de Laboratório da Universidade de Wuhan, e todos os experimentos relacionados foram aprovados pelo Comitê de Ética em Experimentos com Animais da Universidade de Wuhan. Todos os esforços foram feitos para minimizar o sofrimento dos camundongos.

1. Enucleação e fixação dos olhos

1. Eutanasiar os camundongos com asfixia por dióxido de carbono e enuclear o globo ocular suavemente usando pinças desdentadas.
2. Enxaguar o globo ocular uma vez em solução salina tamponada com fosfato (PBS).
3. Puncionar o globo ocular com uma agulha de seringa na córnea sob um microscópio (ocular WF: 10x/22; objetiva de aumento contínuo: 0,67x-4,5x) para acelerar a fixação no globo ocular e melhorar a eficiência de fixação.
4. Transfira para uma placa de 24 poços contendo paraformaldeído (PFA) a 4%.
5. Fixe o globo ocular em PFA a 4% por 45 min e, em seguida, transfira-o para 1x PBS para remover o excesso de PFA (lave três vezes, 5 min/tempo) imediatamente.

2. Isolamento e achatamento da retina

1. Transferir o globo ocular para uma lâmina de vidro e colocá-lo sob um microscópio dissecante (ocular WF: 10x/22; objetiva de aumento contínuo: 0,67x-4,5x).
2. Segure a pinça em uma das mãos e use-a para prender a margem da córnea para evitar o movimento do globo ocular. Use a outra mão para segurar a tesoura dissecante e corte ao redor da córnea a aproximadamente 1 mm de profundidade através do limbo corneoescleral. Remova a lente e o corpo vítreo.
3. Segure o disco óptico no centro e, com uma tesoura dissecante, corte a retina radialmente ao longo dos quatro quadrantes, atingindo aproximadamente 2/3 do raio da retina.
4. Aperte uma das bordas esclerais usando pinça dentada. Com a outra mão, segure a borda da esclera com pinças não dentadas e mova-se de onde a esclera é fixada pela pinça dentada em direção à base da esclera. Descasque cuidadosamente a retina.
5. Retire o PBS usando uma pipeta (200 μL) para lavar e molhar a retina e, em seguida, remova qualquer excesso de PBS com um pequeno pedaço de papel absorvente. Se necessário, achate suavemente a retina com uma pequena escova de cerdas.
6. Pipetar lentamente metanol frio (pré-resfriado em um freezer de -20°C) gota a gota na superfície interna da retina (o volume de metanol não é fixo, desde que a retina possa ser completamente coberta pelo metanol). A retina fica branca e desenvolve maior tenacidade.
7. Achate suavemente a retina e remova impurezas, como membranas pigmentares residuais e o corpo vítreo, com pequenas escovas de cerdas. Inverta a retina usando pequenas escovas de cerdas e repita o processo mencionado acima.
8. Transfira a retina tratada com metanol para um poço de uma placa de 24 poços e mantenha-a embebida em metanol.
9. Armazene-o a -20°C por 1-2 h para imunomarcação imediata, ou deixe a retina em metanol e armazene-o a -20°C para armazenamento a longo prazo.
10. Retire o metanol da placa de 24 poços e lave a retina com 1x PBS.

3. Coloração por imunofluorescência dos CGRs

1. Transfira cuidadosamente a retina para uma placa de hemaglutinação de 24 poços com uma pipeta plástica de Pasteur e bloqueie em 5% PBS-TX-BSA (5 g de pó de albumina de soro bovino dissolvido em 100 mL de solução de 1x PBST; o PBST é formado pela adição de 10 mL de Triton X-100 a 2.000 mL de 1 x PBS) à temperatura ambiente por 4 h ou durante a noite a 4 °C. Mantenha o gânglio para cima.
2. Remover o PBS-TX-BSA e incubar a retina a 4 °C por 48-96 h, adicionando 100 μL do anticorpo primário selecionado (anticorpo anti-RBPMS da cobaia) usando uma diluição de 1:400.
3. Remova o anticorpo primário e lave a retina três vezes (20 min cada) com 1x PBS, agitando à temperatura ambiente.
4. Incubar a retina com agitação suave durante a noite a 4 °C com 100 μL do anticorpo secundário correspondente (ver Tabela de Materiais), cianina Cy3 affiniPure burro anti-cobaia IgG (H+L), utilizando uma diluição de 1:400.
5. Enxaguar a retina com 1x PBS três vezes (20 min cada).
6. Coloque a retina plana na lâmina com a camada de células ganglionares voltada para cima, solte uma quantidade apropriada de agente de têmpera antifluorescência ao redor da retina com uma pipeta e cubra a lâmina com uma lamínula (cuidado para não ter bolhas).
   NOTA: Para determinar a quantidade apropriada de quencher antifluorescência, certifique-se de que ele cobre toda a retina. Depois disso, cubra a lâmina sem deixar a retina flutuar e se mover facilmente.
7. Sele a corrediça toda ao redor com um agente de vedação para evitar que ela se mova. Conservar as amostras a -20°C e protegê-las da luz.
8. Imagem da retina usando um microscópio de fluorescência/confocal.

Resultados

Após a dissecção, a retina deve parecer um trevo plano de quatro folhas. Neste estudo, utilizando o protocolo descrito acima, a retina ficou branca após a adição de metanol (Figura 1). Enquanto isso, a retina mudou de macia para maleável e plana. Em seguida, os CGRs foram marcados com anti-RBPMS⁸. Quatro campos de imagem foram obtidos na retina de montagem total (n = 3) usando um microscópio confocal (ocular: 10x; objetivo: 40x). Visões representativas dos CG...

Discussão

A fixação é um passo essencial para preservar a retina, o que pode interferir em investigações subsequentes do CGR com base na morfologia. A fixação bem-sucedida captura rapidamente a estrutura e o estado das retinas no momento de expô-las ao meio de fixação, o que é fundamental para uma análise mais aprofundada. Embora o formaldeído tenha sido considerado um dos agentes fixadores mais comuns para fixação e preservação de tecidos e células, o formaldeído isoladamente nem sempre funciona bem como o fixa...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
24-well cell culture cluster	Costar		Eyeball fixation
24-well hemagglutination plate	Labedit Company		Incubation antibody
Adhesion microscope slides	Citotest		Or similar
Anti-fluorescent quenching mountant	Servicebio	G1401	Slow down fluorescence quenching
BSA (bovine serum albumin)	Servicebio	GC305010	Blocking reagent
Confocal microscope	OLYMPUS		Apply 40x objective lens
Curved scissors	Jiangsu Kanghua Medical Equipment Co., Ltd.		Dissecting tools
Dissecting microscope	RWD Life science Co.,LTD	77001S	Dissecting tools
Forceps	Jiangsu Kanghua Medical Equipment Co., Ltd.		Dissecting tools
Methanol	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.	20210624	GC≥99.5%
Nail polish	SecheVite		Sealing agent
Needles	Shanghai Kindly Enterprises Development Group Co., Ltd.		Accelerate the fixation
Paraformaldehyde solution	Servicebio	G1101	Eyeball fixation
PBS (phosphate buffered saline pH 7.4)	Servicebio	G0002	Rinse the eyeball
Primary antibody: guinea pig anti-RNA-binding protein with multiple splicing (RBPMS)	PhosphoSolutions	Cat. #1832-RBPMS	For immunofluorescence. Used at 1:400
Secondary antibody: Cy3 affiniPure donkey anti-guinea pig IgG (H+L)	Jackson ImmunoResearch	706-165-148	For immunofluorescence. Used at 1:400
Straight scissors	Jiangsu Kanghua Medical Equipment Co., Ltd.		Dissecting tools